VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO MULTIRRESÍDUO EM GRÃOS

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1 RESUMO 24ª EXPANDIDO RAIB VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO MULTIRRESÍDUO EM GRÃOS C.H.P. Ciscato, A.J. Stefani*, G.S Souza, C.M. Barbosa, N. Hamada*, D.L. Silva, L.M. Lima*, A.B. Gebara Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Proteção Ambiental, Av. Cons. Rodrigues Alves, 1252, CEP , São Paulo, SP, Brasil. ciscato@biologico.sp.gov.br RESUMO O Laboratório de Resíduos de Pesticidas (LRP), do Instituto Biológico/APTA (Agência Paulista de Tecnologia) realiza monitoramento de agrotóxicos em alimentos. Nesse contexto, essas pesquisas tiveram como objetivo a validação do método multirresíduos DFG S19, atualmente adotado pelo Laboratório, para detecção e quantificação dos agrotóxicos em grãos, utilizando o feijão como matriz representativa do grupo. Os agrotóxicos escolhidos para a validação foram selecionados de acordo com o grupo químico e os limites máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pela legislação brasileira. São eles: acefato, pirimifós metílico, bifentrina, clorotalonil, procimidona e vinclozolina. O delineamento experimental dos parâmetros de validação considerou a norma DOQ-CGCRE-008 do INMETRO, a IN-24/2009 do MAPA, além de outros documentos internacionais. Os resultados obtidos demonstraram que o método é apropriado para a avaliação de resíduos dos compostos selecionados na matriz, com coeficiente de variação e recuperação dentro do intervalo aceitável (30 a 40 % e 70 a 120 %, respectivamente). PALAVRAS-CHAVE: Validação de método analítico, multirresíduos, agrotóxico. ABSTRACT ANALYTICAL VALIDATION OF THE MULTIRESIDUE METHOD IN GRAINS. The Pesticide Residues Laboratory LRP from Biological Institute/APTA (São Paulo State Technological Agency) monitor the pesticides in the food. In such way, this study has as an objective the validation of the multiresidue method DFG S19, actually employed in the LRP for detection and quantification of pesticide residues in grains, for the study was chosen the bean as the representative matrix. The pesticides were selected according to their chemical group and the Maximum Residue Levels (MRL) established by the national legislation: acephate, bifenthrin, chlorothalonil, procymidone, pyrimiphos-methyl and vinclozolin. The experimental delineation was prepared according to the normative DOQ-CGCRE-008 from INMETRO, the IN-24/2009 from MAPA and some international documents. The results demonstrated that the method is validated to evaluate the pesticide residues of such compounds in bean matrix, the variation coefficient and recovery were in the acceptable range (30 to 40% and 70 to 120%, respectively). KEY WORDS: Analytical method validation, multiresidue, pesticide INTRODUÇÃO A análise de resíduos de agrotóxicos é uma ferramenta importante para a Segurança Alimentar. Métodos analíticos cada vez mais eficientes vêm sendo desenvolvidos e utilizados para determinação da presença dessas substâncias nos alimentos. Neste contexto, o Laboratório de Resíduos de Pesticidas (LRP) do Instituto Biológico, que atua na área desde a década de 70, implantou o método multirresíduos DFG S19 (DFG Method S19, 1999), método oficial e normalizado, que possibilita a determinação de diferentes grupos de agrotóxicos em diferentes tipos de alimentos. Desde então, o LRP realiza o monitoramento dessas substâncias em alimentos, tendo a capacidade de detectar a presença de 150 ingredientes ativos em matrizes de origem animal e vegetal. Com as mudanças tecnológicas e analíticas torna-se ainda mais importante a confiabilidade dos resultados analíticos gerados e, dessa forma, o LRP implantou um sistema de qualidade, conforme norma NBR ISO/IEC 17025, e vem utilizando os critérios de validação para obtenção de resultados com a qualidade exigida. Para tanto, estudos de vali- 2 Bolsista CNPq/FINEP.

