FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA MESTRADO ACADÊMICO SAÚDE E ENVELHECIMENTO ANGÉLICA DE SOUZA BATISTA MAIA ALVES

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1 FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA MESTRADO ACADÊMICO SAÚDE E ENVELHECIMENTO ANGÉLICA DE SOUZA BATISTA MAIA ALVES ALTERAÇÕES CITOGENÉTICAS DE PACIENTES COM DOENÇAS ONCO-HEMATOLÓGICAS E SUA RELAÇÃO COM O ENVELHECIMENTO MARÍLIA 2017

2 Angélica De Souza Batista Maia Alves Alterações citogenéticas de pacientes com doenças onco-hematológicas e sua relação com o envelhecimento Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento, da Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Saúde e envelhecimento. Orientador: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão. Marília 2017

3 Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte. Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília A474a Alves, Angélica de Souza Batista Maia. Alterações citogenéticas de pacientes com doenças onco-hematológicas e sua relação com o envelhecimento / Angélica de Souza Batista Maia Alves. - - Marília, f. Orientador: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília. 1. Aberrações cromossômicas. 2. Neoplasias hematológicas. 3 Envelhecimento.

4 Angélica de Souza Batista Maia Alves Alterações citogenéticas de pacientes com doenças onco-hematológicas e sua relação com o envelhecimento Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento, da Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Saúde e envelhecimento. Banca examinadora: Prof. Dr. Spencer Luiz Marques Payão Faculdade de Medicina de Marília Profª Drª Edislane Barreiros de Souza Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Assis Prof. Dr. Milton Artur Ruiz Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho /Ibilce, S J do Rio Preto Data da aprovação:

5 A todos os pacientes portadores de neoplasias hematológicas.

6 AGRADECIMENTOS A meu orientador, Prof. Dr. Spencer, pela transmissão de saberes e ensinamentos, pela didática e paciência durante a elaboração do estudo, equilíbrio e flexibilidade na ocasião da mudança de projetos e por todas as oportunidades dentro do laboratório de genética e na pós-graduação. À Rosimeire Segato, por sua atenção, colaboração e empenho em me auxiliar com a busca de dados para o projeto e correção das planilhas; por seu profissionalismo e cuidado no ensino dos procedimentos e técnicas de citogenética clássica. À professora Lucieni, pela interpretação dos resultados e análise estatística, contribuindo com a elaboração e com o delineamento da pesquisa. À minha família, pelo apoio constante a meus projetos e escolhas, por me manter em Marília e pelo incentivo para continuar com os estudos de pós-graduação lato e stricto sensu. A meu esposo, pela dedicação, ensinamentos e companheirismo em todos os momentos, sobretudo nos momentos de trabalho e de estudo, com compreensão e paciência. A toda a equipe do Laboratório de Genética do Hemocentro-FAMEMA, pela troca de experiências profissionais e aprendizagem de processos técnicos de cultivo celular, análises citogenéticas e, ainda, pela cooperação em procedimentos burocráticos. A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pelo incentivo e apoio financeiro, pela concessão da bolsa de estudos durante a realização da pesquisa.

7 Ele fez tudo bonito em seu tempo. Ele também estabeleceu a eternidade no coração humano. Mas ninguém pode compreender o que Deus tem feito do princípio ao fim. (Eclesiastes 3:11)

8 RESUMO Introdução: As neoplasias hematológicas estão associadas a mutações que bloqueiam a maturação das células progenitoras e a anormalidades cromossômicas. O envelhecimento está associado à perda da capacidade de substituição das células sanguíneas, favorecendo a evolução dessas malignidades. Objetivo: Associar a presença de alterações cromossômicas, em células de material oncológico de sangue periférico (Oncology Blood-OB) e de medula óssea (Bone Marrow-BM) de pacientes com diferentes neoplasias hematológicas, ao processo de envelhecimento. Material e métodos: Estudo transversal retrospectivo com revisão de resultados de exames de cariótipos analisados pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro-FAMEMA de março de 1998 a março de Os resultados dos cariótipos pertencem a pacientes com neoplasias hematológicas atendidos pelos Ambulatórios de Onco-hematologia adulto e de Onco-hematologia infantil do Hemocentro da FAMEMA, hospitais e clínicas externas. Resultados: Foram consultados resultados de 1173 exames de cariótipos, provenientes de 746 pacientes com média de idade de 54,7 anos, sendo 50,8% pacientes do gênero feminino. Entre todas as faixas etárias analisadas, foi observada uma frequência maior de neoplasias hematológicas entre os idosos (50,9%). A leucemia linfoide aguda foi mais frequente entre os jovens (81,1%), enquanto as neoplasias e síndromes mielodisplásicas e as neoplasias linfoproliferativas de células B maduras foram predominantes nos idosos: 70,9%, 81,4% e 66,7%, respectivamente. A maioria das neoplasias hematológicas do nosso estudo apresentou exame de cariótipo normal (46,XX/ 46,XY), com exceção das neoplasias mieloproliferativas com 67,4% dos cariótipos alterados (alterações cromossômicas numéricas e/ ou estruturais). Conclusão: Nossos resultados destacam a importância do conhecimento epidemiológico e do monitoramento citogenético das neoplasias hematológicas como fator determinante na compreensão dos mecanismos fisiopatológicos dessas neoplasias e confirmam o aumento dessas malignidades entre os idosos. Palavras-chave: Aberrações cromossômicas. Neoplasias hematológicas. Envelhecimento.

9 ABSTRACT Introduction: Hematologic neoplasms are associated with mutations blocking the maturation of progenitor cells and chromosomal abnormalities. Aging is associated to loss of replacement capacity of blood cells, favoring the evolution of these malignancies. Objective: To associate the presence of chromosomal alterations in peripheral blood cells (Oncology Blood-OB) and Bone Marrow (BM) of patients with different hematological malignancies with the aging process. Material and methods: A retrospective cross-sectional study with a review of karyotype exams results analyzed by Cytogenetics Service of FAMEMA Blood Center since March 1998 to March The results of the karyotypes are from patients with haematological malignancies enrolled by Outpatient adult Oncohematology and children Oncohematology of FAMEMA Blood Center, hospitals and external clinics. Results: Results of 1173 karyotype exams were consulted, obtained from 746 patients with a mean age of 54.7 years, 50.8% were female patients. Of all age groups analyzed, a greater frequency of hematological neoplasias was observed among the elderly (50.9%). Acute lymphoblastic leukemia was more frequent among the young (81.1%), while neoplasms and myelodysplastic syndromes and mature B-cell lymphoproliferative neoplasms were predominant in the elderly: 70.9%, 81.4%, and 66.7%, respectively. Major of the haematological neoplasms of our study presented normal karyotype (46,XX/ 46,XY), except myeloproliferative neoplasms with 67.4% of abnormal karyotypes (numerical and/ or structural chromosome alterations). Conclusion: Our results highlight the importance of epidemiological knowledge and cytogenetic monitoring of hematologic malignancies as a determinant factor for understanding the pathophysiological mechanisms of these neoplasms and confirm the increase of these malignancies among the elderly. Key-words: Chromosome aberrations. Hematologic neoplasms. Aging.

10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Fluxograma 1 - Distribuição dos exames de cariótipo e do número de pacientes com neoplasias hematológicas analisados no período Gráfico 1 - Número e frequência de exames de cariótipo realizados pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro da FAMEMA entre os anos Gráfico 2 - Número de pacientes com neoplasias hematológicas encaminhados para análise citogenética entre os anos de 1998 e

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Características dos exames de cariótipo de pacientes com neoplasias hematológicas atendidos pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro da FAMEMA, no período Tabela 2 - Características demográficas e hipótese diagnóstica dos pacientes com neoplasias hematológicas, no tempo Tabela 3 - Distribuição das variáveis demográficas e da classificação do exame de cariótipo dos pacientes com neoplasias hematológicas (HD) avaliadas pelo Serviço de Citogenética de Tabela 4 - Distribuição das alterações citogenéticas mais frequentemente encontradas nas neoplasias hematológicas (HD) do estudo, entre

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS - Perda cromossômica + Ganho cromossômico 46,XX 46,XY ABL AF AGT BCL2 BCR BCR-ABL1 BM CAAE CAPES Células B Células NK CEP CGH CIQ CO 2 del DLPC DLP-ID DM DMPC DN DNA Cariótipo normal feminino Cariótipo normal masculino Proto-oncogene da proteína tirosino quinase, associado à LMC Anemia de Fanconi Association of Genetic Technologists Oncogene do linfoma de células B 2, associado à LLC Gene de região com ponto de quebra cromossômica Gene de fusão híbrido na LMC Bone Marrow-Medula óssea Certificado de Apresentação para Apreciação Ética Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Linfócitos B Células natural killers Comitê de Ética em Pesquisa Hibridação Genômica Comparativa Controle Interno de Qualidade Gás carbônico Deleção cromossômica Doença Linfoproliferativa Crônica Doenças linfoproliferativas associadas à imunodeficiência Doença Mieloproliferativa Doença Mieloproliferativa Crônica Data de Nascimento Ácido Desoxirribonucleico

13 DP DPL FAMEMA FISH H HC HD HMRN HRS IBGE Inv IRF4 ISCN ISO KCl LA LH LLA LLC LMA LMC LMC juvenil LMMC LNC LNH M ml MLL-AF4 MM mm 3 Desvio-padrão Doença Linfoproliferativa Faculdade de Medicina de Marília Hibridização Fluorescente in situ Horas (cultivo celular) Hospital das Clínicas Hipótese Diagnóstica Haematological Malignancy Research Network Células Reed- Sternberg Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Inversão Cromossômica Gene do fator de regulação interferon 4, associado ao envelhecimento. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature International Organization for Standardization Cloreto de potássio Leucemia Aguda Linfoma de Hodgkin Leucemia Linfoide Aguda Leucemia Linfoide Crônica Leucemia Mieloide Aguda Leucemia Mieloide Crônica Leucemia Mielomonocítica Juvenil Leucemia Mielomonocítica Crônica Leucemia Neutrofílica Crônica Linfoma Não-Hodgkin Molar Mililitros Gene híbrido de fusão na LLA Mieloma Múltiplo Milímetros cúbicos

14 N Número amostral nº Número OB Oncology Blood-Material oncológico ºC Grau Celsius OMS Organização Mundial de Saúde p Braço curto do cromossomo p Nível de significância PCR Reação em Cadeia da Polimerase Ph Cromossomo Philadelphia PNCQ Programa Nacional de Controle da Qualidade PTMO PV q rpm RPMI RT-PCR SD SM SMD SPSS t TE TEL-AMLI TMD Ul/mL Pós-transplante de Medula Óssea Policetemia Vera Braço longo do cromossomo Rotações por minuto Meio de cultura celular, criado pelo Roswell Park Memorial Institute Reação em cadeia da polimerase em tempo real Síndrome de Down Síndrome Mieloproliferativa Síndromes Mielodisplásicas Statistical Package for Social Science Translocação Cromossômica Trombocitemia Essencial Gene híbrido de fusão na LLA Desordem Mieloproliferativa Transiente Microlitros por mililitros