2 342 24ª RAIB dação do método analítico, atividades de proficiência interlaboratorial e análise da incerteza dos resultados gerados devem ser realizados para confirmar a adequação do método ao uso pretendido. O objetivo deste trabalho foi validar no LRP, o método multirresíduos DFG-S19 utilizando-o para a determinação de resíduo de agrotóxicos em grãos. MATERIAL E MÉTODO De acordo com as normativas, foram seguidas recomendações propostas pelo DOQ-CGCRE revisão 02 do INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial), IN24/2009 da Secretaria de Defesa Agropecuária do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, em seu anexo II, que define requisitos e critérios de validação de métodos analíticos e controle de qualidade interna das análises de monitoramento do Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes PNCRC; e outros documentos internacionais (Sanco, 2009; AOAC/IUPAC, 1999; Danzer; Currie, 1998; Thompson et al., 1999; Thompson et al., 2002). Matriz e analitos Utilizou-se feijão como representante do grupo de grãos, visto sua importância na dieta do brasileiro (IBGE, 2004). Os analitos ou ingredientes ativos avaliados neste estudo de validação foram escolhidos de acordo com a recomendação de uso agronômico no cultivo de feijão, e por apresentarem limite máximo de resíduo (LMR) estabelecido pela legislação brasileira (AN- VISA, 2011). Os agrotóxicos foram distribuídos de acordo com os seguintes grupos químicos: inseticidas organofosforados (acefato e pirimifós metílico), inseticidas piretroides (bifentrina), fungicidas diclorofenílicos (clorotalonil) e dicloroanilina (procimidona e vinclozolina). Método analítico Foi seguido o método multirresíduos DFG-S19. Na etapa de preparo, as amostras foram processadas e uma alíquota de 20 gramas foi retirada para análise. Uma mistura de solvente orgânico foi utilizada para a etapa de extração e a purificação foi realizada por meio de técnica de cromatografia de permeação a gel (GPC). Uma parte do extrato foi redissolvido em acetona e encaminhado para análise por cromatografia gasosa com detetor fotométrico de chama (FPD). O restante foi novamente purificado utilizando mini-coluna de sílica gel desativada a 1,5 % para as análises com detetores de nitrogênio/fósforo (NPD) e captura de elétrons (ECD). Validação Seletividade: O primeiro parâmetro avaliado foi a seletividade. Para isso, o branco de reagente e o branco da amostra foram analisados para verificar a presença de interferentes na região de interesse e a separação adequada dos analitos estudados. Curva de calibração Foram preparadas soluções de agrotóxicos em diferentes concentrações, a partir dos padrões puros, para a construção da curva de calibração. Os pontos da curva foram escolhidos de acordo com as respostas dos analitos, dos valores correspondentes ao LMR, dos limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ). Tais concentrações correspondem à faixa de trabalho do método analítico. Durante todo o processo de elaboração desses resultados, injeções em triplicatas foram realizadas para satisfazer o modelo estatístico (INMETRO, 2010; Sanco, 2009; AOAC/IUPAC, 1999; Danzer; Currie, 1998; Thompson et al., 1999; Thompson et al., 2002). A curva de calibração foi construída em Excel, utilizando-se equação de regressão da reta, coeficiente de correlação (R 2 ), desvios-padrões (S), médias e valores de Student (tabelado) com intervalo de confiança de 95 % (Morin, 1984). Para a construção da curva de calibração foram preparadas 10 soluções de diferentes concentrações englobando o LMR, valores abaixo e acima do LMR. Destes pontos um total de pelo menos 7 foram utilizados para compor a curva. As injeções foram feitas em triplicatas, a média e o desvio-padrão das injeções foram calculados. É importante salientar que desvios superiores a 5% entre as injeções foram descartados e novas soluções e injeções foram realizadas, assim como uma verificação do equipamento. Equação da regressão linear: Y = ax + b Limite de detecção O limite de detecção corresponde a um valor teórico 3 vezes superior ao ruído do equipamento. Na avaliação de métodos analíticos, esse limite corresponde a menor concentração de um analito em uma amostra fortificada que pode ser detectada (análise qualitativa). LD = valor obtido na curva de calibração + 3xS Limite de quantificação O limite de quantificação teoricamente corresponde a um valor 5 x o ruído do equipamento e para o estudo foi escolhido o menor valor de concentração utilizado na fortificação de uma amostra que pode