15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Conceitos: câncer e neoplasias hematológicas Caracterização fisiopatológica das neoplasias hematológicas A importância da citogenética no diagnóstico e no prognóstico das malignidades hematológicas Envelhecimento, alterações citogenéticas e neoplasias hematológicas OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Material Métodos Desenho do estudo Critérios de exclusão Critérios de inclusão População do estudo Variáveis demográficas, clínicas e citogenéticas Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Frequência de exames de cariótipo e pacientes no estudo Caracterização dos exames de cariótipo Frequência de pacientes com neoplasias hematológicas Perfil demográfico e das hipóteses diagnósticas dos pacientes Distribuição das variáveis demográficas e classificação dos

16 exames de cariótipo do estudo Alterações citogenéticas mais frequentemente encontradas nas neoplasias hematológicas do estudo CONCLUSÕES REFERÊNCIAS APÊNDICE A - Processamento de cultura de material oncológico de sangue periférico e de medula óssea para análise citogenética APÊNDICE B - Classificação das hipóteses diagnósticas (HD) APÊNCIDE C Alterações citogenéticas frequentes nas neoplasias hematológicas em estudo APÊNCIDE D Artigo científico ANEXO A - Protocolo de Aprovação pelo CEP-FAMEMA ANEXO B - Formulário de requisição médica ANEXO C - Laudo citogenético ANEXO D Comprovante de submissão do artigo científico... 88

17 DNA. (3) Neoplasia, segundo o oncologista britânico R. A. Willis, é uma massa anormal 15 1 INTRODUÇÃO 1.1 Conceitos: câncer e neoplasias hematológicas O câncer é uma doença caracterizada pelo acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas sucessivas resultante em um crescimento celular desordenado. (1) A instabilidade do DNA (Ácido Desoxirribonucleico) é uma das características mais importantes das células tumorais e frequentemente está associada a danos no DNA, a defeitos nos mecanismos de reparo a esses danos e a falhas durante o ciclo celular, que permitem a transferência dessas mutações para as células-filhas. (2) A integridade do DNA pode ser alterada por uma série de agentes citotóxicos ambientais, químicos ou biológicos. Agentes endógenos, como a predisposição genética hereditária, erros durante a replicação celular e a produção de espécies reativas do oxigênio também podem influenciar a arquitetura e a uniformidade do de tecido com crescimento descoordenado e excedente ao tecido normal e que persiste no mesmo modo excessivo após a interrupção do estímulo inicial. (4) A Organização Mundial de Saúde (OMS) classifica as neoplasias em 4 grupos distintos: neoplasias benignas, neoplasias in situ, neoplasias malignas e neoplasias de comportamento incerto e desconhecido. As leucemias, os linfomas e os cânceres com origem hematológica são considerados neoplasias malignas. (5) O potencial invasivo é o fator mais importante na distinção entre neoplasias benignas ou malignas. Nas neoplasias benignas, o tumor é localizado e não tem capacidade de se disseminar para tecidos adjacentes. Nas neoplasias malignas, conhecidas como cânceres, a lesão consegue aderir a qualquer região e se espalhar para sítios distantes da origem (metástase). (6,7) Conforme as neoplasias se desenvolvem de forma mais invasiva e metastática, os genomas tornam-se mais complexos e instáveis. Encurtamento dos telômeros, duplicação de centrômeros e quebras na dupla hélice podem tornar os cariótipos mais complexos. (8) Essa complexidade da organização genômica durante o desenvolvimento do câncer pode dificultar o diagnóstico e a identificação de mutações iniciais. (8)

18 16 Alterações cromossômicas importantes podem ser identificadas por técnicas citogenéticas, como bandamento cromossômico (bandamento G): FISH (Hibridização fluorescente in situ), CGH (Hibridização Genômica Comparativa) ou pelo uso de tecnologias mais recentes, como Microarray, Next Generation e PCR (Reação em cadeia da polimerase) real time. (9-12) Alguns estudos epidemiológicos destacam a idade avançada como principal fator de risco para progressão do câncer. (13) Na população idosa, as neoplasias hematológicas apresentam-se mais agressivas, o sistema imune está debilitado e a medula óssea comprometida. (14) Conforme as células envelhecem, aumentam as taxas de mutações e há acúmulo de substâncias com potencial mutagênico no organismo, fatos que podem predispor ao aparecimento de células cancerígenas. (15) Estudos na área da oncogeriatria hematológica são escassos na literatura. São necessários mais estudos, sob novos ângulos e com direcionamento para essa faixa etária. 1.2 Caracterização fisiopatológica das neoplasias hematológicas As neoplasias de origem hematológica estão frequentemente associadas a mutações que bloqueiam a maturação das células progenitoras. (16) De acordo com modelo proposto em 1940, os cânceres, sobretudo, as malignidades hematológicas, apresentam muitas semelhanças com a organização hierárquica durante a hematopoiese. (17) Uma série de mutações e de divisões assimétricas ocorre nas linhagens imaturas das células-tronco hematopoiéticas e em seus progenitores primários. (18) Os Linfomas são cânceres hematológicos que se desenvolvem no sistema linfático devido a mudanças e acúmulo de linfócitos nos linfonodos e outros órgãos. São divididos em Linfoma de Hodgkin (LH) e Linfoma Não-Hodgkin (LNH). Os Linfomas Não-Hodgkin são neoplasias de células B e T. Os Linfomas de Hodgkin são neoplasias caracterizadas pela presença de células Reed-Sternberg (HRS) derivadas de linhagens de células B. (19,20) O Mieloma Múltiplo (MM) é outra neoplasia com envolvimento de linhagens de células B, os plasmócitos, marcada pela presença de disfunções renais, anemias, hipercalcemia e destruição esquelética. (21)

19 17 As síndromes mielodisplásicas (SMDs) compõem um grupo heterogêneo de doenças onco-hematológicas, caracterizadas por hematopoese ineficaz, pelo aumento de citopenias no sangue periférico e que podem evoluir para leucemia mieloide aguda (LMA). (22) As Leucemias são classificadas com base na morfologia celular (mieloide ou linfoide) e segundo o grau de diferenciação celular em aguda (evolução clínica agressiva e proliferação de células imaturas, como os blastos) ou crônica (progressão lenta e aumento de células maduras, como os granulócitos). (23) Existem 4 tipos principais de leucemias: leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC) e leucemia mieloide crônica (LMC). (24,25) O diagnóstico citogenético das leucemias e dos linfomas é tecnicamente mais simples do que o exame de tumores sólidos. Limitações durante o preparo de material de biópsias e espécimes cirúrgicas, em tumores sólidos, dificultam a qualidade das células em metáfase para análise cromossômica. (26) As neoplasias hematológicas, no entanto, podem ser detectadas mais precocemente, apresentando um papel fundamental na redução da mortalidade e da morbidade durante o tratamento. (27) Terapias celulares, como o transplante de medula óssea e de células-tronco hematopoéticas ou do cordão umbilical, vêm apresentando bons resultados no tratamento de pacientes com malignidades hematológicas. (28,29) O estudo do comportamento citogenético e morfológico de células tumorais pode contribuir com novas formas de tratamentos e terapias futuras na área da oncologia e da hematologia. 1.3 A importância da citogenética no diagnóstico e no prognóstico das malignidades hematológicas Em 1960, Peter Nowell e David Hungerford descobriram a primeira alteração cromossômica associada ao câncer, quando identificaram o cromossomo Philadelphia (Ph) em sangue periférico de um paciente com leucemia mieloide crônica (LMC). (30) Em 1973, Janet Rowley observou que tal cromossomo seria resultante de uma translocação de DNA entre os cromossomos 9 e 22. (31)

20 18 As anormalidades cromossômicas são classificadas em numéricas ou estruturais. As alterações numéricas envolvem aneuploidias (perdas ou ganhos de cromossomos) e euploidias (perdas ou ganhos de genomas completos). As alterações estruturais estão associadas a rupturas dos cromossomos e recombinação anormal: deleções, duplicações, inversões ou translocações. (32) A maioria dos cânceres hematológicos, como leucemias, linfomas e síndromes mielodisplásicas, foi diagnosticada com anormalidades cromossômicas específicas - aneuploidias, deleções, translocações, inversões, cromossomos derivados e isocromossomos, ligadas a eventos iniciadores do crescimento tumoral. (33-37) É de extrema importância o estudo das alterações cariotípicas em células cancerígenas. Primeiro, porque o estudo molecular, nos locais de quebras cromossômicas ou de deleções, foi útil na identificação de oncogenes como BCL2, ABL e de genes supressores de tumor, que são ativados ou desregulados pela presença da alteração citogenética. Segundo, porque anormalidades cromossômicas específicas são importantes para o diagnóstico dessas neoplasias, podendo ser preditivas do curso clínico das doenças ou fornecer um prognóstico favorável. (7) Pacientes com LMC e cromossomo Philadelphia (Ph) no cariótipo apresentam evolução clínica e sobrevida maior do que pacientes sem o cromossomo Ph. (38) As translocações do gene ABL, t(9;22)(q34;q11), conduzem a formação de um gene de fusão, novo e híbrido (BCR-ABL1), que inicia a ação da proteína tirosina quinase responsável pela ativação de diversos sinais transformadores das células-tronco hematopoiéticas. (39) A terapia molecular alvo-específica vem permitindo a remissão molecular das neoplasias hematológicas e melhora nas taxas de sobrevida global dos pacientes. (40) Alguns fármacos possuem mecanismos de inibição específicos da proteína formada Bcr/Abl1, conduzindo à remissão da LMC. (41) O imatinib (Glivec ) é uma das drogas inibidoras da proteína tirosina quinase (TKIs), que induz a remissão citogenética (de células Ph + ) e hematológica na LMC. (42) Já os pacientes com LMA apresentam prognóstico bom se manifestarem t(15;17)(q22;q12), t(8;21)(q22;q22), inv(16)(p13.1q22) ou t(16;16)(p13.1;q22) e prognóstico desfavorável se ocorrer a presença de rearranjos complexos (>3 anormalidades não-relacionadas), cariótipo monossômico, deleções nos cromossomos 5 ou 7, 3q anormal, t(6;11), t(9;22). (23,43)

21 19 A hiperploidia (> 50 cromossomos no cariótipo), a t(12;21) com fusão dos genes TEL-AMLI e trissomias dos cromossomos 4, 10 e 17 estão associadas a bom prognóstico na LLA. (38,44) Por outro lado, a monossomia do cromossomo 7, a inversão paracêntrica do cromossomo 3, a t(4;11) com fusão dos genes MLL-AF4 e a t(9;22) com fusão dos genes BCR-ABL estão associadas a prognóstico ruim e maior resistência a quimioterápicos. (38,45,46) A deleção em 13q14 é importante no prognóstico de indivíduos com LLC. (23) Uma deleção em 17p permite que os pacientes leucêmicos tenham respostas positivas com as terapias com alemtuzumab e outros agentes antileucêmicos. (47,48) Outras anormalidades cariotípicas importantes em neoplasias hematológicas que devem ser consideradas e são fundamentais na orientação terapêutica dos pacientes são -5, del(5q), -7, del(7q) em mielodisplasias; t(5;14)(q31;q32) em linfomas de células B e translocações em 14q11.2, 7q35, 7p14-15 em linfomas de células T. (23,24,49) Indivíduos com anomalias cromossômicas e alterações na medula óssea têm maior predisposição ao desenvolvimento de malignidades hematológicas. (50) Crianças com Síndrome de Down (SD) apresentam um risco de 10 a 20 vezes maior de desenvolver leucemia, sobretudo LMA. (51) Outros estudos sugerem uma associação entre a Anemia de Fanconi (AF) (trissomia de 1q, monossomia de 7 e ganhos em 3q) com a progressão de SMD-LMA (Síndromes mielodisplásicas e leucemia mielóide aguda). (52) A leucemia pode evoluir como evento secundário a síndromes genéticas, mas existem síndromes que orientam o desenvolvimento da leucemia como um fenótipo primário. Alguns estudos sugerem que 30% dos bebês com Síndrome de Down e história familiar com TMD (Desordem Mieloproliferativa Transiente) vão desenvolver SMD ou LMA. (53) 1.4 Envelhecimento, alterações citogenéticas e neoplasias hematológicas O envelhecimento é um processo biológico progressivo, regulado por interações genéticas complexas, influenciado por fatores ambientais. (54,55) A senescência celular é um mecanismo do envelhecimento em resposta a danos no DNA, induzindo interrupção no crescimento permanente e resistência a apoptose. (56)

22 20 A imunosenescência promove o surgimento de infeções crônicas e defeitos na imunidade anticâncer com disfunções em células B e células T (queda em células CD8+ naives, em células T regulatórias, aumento na memória de células T). (57,58) Consequentemente, aumentam as chances de malignidades hematológicas envolvendo essas células. Durante o processo de envelhecimento, a medula óssea de indivíduos idosos perde sua capacidade de responder apropriadamente à substituição de células sanguíneas. (59) Além disso, o estresse oxidativo e as falhas na regulação da produção de citocinas podem mudar com a idade e contribuir para o surgimento de clones anormais em células hematopoiéticas. (55,60) A expansão celular clonal de células hematopoiéticas progenitoras anormais pode representar um fator contribuinte para o desenvolvimento de malignidades hematológicas. As células sanguíneas de mais do que 2% dos indivíduos contêm mutações representativas de eventos pré-malignos, desencadeadores dessa expansão clonal e essa taxa aumenta proporcionalmente à idade (5-6% das pessoas com mais de 70 anos). (61) Conforme as células primárias humanas perdem a capacidade de se multiplicar e envelhecem, ocorre o encurtamento do DNA que constitui a parte final dos cromossomos, os telômeros. (62) Quando o encurtamento telomérico alcança seu ponto crítico, uma cascata de eventos conduz à inibição da proliferação celular via apoptose ou à senescência replicativa. (63) As alterações teloméricas predispõem a anormalidades cromossômicas e ao surgimento do câncer. (56) Alguns estudos epidemiológicos vêm demonstrando variações etárias e citogenéticas na incidência de neoplasias hematológicas. A LMA é a forma mais comum de leucemia aguda em adultos e sua incidência aumenta com a idade, com início mediano aos 65 anos. (23) Estudos demonstram que alterações envolvendo 11q23, t(6;9)(p23;q34), +8, +21 e anormalidades estruturais não-recorrentes são mais comuns em indivíduos jovens com LMA, enquanto a presença de cariótipo normal é mais frequente em idosos. As leucemias secundárias (-7, del(5q), -5, 3q anormal, + 8) são mais comuns em idosos. (64) Já a LMC é uma doença também mais frequente em adultos e idosos, 50 % dos pacientes têm 66 anos ou mais. (65) A LLA é uma doença com incidência maior em crianças - 75% dos casos ocorrem antes dos 6 anos, com elevação secundária da incidência após os 40 anos. A forma crônica da doença, LLC, ao contrário da LLA, acomete com mais frequência

23 21 pessoas idosas, com pico de incidência entre 60 e 80 anos. (23) Indivíduos com LLA (> 59 anos) apresentam um prognóstico ruim. Esse fato é atribuído à frequência relativamente alta do cromossomo Philadelphia (Ph) nessa faixa etária. Nesse sentido, um estudo, realizado com pacientes entre anos, identificou anormalidades randomizadas adicionais aos cromossomos Philadelphia, nas regiões 2q3, 6q2 e diploidias. (66) Outra malignidade hematológica incidente em idosos é o MM % dos pacientes apresentam mais do que 75 anos. (67) Pesquisas demonstram que a incidência de t(4;14), no mieloma múltiplo, é menos significativa em pacientes com mais de 75 anos (8.3%) e idade anos (10.9%), em relação àqueles com idade de 65 anos ou menos (14.3%). (68) Em relação ao linfoma Não-Hodgkin (LNH), cerca de 50 % dos casos ocorrem em pacientes com mais de 60 anos e 40%, em pacientes com mais de 70 anos. (69) Uma análise de regressão logística revelou relação significativa entre o aumento da idade e a perda de translocações no gene IRF4, ganhos em 1q21, 18q21, 7p22 e 7q21, assim como alterações em 3q27 em linfomas de células B. (70) Cerca de 2 a 3% dos idosos apresentam anormalidades cromossômicas (duplicações, deleções e dissomia uniparental), provenientes de mosaicismo clonal, em amostras de sangue. Essas anomalias estão relacionadas a um risco 10 vezes maior de desenvolvimento de cânceres hematológicos. (71) Compreender o perfil citogenético das neoplasias hematológicas em idosos pode ampliar a performance funcional e melhorar a qualidade de vida dessa faixa etária. A orientação terapêutica individual de idosos pode ser realizada com base no estágio da doença e no status fisiológico funcional - etário dos pacientes. (72)

24 22 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Avaliar a presença de alterações citogenéticas em células de material oncológico de sangue periférico (OB-Oncology Blood) e de medula óssea (BM-Bone Marrow) de pacientes com diferentes neoplasias hematológicas e associar a frequência dessas anomalias ao processo de envelhecimento. 2.2 Objetivos específicos Caracterizar o perfil epidemiológico e citogenético de diferentes neoplasias hematológicas. Avaliar a frequência de alterações citogenéticas em neoplasias hematológicas e associar a prevalência dessas alterações ao longo do envelhecimento. Descrever anomalias cromossômicas (numéricas e/ou estruturais) em diferentes neoplasias hematológicas.

25 23 3 MATERIAL E MÉTODOS O presente projeto foi submetido à apreciação do Comitê de Ética e Pesquisa-CEP da Faculdade de Medicina de Marília-FAMEMA e aprovado sob o nº de protocolo CAAE (Certificado de Apresentação para Apreciação Ética) (ANEXO A). 3.1 Material Os resultados dos exames de cariótipo envolvidos no estudo foram provenientes de amostras de material oncológico de sangue periférico (OB-Oncology Blood) e de medula óssea (BM-Bone Marrow) de pacientes com diferentes tipos de doenças onco-hematológicas. O material foi submetido ao Serviço de Citogenética do Hemocentro-FAMEMA, preparado e os cariótipos analisados no período de março 1998 a março As amostras foram cultivadas, processadas e coradas no Laboratório de Genética pela técnica de bandamento G (corante Wright), a um nível adequado de resolução de 400 bandas cromossômicas. Foram analisadas cerca de 10 a 20 células em metáfase por amostra, sob aumento de 1000 X, em microscópio óptico (Olympus). Nos laudos citogenéticos, foi realizada interpretação dos resultados dos cariótipos dos pacientes, segundo a Classificação Citogenética Internacional - ISCN 2013 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature), verificando-se a presença de cromossomos sexuais masculinos ou femininos (XY ou XX) e cromossomos autossômicos com ou sem anormalidades numéricas (< ou > 46 cromossomos) e/ ou estruturais (deleções, inversões, translocações...) aparentes, em células de culturas de 6, 24, 48 e 72 horas (APÊNDICE A). (73-75) Considerou-se, como margem de sucesso da análise, a presença de um porcentual acima de 30% de blastos na contagem de células do sangue periférico. As amostras dos cariótipos envolvidos no estudo foram obtidas pela coleta de sangue periférico ou pela punção e aspiração de medula óssea da crista ilíaca ou do osso esterno de pacientes com diferentes neoplasias hematológicas. A coleta de sangue periférico foi realizada por punção venosa e foram coletados aproximadamente 4 ml de sangue periférico em um tubo estéril contendo

26 24 anticoagulante heparina sódica. A punção e a aspiração da medula óssea foram realizadas por médico hematologista, sendo primeiramente lavado o interior de uma seringa estéril com de 0,5 ml de heparina sódica (1000 UI/mL), mantendo 0,1 ml de heparina em seu interior para a realização do procedimento. Procedeu-se à punção e aspiração da medula óssea do osso esterno ou da crista ilíaca póstero superior do paciente, retirando-se a agulha, e o material que, depois de homogeneizado, foi transferido para um tubo estéril. 3.2 Métodos Desenho do estudo Para o presente trabalho, foi realizado um estudo observacional transversal retrospectivo, com base nos laudos e resultados de exames citogenéticos de pacientes com neoplasias hematológicas e linfoides, presentes no banco de dados e arquivos de exames do Serviço de Citogenética do Hemocentro-FAMEMA, ao longo de 18 anos. Esse serviço presta assistência à população de Marília e de cidades próximas, totalizando mais de 1,5 milhão de pessoas. O Laboratório possui programas internos de controle do padrão de qualidade, como PNCQ (Programa Nacional de Controle de Qualidade) e CIQ (Controle Interno de Qualidade), com certificação ISO 9001:2008 (International Organization for Standardization) Critérios de exclusão Foram excluídos os cariótipos de pacientes pós-transplante de medula óssea (PTMO) ou provenientes de exames particulares (oriundos da cidade Jaú), pacientes sem identificação de data de nascimento ou de hipótese diagnóstica da neoplasia hematológica e casos de cariótipos associados a causas, sintomas ou consequências das neoplasias hematológicas, sem referência à patologia específica, entre as quais: leucocitose, leucose, pancitopenia, imunodeficiência, linfocitose atípica, gamopatia monoclonal, síndrome genética a esclarecer, amiloidose primária, aplasia de medula óssea, anemias, plaquetopenias, plaquetose, leucocitose a esclarecer, bicitopenias, carcinoma suprarrenal, esplenomegalias,

27 25 hepatoesplenomegalia, rabdomiosarcoma alveolar, falência medular, investigação t(9;22) e hipoplasia de medula óssea Critérios de inclusão Foram incluídos no estudo os cariótipos associados a doenças oncohematológicas que seguem os critérios de classificação das neoplasias hematológicas e linfoides da Organização Mundial de Saúde (OMS), com base na alteração citogenética característica de cada malignidade. (76-79) Assim, foram considerados os casos de linfoma leucemizado, linfoma de Hodgkin (LH), linfoma não-hodgkin (LNH), linfoma folicular, linfoma folicular refratário, linfoma de células do manto, linfoma da zona marginal, linfoma esplênico, linfoma anaplásico, leucemia prolinfocítica, síndrome leucoproliferativa, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC), leucemia mielomonocítica juvenil (LMC juvenil), síndrome mielodisplásica (SMD), trombocitemia essencial (TE), mielodisplasia, leucemia aguda (LA), leucemia linfóide aguda (LLA), leucemia linfoide crônica (LLC), leucemia plasmocitária, doença mieloproliferativa (DM), leucemia crônica neutrofílica (LNC), citopenia refratária, anemia refratária, doença mieloproliferativa crônica (DMPC), mieloma múltiplo (MM), policetemia vera (PV), trombocitopenia refratária, leucemia mielomonocítica crônica (LMMC), doença linfoproliferativa crônica (DLPC), doença linfoproliferativa (DLP), mielofibrose, síndrome hipereosinofílica, tricoleucemia ou leucemia de células pilosas Hairy Cells, síndrome mieloproliferativa (SM) População do estudo Os pacientes incluídos no estudo foram diagnosticados com diferentes tipos de neoplasias hematológicas e atendidos pelo Ambulatório de Onco-hematologia adulto e de Onco-hematologia infantil do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Marília, Oncologia Clínica- HC, Hospital Regional de Assis, Santa Casa e Clínicas Oncológicas externas. As neoplasias hematológicas dos pacientes foram monitoradas em fases diversificadas das doenças, conforme a evolução clínica e o prognóstico. Um grupo de pacientes realizou exame de cariótipo, pelo Serviço de Citogenética do