3 24ª RAIB 343 ser quantificado com valores de recuperação dentro da faixa estabelecida na Tabela 1. LQ = valor obtido na curva de calibração + 5xS Efeito matriz Corresponde a um efeito de acréscimo ou diminuição da concentração de um analito em uma amostra fortificada e está relacionado ao tipo de amostra e aos processos de purificação utilizados durante o estudo. O efeito matriz ocorre durante a análise cromatográfica. Para verificar a presença deste efeito compararam-se os valores das concentrações dos padrões analíticos preparados em solvente, com aqueles dos pesticidas diluídos em matriz (usou-se a quantidade em g de amostra que chega para a análise quantitativa e qualitativa após as etapas de extração e purificação), e para o estudo comparativo utilizou-se o teste t. A amostra representativa escolhida, devido ao teor de gordura existente, teve o efeito matriz calculado para o FPD, equipamento onde a amostra foi avaliada após a etapa de purificação com o GPC. Teste t comparação de médias t calculado = X 1 X 2 ν S 2 (1/n 1 + 1/n 2 ) onde: S = (n 1-1)S 1 + (n 2-1)S 2 (n 1 +n 2 2) t tabelado = (n 1 +n 2 2) consultar a tabela de distribuição de Student para este intervalo com α = 0,05 Se o t calculado < t não houve efeito matriz tabelado X 1 = média da concentração do analito na amostra X 2 = média da concentração do analito no solvente S 1 = desvio-padrão da concentração do analito na amostra S 2 = desvio-padrão da concentração do analito no solvente ν = diferença dos desvios n = número de concentrações de padrão diluído em solvente e em amostra Coeficiente de variação CV = S/X x 100 S = desvio-padrão X= média das recuperações. Recuperação Após a obtenção dos dados estatísticos da seletividade, da curva de calibração, do efeito matriz, da linearidade, do LD e do LQ, foram iniciados os estudos de recuperação. Para os estudos de recuperação foram escolhidos 6 níveis de concentração (LMR, ½ LMR, 2x LMR, LQ e 5 ou 10x LMR): 0,05 mg/kg, 0,10 mg/kg, 0,25 mg/ kg, 0,50 mg/kg, 0,75 mg/kg e 1,00 mg/kg. Para cada ponto foram feitas 5 repetições, e os valores obtidos foram utilizados para calcular a repetitividade do método. Para a reprodutibilidade foram usados os mesmos números de pontos e repetições. Os testes foram realizados por 2 analistas experientes e familiarizados com o método. As análises foram feitas em dias diferentes e as 5 repetições por ponto foram injetadas em triplicatas nos cromatógrafos. Os resultados dos estudos de recuperação caracterizam os critérios de exatidão e de precisão. Desempenho do método Os pesticidas que podem ser analisados em mais de um equipamento tiveram os resultados comparados para obtenção do critério de desempenho do método. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos foram comparados aos critérios intra-laboratoriais, (Tabela 1) para a validação de métodos analíticos em análises de resíduos de pesticidas. Para todos os compostos avaliados, os resultados das curvas de calibração de cada pesticida em solvente e em extrato de matriz estão apresentados. Pode-se observar uma diferença entre os valores encontrados para o pesticida/solvente em comparação ao pesticida/extrato de matriz. Porém, tais diferenças não indicaram presença de efeito matriz quando calculado com o estudo da comparação de médias (teste t Student). Todos os t calculados foram inferiores aos t tabelados. As curvas de calibração foram utilizadas para a verificação da resposta dos equipamentos durante o teste de validação. Observou-se que os desvios das injeções durante o período do estudo foram inferiores a 5% possibilitando afirmar a linearidade da resposta nos níveis estudados. Os limites de detecção e de quantificação foram calculados baseados nas curvas de calibração e, a partir desses valores, escolheu-se o menor nível de fortificação (0,05 mg/kg). Quanto ao estudo do efeito matriz realizado para o método empregado no laboratório, é importante comentar que, graças às etapas de purificação, tal efeito não foi observado. O efeito matriz foi avaliado a partir das médias das diferentes concentrações dos analitos preparados em solvente (isooctano) e em matriz (extrato de feijão), os valores obtidos foram comparados e as diferenças calculadas. A partir das médias e dos desvios-padrões das diferenças o valor obtido foi comparado ao valor de t student para o intervalo de confiança de 95%.