28 26 Hemocentro, por uma única vez no período, tendo recebido apenas um resultado diagnóstico. Um segundo grupo de pacientes realizou mais de um exame de cariótipo ao longo do período de análise ( ), devido ao monitoramento clínico e ao controle citogenético e terapêtico das neoplasias. As repetições na realização do exame de cariótipo pelos pacientes devem-se a uma série de motivos: monitoramento do quadro clínico dos pacientes e confirmação ou alteração do diagnóstico da neoplasia hematológica pelo médico; progressão e evolução da doença para fase mais aguda ou crítica, com mudança da hipótese diagnóstica e alteração do resultado citogenético; acompanhamento da remissão da anormalidade cromossômica pelo uso de tratamento farmacológicomolecular e, também, material insuficiente para análise, com baixo índice mitótico ou porcentual baixo de blastos circulantes no sangue periférico Na realização da primeira coleta de material oncológico e análise citogenética, os pacientes não estavam submetidos a tratamento quimioterápico. No entanto, ao longo do monitoramento citogenético e durante a realização de outros exames de cariótipo no período, esses pacientes estavam sob tratamento oncológico, sobretudo, à base de fármacos com alvo molecular para remissão das neoplasias e das alterações citogenéticas. A faixa etária dos indivíduos foi estruturada seguindo a classificação do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) e da OMS (Organização Mundial da Saúde): pacientes jovens (0-19 anos), pacientes adultos (20-59 anos) e pacientes idosos (60 anos ou mais). (80,81) Para a definição das faixas etárias, foi considerada a idade do paciente quando é realizado o primeiro exame de cariótipo e diagnóstico citogenético, ou seja, durante coleta e análise de material oncológico do paciente pela primeira vez Variáveis demográficas, clínico-diagnósticas e citogenéticas Para coleta dos dados dos pacientes, foram obtidas informações dos formulários de requisição de análise cromossômica oncológica de medula óssea e/ ou sangue periférico e resultados dos laudos citogenéticos que estavam armazenados e cadastrados nos Arquivos de Exames do Serviço de Citogenética do

29 27 Hemocentro desde Não houve, portanto, participação direta dos pacientes na pesquisa (ANEXOS A e B). Os dados coletados dos pacientes, como resultado citogenético, gênero, data de nascimento (DN), idade aproximada, tipo de material analisado (OB ou BM), tempo de cultivo celular (H), frequência de realização do exame citogenético e hipótese diagnóstica das doenças (HD), foram agrupados no programa e editor de planilhas Excel-Windows 8, separados por ano de entrada do paciente no Serviço de Citogenétia e análise diagnóstica. As informações com referência aos pacientes foram distribuídas em planilhas do Excel, de acordo com o tempo de seguimento do paciente, após a realização dos exames de cariótipos, com base em quantas vezes o paciente retornou para realizar a análise citogenética (tempo 1, tempo 2, tempo 3, tempo 4... tempo 16). Foi considerado como marco inicial o ano do primeiro diagnóstico citogenético (tempo 1) e, como último evento, a realização do exame de cariótipo pela última vez, em um período de 18 anos (tempo 16). Para classificação do tipo de amostra e material analisado, as amostras foram separadas em material oncológico de sangue periférico (Oncology Blood - OB) e material oncológico de medula óssea (Bone Marrow - BM). O tempo de cultivo celular foi separado em 6, 24, 48 horas, para as amostras de material oncológico de medula óssea e 72 horas para as amostras de material oncológico de sangue periférico. Os cariótipos foram classificados em normais ou alterados. Os alterados foram divididos entre aqueles com alteração numérica, com alteração estrutural ou com alteração numérica e estrutural, conforme a Classificação Citogenética Internacional- ISCN 2013 (75) A hipótese diagnóstica (HD) dos pacientes foi especificada com base na classificação das neoplasias hematológicas e linfoides da OMS (79,82) : 1-Neoplasias mieloproliferativas; 2-Neoplasias mieloides e linfoides com eosinofilia e anormalidades dos genes PDGFRA, PDGFRB e FGFRQ1; 3-Neoplasias mieloproliferativas/ mielodisplásicas; 4-Síndromes Mielodisplásicas (SMDs); 5- Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e neoplasias de células precursoras relacionadas; 6-Leucemias agudas de linhagens ambíguas (LA); 7-Neoplasias de células precursoras linfoides (Leucemias linfoides agudas); 8-Neoplasias de células linfoides B maduras (leucemia/linfoma de células B linfoblásticas). Outras neoplasias

30 28 hematológicas: 9-Neoplasias de células T ou NK maduras; 10-Linfoma de Hodgkin (LH); 11-Neoplasias de células histiocíticas e dendríticas; 12-Doenças linfoproliferativas associadas à imunodeficiência (DLP-ID); 13-Doenças linfoproliferativas B ou T; 14-Linfomas; 15-Leucemias (APÊNDICE B). As hipóteses diagnósticas 2, 11 e 12 não foram consideradas nos cálculos dos resultados, devido à ausência de casos relacionados a essas neoplasias hematológicas no estudo. 3.3 Análise estatística Foi realizada a análise descritiva dos dados demográficos, clínicos e citogenéticos dos pacientes, com a descrição da frequência absoluta (números absolutos) e relativa (percentuais) das variáveis categóricas. Foram calculados a média e o desvio-padrão da idade dos pacientes e a frequência das variáveis contínuas. As análises estatísticas foram realizadas, utilizando-se o software SPSS (Statistical Package for Social Science), versão 17.0.

31 29 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Frequência de exames de cariótipo e pacientes no estudo Foram avaliados 1243 laudos com resultados citogenéticos de 809 pacientes com neoplasias hematológicas e linfoides, coletados no banco de dados de Arquivos de Exames do Serviço de Citogenética do Hemocentro, desde Desse total de exames de cariótipo, foram excluídos 70 resultados citogenéticos de 63 pacientes, sendo que 7 desses pacientes excluídos foram reconsiderados, devido à mudança de hipótese diagnóstica ao longo dos anos e sua readequação aos critérios de inclusão (Fluxograma 1). Foram inclusos na pesquisa 1173 exames de cariótipos de 746 pacientes (n) analisados ao longo do período e 569 exames de cariótipos de 142 pacientes, cuja realização ocorreu por mais de uma vez (Fluxograma 1). Fluxograma 1 - Distribuição dos exames de cariótipo e do número de pacientes com neoplasias hematológicas analisados no período Exames de cariótipo Pacientes do estudo 1243 do banco de dados 809 do banco de dados 70 exames 63 pacientes excluídos excluídos 7 exames/ pacientes reconsiderados 1173 inclusos no estudo 746 inclusos no estudo 569 exames realizados 604 pacientes c/ exames 142 pacientes c/+de por mais de1 vez realizados por uma vez 1 exame de cariótipo Tempo 1 Tempo 2-16

32 30 O gráfico 1 mostra o número e a frequência de exames de cariótipos realizados durante o monitoramento citogenético das neoplasias hematológicas no período de A frequência 1 (746) representa o número de pacientes que tiveram o exame realizado apenas uma vez (tempo 1). Os números correspondentes às frequências de 2 a 16 representam os casos em que foram realizados mais de um exame citogenético pelo mesmo paciente (tempo 2-16). A frequência máxima de realização do exame de cariótipo, por um único paciente, foi de 16 vezes. Gráfico 1 - Número e frequência de exames de cariótipo realizados pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro da FAMEMA entre os anos O monitoramento citogenético é uma ferramenta importante na avaliação de perda ou de atraso na remissão das neoplasias e na aquisição ou não de alterações cromossômicas clonais no decurso da doença a despeito da terapia. (83) Segundo Alvarenga et al. (84), o monitoramento citogenético permite um diagnóstico diferencial entre neoplasias hematológicas, o acompanhamento da resposta terapêutica e a detecção de alterações cromossômicas adicionais.

33 Caracterização dos exames de cariótipo A maioria dos pacientes, 604 (81%), teve o exame de cariótipo realizado uma única vez e 142 (19%) pacientes o tiveram mais de uma vez (Tabela 1). Dessa forma, 746 cariótipos foram realizados no tempo 1, quando foi coletada a amostra de material oncológico do paciente e realizado o primeiro exame de cariótipo (Gráfico 1). A literatura demonstra a prevalência no número de exames realizados por uma única vez em relação àqueles realizados por repetidas vezes. Um estudo transversal, com adultos, com idade igual ou maior a 20 anos, da cidade de Pelotas (RS) e amostragem feita em múltiplos estágios, demonstrou que, de 4167 consultas médicas, 55,1% resultaram na solicitação de, pelo menos, 1 exame complementar (laboratorial) e que, independente do número de consultas realizadas, 67,6% apresentaram um exame solicitado. (85) A coleta e a realização de exames citogenéticos, por repetidas vezes e em múltiplas faixas etárias, auxiliam a avaliação da origem temporal e a estabilidade das anormalidades genéticas. Uma análise longitudinal, realizada por um consórcio internacional GENEVA (Gene Environment Association Studies), com acompanhamento de um paciente com câncer que teve seu material genético coletado por duas vezes (aos 66 e aos 72 anos), demonstrou que durante a primeira coleta não foram identificadas anomalias com mosaicismo celular, mas na segunda foram encontradas 5 deleções associadas a mosaicismo cromossômico, cada uma detectada em um cromossomo diferente. (71) Em relação ao material analisado para obtenção dos cariótipos, as amostras de medula óssea (BM) representaram 95,6% (713) e as de material oncológico de sangue periférico (OB), 4,4% (33). A tabela 1 mostra as características dos exames de cariótipos realizados. Existe prioridade no uso de células de BM para o processamento das culturas e realização das análises citogenéticas. Essas amostras contêm mais material para análise, apresentam células em processo completo de divisão celular e as células incapazes de se dividir inibem a divisão de células remanescentes, estabelecendo um número razoável de células em divisão celular em múltiplas culturas. Por outro lado, as amostras de sangue apresentam taxas de expansão clonal mais baixas do que as células de BM, suas divisões

34 32 celulares podem ser derivadas de células recém- produzidas pela medula óssea e não representar o status geral das doenças. (86,32) A faixa etária de adultos contribuiu com o maior porcentual de cariótipos alterados (47,4%), seguida da população idosa (42,1%) e da população jovem, com 10,5%. Os idosos apresentaram uma prevalência no número de cariótipos normais (56,4%), quando comparados aos jovens (10,9%) ou adultos (32,7%)(Tabela 1). No entanto, mesmo que nossos resultados mostrem um maior porcentual de cariótipos normais entre os idosos, alguns autores afirmam ocorrer um aumento no número de cariótipos alterados com o aumento da idade. Dois estudos, conduzidos por pesquisadores do National Cancer Institute (NCI) e Gene Environment Association Studies (GENEVA), vinculados ao National Institute of Health (NIH), sugerem que as alterações cromossômicas aumentam conforme ocorre o envelhecimento e que a presença de mosaicismo genético, sobretudo em células de idosos, pode predispor esse grupo ao desenvolvimento de cânceres hematológicos (leucemia, linfoma, mieloma). (71,87) O estudo GENEVA, que investigou amostras de sangue de mais de 50,000 participantes, com mosaicismo clonal (duplicações, deleções e dissomia uniparental) em 404 dos pacientes, relatou uma frequência de mosaicismo clonal <0.5% em sujeitos com menos de 50 anos e de 2-3% entre os idosos. (71) Frequências maiores de anomalias cromossômicas na velhice podem estar associadas ao aumento de células em expansão clonal nessa fase, ao aumento do número de divisões célulares em linfócitos e ao aumento nas taxas de mutações em células somáticas que, segundo alguns autores, seriam resultantes do declínio da manutenção dos mecanismos genômicos nessa fase. (88-90) As alterações no sistema hematopoético dos humanos durante o envelhecimento incluem queda na capacidade do sistema imune inato (queda na atividade de células natural killers, na capacidade dos macrófagos e neutrófilos realizar fagocitose e no estado pró-inflamatório) e deficiências no sistema imune adaptativo (queda no número de células B naive e T, aumento de células B de memória. (91) Aliás, há um declínio funcional progressivo na replicação das células hematopoéticas que pode limitar a longevidade dos indivíduos. Sem a regulação precisa da produção de células sanguíneas, as células do sistema hematopoético

35 33 perdem sua capacidade de combater infecções, reconhecer e eliminar células anormais e carregar oxigênio para os tecidos. (92) Tabela 1 - Características dos exames de cariótipo, de pacientes com neoplasias hematológicas, realizados pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro da FAMEMA, no período N % Total de exames inclusos no estudo % Frequência dos exames Uma única vez ,0% Repetidas vezes ,0% Material analisado Material oncológico (OB) 33 4,4% Medula óssea (BM) ,6% Classificação do exame de cariótipo Normal ,8% Jovens (0-19 anos) Adultos (20-59 anos) Idosos (60 anos ou mais) Alterado Jovens (0-19 anos) Adultos (20-59 anos) Idosos (60 anos ou mais) ,9% 32,7% 56,4% 38,2% 10,5% 47,4% 42,1% N: número amostral; %: porcentual; OB: Oncology Blood; BM: Bone Marrow 4.3 Frequência de pacientes com neoplasias hematológicas O gráfico 2 mostra o número de pacientes com neoplasias hematológicas em função do ano de análise do exame de cariótipo. Entre os anos de , foi

36 Frequência de pacientes 34 realizada a maioria dos exames de cariótipo dos pacientes com neoplasias hematológicas. Gráfico 2 - Número de pacientes com neoplasias hematológicas encaminhados para análise citogenética entre os anos de 1998 e Ano de análise 4.4 Perfil demográfico e das hipóteses diagnósticas dos pacientes Os resultados apresentados na Tabela 2 tiveram como base o momento de realização do primeiro diagnóstico citogenético (tempo 1), sendo incluídos na pesquisa 746 pacientes. A média de idade e desvio padrão (DP) foi de 54,7 (±23,1) anos, sendo que a idade variou de 17 dias a 94 anos; 379 pacientes eram do gênero feminino (50,8%) e 367, do gênero masculino (49,2%). Dentre todas as faixas etárias analisadas, foi observada uma frequência maior da população idosa diagnosticada com diferentes neoplasias hematológicas (50,9%), seguida da faixa etária dos adultos (38,3%) e dos jovens (10,7%). A Tabela 2 descreve as características da população que teve o cariótipo avaliado. Dados da literatura comprovam uma incidência maior de neoplasias hematológicas entre os idosos. O projeto HAEMACARE, desenvolvido na Europa, entre , demonstrou que a incidência de neoplasias mieloides (leucemia mieloide aguda, neoplasias mieloproliferativas, síndromes mielodisplásicas e neoplasias mieloides distintas) e de malignidades linfoides (linfoma de Hodgkin, neoplasias de células B maduras, neoplasias de células B e NK maduras e

37 35 neoplasias linfoides, sem identificação) tende a aumentar com a idade, alcançando seu pico entre anos. (93) Estudos semelhantes sugeriram que a probabilidade de alguém ser diagnosticado com alguma malignidade hematológica aumenta com a idade em indivíduos com mais de 65 anos. (94,95) O envelhecimento ocorre de forma simultânea a modificações funcionais e estruturais fisiológicas que favorecem a predominância de doenças crônicas e cânceres entre os idosos. A prevalência no número de neoplasias hematológicas em pacientes mais velhos é resultante da associação de 3 fatores: comprometimento fisiológico típico da idade, aspectos genéticos e o estilo de vida moderno. (13) No último século, o número de pessoas com idade superior aos 65 anos tem duplicado. Estima-se que esse número dobrará novamente nos próximos 50 anos, porém, quadruplicando para a população com mais de 85 anos. (96) Consequentemente, espera-se aumento na incidência de neoplasias hematológicas na faixa etária acima de 60 anos. (97) Muitos estudos afirmam que as neoplasias hematológicas (linfoides e mieloides) são, de forma geral, mais comuns em homens do que nas mulheres. (98,99) Uma das justificativas é que os homens são mais expostos a agentes ambientais e a potenciais carcinógenos ocupacionais em comparação às mulheres. (100,101) Alguns fatores contribuem com as diferenças entre os gêneros na predisposição ao câncer: hormômios sexuais diferentes, causas ambientais ou doenças genéticas. ( ) Os hormônios estrógeno e progesterona são reconhecidos por modular o sistema imune e determinar diferenças entre os gêneros na susceptibilidade a uma série de doenças. (105,106) Aliás, diferenças na imunidade entre homens e mulheres são responsáveis por essas disparidades. Enquanto as mulheres apresentam mais doenças autoimunes, os homens são mais afetados por cânceres e infecções. (107) Os resultados deste estudo demonstraram um predomínio de neoplasias hematológicas em mulheres idosas, 209 casos (55%), ao contrário da literatura que demonstra ser os homens os mais acometidos por essas neoplasias. (98.99) Uma das justificativas é o fato de as mulheres viverem mais do que os homens e a mortalidade do gênero masculino ser superior. A expectativa de vida para os homens ao atingir 60 anos é de 8,4 anos e de 9,1 anos, para as mulheres, considerando também que a mortalidade por câncer é maior entre os homens do que entre as mulheres (207.9 por 100,000 homens e por mulheres).

38 36 Dados do IBGE confirmam expectativa de vida para as mulheres de 78,8 anos, enquanto para os homens seria de 71,6 anos. (108,109) Por outro lado, as mulheres idosas realizam mais exames do que os homens idosos. Estudos indicam que entre os fatores demográficos com maior prevalência no pedido de exames estão o gênero feminino e a idade avançada. As mulheres apresentam uma probabilidade 3% maior na solicitação de exames (68,6%), e quanto maior a idade, maior é a proporção de consultas com solicitação de exames. (85) Em relação às hipóteses diagnósticas (HD) das neoplasias hematológicas, encaminhadas para o estudo citogenético, foram selecionadas as três mais frequentes, além do grupo de outras neoplasias: a HD1 (Neoplasias mieloproliferativas) foi a mais frequente, com 236 casos (31,6%); em segundo lugar, a HD 4 (Síndromes mielodisplásicas-smds), com 19,4% (145 casos); e, em terceiro lugar, a HD3 (Neoplasias mieloproliferativas/ mielodisplásicas) com 15,7% (117 casos). Foram agrupadas como Outras neoplasias hematológicas por apresentarem o menor porcentual (3,9%) na amostra estudada, 29 casos distribuídos entre Neoplasias de células T ou NK maduras; Linfoma de Hodgkin (LH); Doenças linfoproliferativas B ou T; Linfomas e Leucemias (Tabela 2).

39 37 Tabela 2 - Características demográficas e hipótese diagnóstica dos pacientes com neoplasias hematológicas no tempo 1 N % Total de pacientes inclusos no estudo % Idade (anos) Média (± DP) 54,7 (23,1) Idade mínima (dias) 17 Idade máxima (anos) 94 Faixa etária Jovens (0-19 anos) 80 10,7% Adultos (20-59 anos) ,3% Idosos (60 anos ou mais) ,9% Mulheres idosas % Homens idosos % Gênero Feminino ,8% Masculino ,2% Hipótese Diagnóstica Neoplasias mieloproliferativas ,6% Neoplasias mielodisplásicas ,7% Síndromes mielodisplásicas ,4% Leucemia mieloide aguda (LMA) 57 7,6% Leucemias agudas 35 4,7% Neoplasias de céls. precursoras 37 5,0% linfoides (LLA) Neoplasias de céls. linfoides B maduras 90 12,1% Outras neoplasias hematológicas 29 3,9% N:número amostral; %: porcentual; DP: desvio-padrão; céls: células

40 38 A literatura mostra resultados distintos em relação à frequência das neoplasias hematológicas em estudo. Segundo o projeto HMRN - Haematological Malignancy Research Network -, desenvolvido na Europa entre os anos de 2004 e 2009, analisando casos de neoplasias hematológicas (2706 neoplasias mieloides e 8023 neoplasias linfoides), o linfoma de células B difuso é a malignidade mais comum entre as neoplasias hematológicas (1417 casos). Em segundo lugar, está outra neoplasia linfoide (Neoplasias de células B maduras), a LLC (1145 casos) e, em terceiro lugar, está a neoplasia mieloproliferativa crônica, entre as neoplasias mieloides, com maior porcentual (961 casos). (99) 4.5 Distribuição das variáveis demográficas e classificação dos exames de cariótipo do estudo A análise das hipóteses diagnósticas por gêneros mostrou que as Neoplasias mielodisplásicas (HD3), as Síndromes mielodisplásicas (HD4) e as Neoplasias de células precursoras linfoides, como LLA, foram mais frequentes entre as mulheres: 53,8%, 68,3% e 54,1%, respectivamente. Já as Neoplasias mieloproliferativas (HD1), a LMA (HD5) e as Neoplasias de células B maduras (HD8) foram mais frequentes no gênero masculino: 52,1%, 56,1% e 56,7%, respectivamente (Tabela 3) De forma diferente aos resultados por nós observados, a SMD demonstra ter predomínio no gênero masculino (4,5 casos novos/ pessoas) em comparação ao gênero feminino (2,7 casos novos/ pessoas), segundo a base de dados populacional americana Surveillance, Epidemiology and End Results (SEER), com dados de 2001 a (110) Um dos principais motivos é que os homens apresentam envelhecimento molecular mais rápido, o que pode ser mensurado pelo encurtamento dos telômeros e perfil de metilação de DNA. (111,112) Com relação a LLA, nossos resultados confirmaram as observações da literatura com a predominância no gênero feminino. A incidência de LLA no Brasil, na faixa etária de 0-19 anos, é de 44,7 por milhão de pessoas para o gênero feminino e de 25,5, para o gênero masculino. (113) Os resultados obtidos com referência ao gênero masculino concordam com uma série de pesquisas e análises epidemiológicas. Entre as neoplasias mieloproliferativas, a LMC é mais comumente encontrada em homens (2,3 casos