4 344 24ª RAIB A maioria dos resultados no estudo de recuperação foi adequada, quando comparada com o intervalo de 60 a 120%, e tais valores são convencionados para ensaios multirresíduos de acordo com os níveis estudados (Tabelas 1 e 2). Observou-se que o acefato e o clorotalonil, por serem produtos de difícil análise, como demonstra a literatura (DFG Method S19, 1999), tiveram os valores de recuperação abaixo do intervalo de 60 a 120%. Thompson et al. (1999) e Thompson et al. (2002) sugeriram que para amostras de rotina é conveniente que, para expressar o resultado corretamente, as mesmas sejam repetidas e avaliadas com os estudos de recuperação realizados simultaneamente nos intervalos do limite de quantificação e no LMR. Todos os pesticidas analisados estiveram dentro da faixa de trabalho para o intervalo de recuperação, repetitividade e reprodutibilidade. A repetitividade e a reprodutibilidade foram obtidas a partir dos resultados dos analistas. Tais critérios encontraram-se dentro do intervalo esperado. Porém, alguns pontos, principalmente para o analista 2, não foram adequados. Para explicar se essa variação compromete a análise, foi aplicado o teste de homocedasticidade (ANOVA). O resultado deste teste verificou que os valores encontrados nos estudos de recuperação quando comparados entre si podem ser utilizados rotineiramente. É importante salientar que, apesar dos analistas estarem familiarizados com o método, foi possível observar que o analista 2 necessitava de novo treinamento. Para isso, ações corretivas foram abertas para sanar o problema. O estudo de desempenho do método foi obtido a partir da avaliação dos resultados das recuperações em diferentes sistemas de detecção (FPD versus NPD). Neste estudo o pirimifós metílico injetado nos diferentes equipamentos teve os resultados comparados, comprovando que ambos os equipamentos estão aptos a serem utilizados na avaliação desse pesticida em amostra de grãos, os resultados estão apresentados na Tabela 4. Tabela 1 - Critérios intra-laboratoriais para a validação de metodologias em análise de multirresíduos. Repetitividade Reprodutibilidade Exatidão e tendência Concentração Intervalo médio % de CV A %* CV L %** CV A %* CV L %** recuperação 1 µg/kg >1µg/kg 0,01 mg/kg >0,01 mg/kg 0,1 mg/kg >0,1 mg/kg 1 mg/kg >1 mg/kg Fonte: Joint AOAC/FAO/IAEA/IUPAC Expert consultation, 1999 *coeficiente de variação excluindo o processamento da amostra. Para isto, fortifica-se a amostra no momento da extração **coeficiente de variação do resultado do laboratório permitindo 10% de variabilidade do processamento da amostra. Tabela 2 - Avaliação dos critérios por equipamento (curva de calibração, coeficiente de correlação, LD e LQ). Pesticida Equipamento Equação de regressão Coeficiente de correlação R 2 LD LQ Acefato FPD Y = ,56x 67171,97 0,917 0,646 1,16 Acefato * FPD Y = ,92x ,45 0,999 0,013 0,03 Pirimifos FPD Y = ,47x 1149,38 0,999 0,027 0,05 Pirimifós * FPD Y = ,06x 20809,35 0,991 0,092 0,18 Acefato NPD Y = 965,17x 826,72 0,975 0,412 0,79 Acefato * NPD Y = 1878,64x + 356,95 0,991 0,152 0,30 Pirimifós NPD Y = 2892,48x + 37,70 0,998 0,018 0,03 Pirimifós * NPD Y = 2569,58x + 157,08 0,999 0,056 0,11 Bifentrina ECD Y = 12112,43x ,26 0,968 0,06 0,12 Bifentrina * ECD Y = ,3x 3954,8 0,984 0,07 0,13 Clorotalonil ECD Y = ,35x 1372,11 0,999 0,003 0,006 Clorotalonil * ECD Y = ,77x 9694,98 0,998 0,015 0,03 Procimidona ECD Y = ,0x ,43 0,981 0,015 0,03 Procimidona * ECD Y = 99720,62x 3158,93 0,983 0,094 0,18 Vinclozolina ECD Y= ,82x ,49 0,973 0,054 0,10 Vinclozolina * ECD Y = ,22x ,22 0,999 0,008 0,01 *Matriz feijão (padrão diluído extrato de feijão).