41 39 novos/ pessoas) do que em mulheres (1,3 casos novos/ pessoas), assim como a leucemia eosinofílica (9 homens: 1 mulher). (114,115) A LMA tem uma incidência em homens de 5,0 casos novos/ pessoas em relação a 3,4 casos novos/ no gênero feminino. (114) Entre as neoplasias envolvidas com a HD8 (Neoplasias de células B maduras), está o LNH, considerado o oitavo câncer mais comumente diagnosticado em homens e décimo primeiro em mulheres e o mieloma é mais frequentemente encontrado em homens (8,2 casos novos/ pessoas) do que nas mulheres (5,2 casos novos / pessoas. (114,116) Em relação às hipóteses diagnósticas em diferentes faixas etárias, no momento da realização do primeiro exame e diagnóstico citogenético, observou-se que a HD7 (LLA) foi mais frequentemente encontrada entre os pacientes jovens, com idade média de 13,4 anos, representando 81,1% dos casos; enquanto as HD3 (Neoplasias mielodisplásicas), HD4 (Síndromes mielodisplásicas) e HD8 (Neoplasias linfoproliferativas de células B maduras) foram predominantes nos pacientes idosos com porcentual de 70,9%, 81,4% e 66,7% e idade média de 66,1 anos, 67,7 anos e 63,8 anos, respectivamente. Nos pacientes adultos, predominou HD1 (Neoplasias mieloproliferativas) e HD5 (LMA): 58,1% e 57,9%, respectivamente. A idade média dos pacientes com neoplasias mieloproliferativas foi de 51,5 anos e leucemia mieloide aguda foi de 34,8 anos (Tabela 3). Os resultados observados, com referência a LLA, SMD e Neoplasias linfoproliferativas de células B maduras, são semelhantes aos dados da literatura. De acordo com a base de dados populacional SEER Cancer Statistics Review, com informações coletadas de , a LLA é uma neoplasia mais comum em crianças, adolescentes e jovens adultos (15-39 anos) e a SMD é uma doença mais frequente em idosos, com idade de anos (6.8) e anos (12.0). Entre as neoplasias linfoproliferativas de células B maduras, a LLC e o LNH são frequentemente diagnosticados entre anos. (114) A infância está associada a prognósticos desfavoráveis na LLA. A frequência elevada de LLA em crianças e adolescentes pode estar relacionada ao risco biológico maior nesse grupo em adquirir leucemias (regiões com ponto de quebra no genoma BCR-ABL1 e rearranjos mistos de linhagens de leucemias) e aos seguintes fatores de risco: frequência alta de células brancas nessa faixa etária, negatividade

42 40 para CD, hepatoesplenomegalia, baixa adesão e tolerância do paciente a terapias. ( ) Ao contrário dos resultados apresentados, a LMC, entre as neoplasias mieloproliferativas, é conhecida por ser diagnosticada na população idosa, de anos, assim como a LMA, em pacientes com média de idade de 67 anos, segundo a mesma base de dados SEER Cancer Statistics Review. (114) Com relação a LMC, cerca de 50% dos pacientes possuem 66 anos ou mais. (120) Não está claro ainda se essa associação com o envelhecimento deve-se a piora na biologia da doença ou a outros fatores relacionados a idade avançada: causas de mortes diversificadas, aumento no risco de complicações durante o tratamento e contra-indicações a transplantes de medula óssea. (121) Há 3 hipóteses que diferenciam a LMA entre os jovens e os idosos. Nos jovens, seria resultante de um número limitado de eventos mutacionais que restringem a diversidade dos subclones nas leucemias e deixam as funções celulares intactas, como a apoptose. Nos idosos, seria originária de eventos mutacionais, que conduzem a origem de múltiplos subclones leucêmicos, responsáveis por desenvolver vários mecanismos de resistência química. Uma terceira hipótese pressupõe que a natureza da LMA seria determinada em parte pela idade da célula-tronco hematopoética envolvida com a leucemia. (122) A frequência de exames de cariótipo normais (46,XX/ 46,XY), 461 (61,8%) foi maior que a de cariótipos alterados (alteração cromossômica numérica e/ ou estrutural), 285 (38,2%) no estudo (Tabela 3).

43 Tabela 3 Distribuição das variáveis demográficas e da classificação do exame de cariótipo dos pacientes com neoplasias hematológicas (HD) avaliadas pelo Serviço de Citogenética de Neoplasias hematológicas (HD) N (%) Idade média ± (DP) Idade mín-máx (anos) Feminino N (%) Gênero Faixa etária Classificação do exame de cariótipo Masculino N (%) Jovens N (%) Adultos N (%) Idosos N (%) Normal N (%) Alterado N (%) Neoplasias mieloproliferativas Neoplasias mieloproliferativas /mielodisplásicas Síndromes mielodisplásicas Leucemia Mieloide aguda (LMA) Leucemias agudas de linhagens ambíguas (LA) Neoplasias de células precursoras linfoides (LLA) Neoplasias de células linfoides B maduras Outras neoplasias hematológicas 236 (31,6%) 51,5± 19,0 117 (15,7%) 66,1± 19,1 145 (19,4%) 67,7± 14,7 57 (7,6%) 34,8± 21,3 35 (4,7%) 36,4± 27,7 37 (5,0%) 13,4± 16,3 90 (12,1%) 63,8± 13,8 29 (3,9%) 54,2± 23,0 0,4-88,0 113 (47,9%) 123 (52,1%) 13 (5,5%) 137 (58,1%) 86 (36,4%) 77 (32,6%) 159 (67,4%) 0,6-92,0 63 (53,8%) 54 (46,2%) 3 (2,6%) 31 (26,5%) 83 (70,9%) 97 (82,9%) 20 (17,1%) 4,0-91,0 99 (68,3%) 46 (31,7%) 2 (1,4%) 25 (17,2%) 118 (81,4%) 115 (79,3%) 30 (20,7%) 2,0-86,0 25 (43,9%) 32 (56,1%) 16 (28,1%) 33 (57,9%) 8 (14%) 32 (56,1%) 25 (43,9%) 0,5-85,0 10 (28,6%) 25 (71,4%) 12 (34,3%) 15 (42,9%) 8 (22,9%) 21 (60%) 14 (40%) 2,0-88,0 20 (54,1%) 17 (45,9%) 30 (81,1%) 6 (16,2%) 1 (2,7%) 28 (75,7%) 9 (24,3%) 15,0-94,0 39 (43,3%) 51 (56,7%) 1 (1,1%) 29 (32,2%) 60 (66,7%) 69 (76,7%) 21 (23,3%) 0,0-84,0 10 (34,5%) 19 (65,5%) 3 (10,3%) 10 (34,5%) 16 (55,2%) 22 (75,9%) 7 (24,1%) Total 746 (100%) 54,7± 23,1 14d (50,8%) 367 (49,2%) 80 (10,7%) 286 (38,3%) 380 (50,9%) 461 (61,8%) 285 (38,2%) HD: hipótese diagnóstica; N: número amostral; %: porcentual; DP: desvio-padrão; mín: mínimo; máx: máximo; d: dias.

44 42 Um estudo que analisou 51 casos de diferentes tipos de leucemias (LMC/ LMA/ LLA), durante 14 anos, no Hospital de Base, em São José do Rio Preto (SP), demonstrou, no entanto, que 74% dos pacientes apresentaram anomalias cromossômicas clonais, como translocações, deleções, monossomias e trissomias e apenas 21,6% dos casos, cariótipos normais, ao contrário dos resultados observados aqui. O mesmo estudo revelou que a maioria das células apresentava número cromossômico normal, igual aos resultados apresentados nesta análise, em que somente 4,3% dos cariótipos analisados apresentaram alterações numéricas. Ressalta-se, então, que um número elevado de cariótipos normais não exclui a presença de anormalidades cromossômicas submicroscópicas, dificilmente diagnosticadas com uso de técnicas citogenéticas clássicas ou convencionais. (38) Alterações submicroscópicas podem ser identificadas no nível molecular, com envolvimento de genes específicos comuns em cânceres hematológicos, biomarcadores, uso de sondas e tecnologias modernas (FISH, Next-generation,RT- PCR). (123,124) A maioria das neoplasias mielodisplásicas, síndromes mielodisplásicas e neoplasias linfoides B maduras e LLA tiveram cariótipo normal: 82,9%, 79,3%, 76,7%, 75,7%, respectivamente. Foram exceção as neoplasias mieloproliferativas, que apresentaram 67,4% dos cariótipos alterados (Tabela 3). Alguns dados na literatura confirmam a prevalência de cariótipos normais em algumas neoplasias hematológicas. Um estudo longitudinal, realizado entre 1995 e 2006, com análise de amostras de medula óssea de 163 pacientes diagnosticados SMDs, conduzido pela University Medical Center (RUSH) e University of Massachusetts e Memorial Medical Center (UMASS), demonstrou que 47,5% dos pacientes apresentaram cariótipo anormal (52,5% cariótipo normal). (125) Um segundo estudo retrospectivo, entre 1984 e 2002, com revisão de registros médicos de 189 pacientes com SMDs, diagnosticados no National Taiwan University Hospital, relatou que, de uma análise de 33 pacientes com SMDs, 42,2% dos casos estavam associados a exames de cariótipo alterados (57,8% de cariótipo normal). (126) Aliás, anormalidades balanceadas como translocações recíprocas e inversões ocorrem <1% dos casos de SMDs. (127) Algumas pesquisas também destacaram a prevalência de cariótipos normais entre os pacientes com leucemias agudas. Cerca de 50% dos casos de LLA

45 43 apresentam cariótipos citogeneticamente normais. (128) Um estudo retrospectivo, entre os anos , realizado pela American University of Beirut Medical Center com 105 pacientes, 69 (66%) com LMA e 36 (34%) com LLA, 31 (86,1%) com LLA-B e 5 pacientes (13,9%) com LLA-T, revelou um total de 12 pacientes (33%) com cariótipo anormal, 17 pacientes (47%) com cariótipo normal e 7 pacientes (20%) com resultados com falhas no exames de cariótipo. (129) Outro estudo retrospectivo, realizado com 61 pacientes com LLA, com uso de análise citogenética molecular de alta resolução - Fluorescence in situ hybridization (FISH), detectou que apenas 21 das 61 amostras (~34%) analisadas apresentavam cariótipos alterados, 15 casos possuíam anormalidades cromossômicas estruturais e 6 casos apresentaram alterações cromossômicas numéricas. (128) Algumas pesquisas concordam com a frequência elevada de cariótipos normais observada nas neoplasias mielodisplásicas em estudo. Um estudo colaborativo internacional, entre a Mayo Clinic em Minnesota e hospitais do consórcio French CMML (Chronic Myelomonocytic Leukemia), com 409 pacientes diagnosticados com LMMC (leucemia mielomonocítica crônica) - um subgrupo das neoplasias mielodisplásicas demonstrou que somente ~30% dos pacientes apresentavam cariótipo alterado, com as seguintes alterações: +8 (23%), -Y (20%), - 7/7q-(14%), 20q- (8%),+21 (8%), e der(3q) (8%). (130,131) É importante reconhecer o significado da presença de cariótipos normais em células cancerígenas. Entre as explicações, a hipótese mais aceita é a de que, mesmo que as células cancerígenas tenham o cariótipo diplóide normal com apenas algumas alterações submicroscópicas específicas, as anormalidades cromossômicas detectadas representariam mudanças secundárias que ocorrem ao longo da progressão do câncer. (132) No entanto, em relação às neoplasias mieloprolierativas, uma série de dados na literatura confirma a frequência predominante de cariótipos alterados. Um estudo indiano, realizado entre com relato de 164 casos de LMC, um subgrupo das neoplasias mieloproliferativas, demonstrou que 53 (32,3%) dos pacientes tinham cariótipo normal, enquanto dentro de 11 casos (67,7%) apresentavam cariótipo anormal, 96 casos (86,5%) mostraram a presença do cromossomo Philadelphia com t(9;22) e 9 casos (8,1%) de alterações secundárias. (133) Segundo outro estudo, da University of Medicine and Pharmacy in Tîrgu Mures-Romania, realizado entre 2006-

46 com análise de cariótipos de 46 pacientes com LMC (88,5%); identificou 25 casos (54,3%) de anormalidades cromossômicas com confirmação da presença de cromossomo Philadelphia, t(9;22)(q34q11) em 92% dos pacientes. (134) 4.6 Alterações citogenéticas mais frequentemente encontradas nas neoplasias hematológicas do estudo As alterações de cariótipo mais frequentes foram as estruturais, observadas em 73,3% dos casos (209 cariótipos), sendo que ambas as alterações estruturais e numéricas foram identificadas em 15,5% dos casos (44 cariótipos). A Tabela 4 descreve as principais características dos exames de cariótipo analisados. Há duas hipóteses para o desenvolvimento do câncer a partir de alterações cromossômicas estruturais: a primeira estaria associada à presença de anormalidades constitucionais envolvendo genes específicos, implicados na tumorigênese e a segunda estaria relacionada à inativação adquirida de alelos por mutações ou alterações genéticas. (135) A maior parte das neoplasias hematológicas no presente estudo apresentou exames de cariótipo com alteração citogenética do tipo estrutural: neoplasias mieloproliferativas (93,1%), neoplasias mielodisplásicas (45%), síndromes mielodisplásicas (53,3%) e LMA (68%). No entanto, as LA (leucemias agudas) apresentaram maior frequência de alterações citogenéticas tipo numérica/ estrutural (42,9%), seguidas de alterações estruturais (35,7%) e numéricas (21,4%). Já que as neoplasias de células linfoides B maduras apresentaram resultados similares em relação aos três tipos de alterações citogenéticas citadas (33,3%) (Tabela 4). Atualmente, a lista completa de anormalidades cromossômicas em cânceres hematológicos pode ser encontrada na Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. (136) Segundo essa base de dados, os rearranjos mais comuns nas neoplasias hematológicas são as translocações balanceadas. ( ) Logo, as alterações cromossômicas estruturais ficam no topo da lista das anormalidades mais frequentes. As translocações são menos frequentes nas SMDs e neoplasias mieloproliferativas, em que ocorrem desbalanceamentos completos ou parciais, conduzindo à perda de genes supressores de tumor e/ ou a ganho de

47 45 oncogenes. ( ) Diferente dos resultados apresentados, nas SMDs são mais frequentes alterações numéricas, como perda completa ou parcial do cromossomo 5 e/ ou 7, deleções no braço longo do cromossomo 20 e ganho no cromossomo 8. (136,142) Avaliando as neoplasias mieloproliferativas, com exceção da LMC caracterizada pelo cromossomo Philadelphia (Ph), as neoplasias mieloproliferativas clássicas apresentam anormalidades citogenéticas semelhantes, tais como ganho de 1q, +8,+9, del(13q) e/ ou del(20q). ( ) As alterações cromossômicas numéricas e/ ou estruturais são vistas de forma mais equilibrada nessas neoplasias. Os resultados sugerem frequência maior de anormalidades estruturais nas LMA. Comparando-se todas as neoplasias mieloides, este é o grupo com a maior parte de anormalidades específicas e número grande de alterações estruturais, incluindo rearranjos balanceados, como as translocações e inversões: inv(3)(q21.3q26.2) ou t(3;3)(q21.3;q26.2) e t(1;22)(p13.3;q13.1), t(8;21)(q22;q22.3), inv(16)(p13.1q22.1) ou t(16;16)(p13.1;q22.1), t(15;17)(q24.1;q21.2), t(9;11)(p22;q23), t(6;9)(p23;q34.1). (142,145)

48 Tabela 4 Distribuição das alterações citogenéticas mais frequentemente encontradas nas neoplasias hematológicas (HD) do estudo, entre Neoplasias hematológicas (HD) Tipo de alteração citogenética Total Numérica N (%) Estrutural N (%) Num/estrut N (%) N (%) Neoplasias mieloproliferativas 3 (1,9%) 148 (93,1%) 8 (5,0%) 159 (100%) Neoplasias mieloproliferativas /mielodisplásicas 6 (30%) 9 (45%) 5 (25%) 20 (100%) Síndromes Mielodisplásicas 7 (23,3%) 16 (53,3%) 7 (23,3%) 30 (100%) Leucemia Mieloide Aguda (LMA) 3 (12%) 17 (68%) 5 (20%) 25 (100%) Leucemias agudas de linhagens ambíguas (LA) Neoplasias de células precursoras linfoides (LLA) 3 (21,4%) 5 (35,7%) 6 (42,9%) 14 (100%) 0 5 (55,6%) 4 (44,4%) 9 (100%) Neoplasias de células linfoides B maduras 7 (33,3%) 7 (33,3%) 7 (33,3%) 21 (100%) Outras neoplasias hematológicas 3 (42,9%) 2 (28,6%) 2 (28,6%) 7 (100%) Total 32 (11,2%) 209 (73,3%) 44 (15,5%) 285 (100%) N: número amostral; %: porcentual; num: alteração numérica; estr: alteração estrutural

49 47 Nas neoplasias mieloproliferativas, em que 93,1% das alterações citogenéticas foram do tipo estrutural, contabilizaram-se 61 casos (38,7%), de cariótipo feminino, com cromossomo Philadelphia [46,XX,t(9;22)(q34;q11.2)] e 65 casos (40,7%) de cariótipo masculino com cromossomo Philadelphia [46,XY,t(9;22)(q34;q11.2). Cerca de 90-95% dos casos de LMC típica apresentam o cromossomo Philadelphia clássico: t(9;22)(q34.1;q11.2), independentemente do sexo os demais casos, Ph C BCR/ABL1 negativos, são classificados como categoria à parte, LMC atípica. (83,146) Nas neoplasias mielodisplásicas, foram observados 4 casos (20%) de perda de cromossomo Y [45,X,-Y] e, em relação às Síndromes mielodisplásicas, que apresentaram 53,3% de alterações citogenéticas estruturais, foi verificada a presença de inversões com o cromossomo 9 em 2 casos (6,7%) [46,XX,inv(9)(p11q12)] e 2 casos (6,6%) com a presença de cromossomo marcador [47,XY,+mar]. Alguns autores sugerem uma estreita relação entre a perda do cromossomo Y em neoplasias hematológicas e o envelhecimento. Um estudo, realizado com 215 homens com diferentes neoplasias hematológicas (SMDs, anemia refratária, LMC, LMA, doença mieloproliferativa, policetemia vera, leucemia granulocítica crônica e leucemia/ linfoma de células B) e pacientes com idade entre anos, mostrou que a frequência de células em metáfase, com perda de cromossomo Y, aumentava conforme a idade do paciente. (147) A perda de cromossomos Y é um evento considerado relativamente normal em células hematopoéticas, mas a perda desse cromossomo está ligada a um risco maior de desenvolvimento de cânceres e tempo curto de sobrevivência. (148,149) Um estudo com análise de 1153 homens idosos, com perda de cromossomo Y em amostras de sangue periférico, revelou um tempo de sobrevivência de 5.5 anos a menos para os pacientes. Os resultados destacam o impacto do mosaicismo pószigótico no risco da doença e podem explicar o porquê de os homens serem mais afetados pelo câncer. (150) Com referência às Síndromes mielodisplásicas, alguns casos da literatura citam a presença da inversão pericentromérica no cromossomo 9. Pimenova et al. (151) encontraram um paciente com inv(9)(p13q21) em uma análise de 19 pacientes com SMDs e Bacher et al. (152) relataram um caso de paciente de 34 anos

50 48 diagnosticado com citopenia refratária (SMD) e inv(9)(p11q13). A inversão pericentromérica constitucional do cromossomo 9 ocorre frequentemente de 0.8 a 2% da população e é conhecida por ser uma variante populacional normal. Dessa forma, há muita controvérsia na literatura à respeito dessa anormalidade nas neoplasias hematológicas. Enquanto alguns autores afirmam que inv(9) é uma aberração cromossômica randomizada sem efeito aparente funcional entre as desordens hematológicas ou células hematopoéticas, (153,154) outros autores acreditam que essa alteração esteja associada a uma deficiência latente durante a hematopoese. (155,156) Um estudo retrospectivo, de 1964 a 2005, com dados morfológicos, clínicos e citogenéticos de um seguimento de 2124 pacientes com SMDs, provenientes de 4 instituições da Áustria e 4 instituições da Alemanha, demonstrou que, na análise citogenética de 1080 pacientes com SMDs, foi encontrada a presença do cromossomo marcador (+mar) em 5% dos casos, com frequência predominante em cariótipos complexos, de forma semelhante aos dados apresentados pelo nosso trabalho. (127) Um cromossomo marcador é estruturalmente anormal, frequentemente adicional a outros cromossomos. Segundo alguns pesquisadores, 70% dos cromossomos marcadores são originados de eventos de novo (novas mutações) e 30% de herança familiar. (157) O aumento nos casos de hematopatias durante o envelhecimento, em combinação com a expansão da população idosa e a expectativa de vida, pode conduzir a uma frequência maior de malignidades hematológicas nessa faixa etária. As diferenças biológicas entre jovens e idosos, o status geral de saúde dos pacientes idosos, ausência nos tratamentos e monitoramento clínico inadequado contribuem com essa observação. (95) Outro aspecto a ser considerado ao longo do envelhecimento é a queda no número de células-tronco hematopoéticas normais, que possam competir com os clones malignos recém-formados nos cânceres, e que possam repopulacionar a medula óssea, sobretudo, após as terapias e tratamentos. (122) A etiologia das neoplasias hematológicas continua incerta e estudos com referência às causas genéticas e epidemiológicas dessas malignidades são escassos na literatura científica. Os resultados apresentados reforçam a importância do conhecimento do gênero e da idade dos pacientes, como fatores determinantes

51 49 para melhor compreensão da etiologia e dos mecanismos fisiopatológicos dessas doenças. São necessários, no entanto, estudos mais detalhados quanto ao potencial de as alterações citogenéticas serem apenas uma expressão adicional e consequência das instabilidades citológicas típicas dos cânceres hematológicos.