5 24ª RAIB 345 Tabela 3 - Estudos de recuperação para 5 diferentes níveis de concentração, equipamentos FPD/NPD/ECD. Fortificação nível em mg/kg 0,05 0,10 0,25 0,50 0,75 1,0 Pesticida/equipamento X S CV X S CV X S CV X S CV X S CV X S CV Acefato/FPD 29,7 2,4 8,2 29,5 10,3 34,9 27,8 4,2 15,2 34,9 8,2 23,5 37,8 2,5 6,8 Pirimifós metílico/fpd 98,2 4,6 4,7 95,4 20,9 21,9 109,3 24,1 22,0 128,6 18,3 14,2 128,4 1,8 1,4 Pirimifós metílico/npd 63,2 14,4 22,8 62,8 12,9 20,7 68,2 6,2 9,0 63,1 14,7 23,2 56,3 6,9 12,4 65,6 6,0 9,0 Bifentrina/ECD 114,8 15,6 13,6 122,6 36,8 29,9 82,1 9,9 12,0 72,1 17,6 24,4 88,3 18,4 20,8 80,1 8,8 10,9 Clorotalonil/ECD 19,9 4,3 21,6 21,6 7,5 34,9 22,2 3,3 14,8 26,3 9,1 34,6 49,3 8,2 16,7 6,6 10,5 17,0 Procimidona/ECD 171,8 15,7 9,1 93,7 10,5 11,2 58,3 31,9 54,8 54,3 25,2 46,4 54,4 26,3 48,4 80,5 4,4 5,4 Vinclozolina/ECD 118,0 11,5 9,7 120,6 39,2 32,5 75,8 6,0 7,9 67,0 14,2 21,2 78,5 10,9 13,9 77,9 4,2 5,4 X = média das recuperações em % S = desvio-padrão CV = coeficiente de variação. CONCLUSÃO O estudo do método multirresíduos DFGS19 apresentou resultados satisfatórios quanto aos parâmetros estabelecidos para validação de métodos de análise, podendo ser utilizado em análise de rotina para a determinação de diferentes pesticidas pertencentes aos grupos químicos estudados e em matrizes de grãos. Nas análises de monitoramento o desempenho deve ser continuamente avaliado, para assegurar a robustez do método. REFERÊNCIAS ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas) NBR ISO/IEC 17025:2005 Requisitos Gerais para a competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração p. ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) - Monografia de agrotóxicos. Disponível em: VISA/home/agrotoxicotoxicologia. Acesso em: 10 ago AOAC/FAO/IAEA/IUPAC Expert consultation Report on single laboratory validation of analytical methods for trace-level concentration of organic chemical p. DANZER, K.; CURRIE, L.A. Guidelines for calibration in analytical chemistry. Pure and Applied Chemistry, v.70, n.4, p , DFG METHOD S19 - Modular Multiple Revised Version of the DFG METHOD S19. Modular multiple analytical method for the determination of pesticide residues in foodstuffs. Collection of Official Methods under article 35 of the German Federal Food Act as method L (1999). Disponível em:< bgv2zww9dhbslxn1y2hlcmdlym5pcyzsa- W1pdGF0aW9udHlwZT0mc2VhcmNoYWNjZX Nza2V5PUNPTlRFTlQmcGFnZWlkPTY*.html>. Acesso em: 10 ago Tabela 4 - Estudos de desempenho do método, para o pesticida pirimifós metílico em 2 sistemas de detecção FPDxNPD. Concentração em mg/kg Média dos Diferença dos Desvio Coeficiente de resultados em % resultados em % padrão em % variação em % FPD NPD 0,05 76,3 63,2 13,1 9,2 13,3 0,10 98,2 62,7 35,5 25,1 31,2 0,25 95,4 68,2 27,2 19,2 23,5 0,50 109,3 63,2 46,2 32,6 32,7 0,75 121,1 56,3 64,8 45,8 51,6 1,0 118,3 65,6 52,8 37,3 40,6

6 346 24ª RAIB IBGE - Ministério do Planejamento e Gestão (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) Pesquisa de Orçamentos Familiares Aquisição Alimentar Domiciliar per capita!, Brasil e Grandes Regiões, RJ, INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia), DOQ CGCRE-08 Orientação sobre validação de métodos analíticos, 2010, 20p. Disponível em: < inmetro.gov.br>. Acesso em: 10 ago, MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Instrução Normativa n 24 de 14 de julho de Disponível em: < gov.br>. Acesso em: 10 ago MORIN, G. (Ed.). Biostatistique. Canada: Gaëtan Morin Éditeur, p. SANCO 10684/2009 Method validation and quality control procedures for pesticide residues analysis in food and feed. 30p., Disponível em: <http//ec.europa.eu/food/plant/pretection/ resources/qualcontrol_en.pdf>. Acesso em: 10 ago THOMPSON, M.; ELLISON, S.L.R. FAJGELJ, A.; WIL- LETTS, P.; WOOD, R. Harmonised, guidelines for the use of recovery information in analytical measurement. Pure and Applied Chemistry, v.71, n.2, p , THOMPSON, M.; ELLISON, S.L.R. and WOOD, R. Harmonised, guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis. Pure and Applied Chemistry, v.74, n.5, p , 2002.