52 50 5 CONCLUSÕES O presente estudo permitiu o conhecimento dos grupos de risco e do perfil citogenético de pacientes com neoplasias hematológicas e seu encaminhamento clínico. Os dados apresentados destacaram a predominância dessas neoplasias na população idosa, servindo como um alerta à saúde e bem-estar dessa faixa etária, mais vulnerável a doenças crônicas, degenerativas e oncológicas. Demonstraram uma prevalência no número de cariótipos normais em relação aos cariótipos com alterações cromossômicas em células cancerígenas Observamos um número alto de cariótipos normais entre os idosos, apesar da literatura reforçar o contrário, ou seja, um aumento no número de alterações cromossômicas com o avançar da idade. É possível concluir que, durante o envelhecimento, ocorre comprometimento fisiológico e declínio progressivo no sistema imunológico e nos mecanismos de manutenção gênica dos indivíduos, assim como aumento das taxas de células mutadas. Essas condições podem favorecer o aparecimento de alterações citogenéticas e, consequentemente, o desenvolvimento de malignidades hematológicas. Nossos resultados demonstraram uma frequência maior de alterações cromossômicas estruturais entre os pacientes diagnosticados com neoplasias hematológicas, seguidas das alterações citogenéticas numéricas/estruturais e alterações numéricas. Sobretudo, a presença predominante de rearranjos balanceados, translocações e inversões, entre as leucemias e as síndromes mielodisplásicas. Os achados ressaltam a ideia de que falhas durante a hematopoese associadas a eventos mutacionais em genes específicos e a inativação de alelos possam estar envolvidos com a origem de anormalidades cromossômicas entre as neoplasias hematológicas e linfoides.

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68 66 APÊNDICE A Processamento de cultura de material oncológico de medula óssea e de sangue periférico para análise citogenética Os procedimentos referentes à contagem de células nucleadas de medula óssea e/ou sangue periférico, semeadura e colheita de cultura e técnica de bandamento G foram realizados a partir dos protocolos descritos no AGT (Association of Genetic Technologists) Cytogenetics Laboratory Manual Third Edition (1997) com modificações. Processamento de cultura de medula óssea e de sangue periférico Contagem de células nucleadas O material foi centrifugado por 8 minutos a 1000 rpm, anotando-se o volume total da amostra. A fase superior (soro) mais a interface (células nucleadas) foram aspiradas com pipeta graduada de 5mL, sendo anotado o volume obtido. A contagem das células nucleadas foi realizada em Câmara de Neubauer e a quantidade total das células nucleadas presentes foi calculada, utilizando a seguinte fórmula: X x 20 x 10 3 x Y, onde : X= número de células nucleadas contadas em 10 quadrantes. Y= volume de células nucleadas. 20= fator de diluição = fator de correção de mm 3 para ml. Semeadura e colheita da cultura celular Foram semeadas aproximadamente 1,0x10 7 células nucleadas por frasco contendo 10mL de meio RPMI1640 (Gibco), sem fitohemaglutinina. Dependendo da quantidade de células presentes, foram preparadas culturas diretas

69 67 (6 horas), de 24 horas e 48 horas (medula óssea), além de 72 horas para amostras de sangue periférico. Todas as amostras foram incubadas em estufa de CO 2 a 37ºC. Vinte minutos antes de completar o tempo de cultivo, foram adicionadas 4 gotas de Colcemide (10 µg/ml) (Gibco), utilizando agulha 26 G½ (concentração final 0,1 g/ml). Após esse período, foi realizada a centrifugação do material por 8 minutos a 1000 rpm e, em seguida, a hipotonização, sendo utilizados 12mL de solução hipotônica KCl (Merck) 0,057 M a 37 ºC por 15 minutos para amostras de medula óssea e dois tratamentos com solução hipotônica KCl 0,075 M para amostras de sangue periférico. Foram adicionados inicialmente 2mL de KCl lentamente; homogeneizadas suavemente e completado o volume para 12mL. Após tratamento com fixador (metanol: ácido acético 3: 1) recém-preparado, o material foi centrifugado por 8 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante foi aspirado, o pellet ressuspendido e foram acrescentados 10mL de fixador. Lentamente, os dois primeiros ml foram adicionados, homogeneizados e foi completado o volume desejado, seguido de nova centrifugação por 8 minutos a 1000 rpm. Esse passo foi repetido por mais duas vezes. Preparo das lâminas e técnica de bandamento G As lâminas foram preparadas por meio de gotejamento do material à distância mínima de 20 cm, com temperatura ambiente controlada (+/- 2) 25 ºC e umidade relativa em torno de 45-50%, sendo envelhecidas a 90 ºC por 1 hora. A técnica de bandamento G foi realizada com o mesmo controle de temperatura e umidade relativa. (69) As lâminas foram tratadas com tampão fosfato 0,06M (Merck) a 37 ºC e lavadas em água corrente, a coloração foi realizada com corante Wright (Merck) diluído em tampão fosfato (0,06 M) (1:3). As lâminas foram novamente lavadas em água corrente e secas à temperatura ambiente.

70 68 Análise citogenética Foram analisadas, aproximadamente, de 10 a 20 metáfases por amostra, com microscópio óptico (Olympus), sob aumento de 1000X, a um nível adequado de resolução de 400 bandas, segundo a Nomenclatura de Citogenética Humana Internacional ISCN (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, 2013). (71) As metáfases de melhor qualidade foram esquematizadas, sendo selecionada a melhor e as que evidenciaram alterações numéricas e/ ou estruturais para captura de imagem pelo software Band View e Image Pro Plus 7.0.

71 69 APÊNDICE B Classificação das hipóteses diagnósticas (HD) Classificação das Neoplasias hematológicas e linfoides, adaptada da classificação OMS, (75,78) 1-Neoplasias mieloproliferativas 4-Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) LMC (BCR-ABL1+) Síndrome Híper-eosinofílica TE-Trombocitemia essencial PV-Policetemia vera Mielofibrose Síndrome Leucoproliferativa LNC-Leucemia Neutrofílica Crônica 2-Neoplasias mieloides e linfoides com eosinofilia e anormalidades dos genes PDGFRA, PDGFRB e FGFRQ1. 3-Neoplasias mieloproliferativas/ mielodisplásicas SM-Síndrome Mieloproliferativa Mielodisplasia LMMC-Leucemia Mielomonocítica Crônica DMPC-Doença Mieloproliferativa Crônica DM-Doença/ neoplasia mieloproliferativa LMC juvenil- Leucemia mielomonocítica juvenil SMD-Síndrome Mielodisplásica Anemia refratária Trombocitopenia refratária Citopenia refratária 5-Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e neoplasias de células precursoras relacionadas LMA-M1 (sem maturação celular) LMA-M2 (com maturação celular) LMA (recidiva) 6-Leucemias agudas de linhagens ambíguas LA (Leucemia Aguda)

72 70 7-Neoplasias de células precursoras linfoides (Leucemias linfoides agudas) LLA-B (leucemia linfoide aguda de células B) LLA-T (leucemia linfoide aguda de células T) LLA (remissão) LLA (recidiva) Leucemias/linfomas linfoblásticos de células T ou B 8-Neoplasias de células linfoides B maduras (leucemia/linfoma de células B linfoblásticas) Tricoleucemia MM-Mieloma Múltiplo Leucemia plasmocítica Linfoma NH (Não-Hodgkin) LLC (Leucemia Linfoide Crônica) Linfoma folicular Linfoma esplênico Linfoma de células do manto Linfoma da Zona Marginal Linfoma folicular refratário Linfoma leucemizado Outras neoplasias hematológicas: 9-Neoplasias de células T ou NK maduras Linfoma anaplásico (de grandes células anaplásicas) Doença linfoproliferativa sistêmica de células T Leucemia prolinfocítica de células T Leucemia linfoproliferativa crônica de células NK 10-Linfoma de Hodgkin (LH) 11-Neoplasias de células histiocíticas e dendríticas 12-Doenças linfoproliferativas associadas à imunodeficiência (DLP-ID) 13-Doenças linfoproliferativas B ou T 14-Linfomas 15-Leucemias

73 71 APÊNDICE C Alterações citogenéticas frequentes nas neoplasias hematológicas em estudo Neoplasias hematológicas (HD) Resultados citogenéticos frequentes Neoplasias mieloproliferativas 46,XX,t(9;22)(q34;q11.2) /61 casos, 38,7% 46,XY,t(9;22)(q34;q11.2) /65 casos, 40,7% 46,XX,t(17;22)(p13;q11) /2 casos, 1.2% 46,XY,inv(9)(p11q12) /5 casos, 3,1% 46,XY,t(9;6;22)(q34.1;q27;q11.2) /1 caso, 0,6% 46,XX,t(9;21;22)(q34.1;p13;q11.2) /1 caso, 0,6% Outros:15,1% Neoplasias mieloproliferativas /mielodisplásicas 45,X,-Y /4 casos, 20% 46,XX,t(9;22)(q34;q11.2) /3 casos, 15% 46,XY,del(5)(q22)/46,XX,del(5)(q13)[4] /2 casos, 10% 46,XX,del(1)(q21)[1]/ 46,XY,del(1) /2 casos, 10% Outros: 45% Síndromes Mielodisplásicas 47,XY,+8/ 47,XX,+8 /2 casos, 6,6% 46,XX,inv(9)(p11q12)[1] /2 casos, 6,7% 47,XY,+mar[2] /2 casos, 6,6% Cariótipos complexos: 6,6% Outros: 73,5% Leucemia Mieloide Aguda (LMA) 46,XX,t(9;22)(q34;q11.2) /1 caso, 4% 46,XY,t (9;22)(q34;q11.2) /2 casos, 8% 46,XX,t(15;17)(q26;q22) /2 casos, 8% 46,XY,t(15;17)(q25;q24) /5 casos, 20% 46,XY,inv(9)(p11q12) /1 caso, 4% 46,XY,der(9) /1 caso, 4%

74 72 Outros: 52% Leucemias agudas de linhagens ambíguas (LA) 46,XX,t(14;18)(q11.1;q11.1) /1 caso, 7,1% 46,XY,t(14;18)(q32;q21) /1 caso, 7,1% 47,XX,+21 /2 casos, 14,2% 46,XX,t(14;18)(q11.1;q11.1) /1 caso, 7,1% 47,XX,+4,t(8;21)(q22;q22) /1 caso, 7,1% Outros: 57,4% Neoplasias de células precursoras linfoides (LLA) Neoplasias de células linfoides B maduras 46,XY,t(11;14)(p13;q11) /1 caso, 11,1% 46,XY,t(8;14)(q24: q32) /1 caso,11,1% Outros: 77,8% 45,X,-Y /4 casos, 19,1% Outros: 80,9% Outras neoplasias hematológicas 45,X,-Y /2 casos, 28,6% Outros: 71,4%

75 73 APÊNDICE D Artigo científico Artigo Original Perfil epidemiológico e citogenético de pacientes com neoplasias hematológicas e sua relação com o envelhecimento Angélica De S. B. M. Alves a; Fernanda Barbi Bataglia a ; Luciene de Oliveira Conterno b ; Rosimeire Segato a ; Spencer Luiz Marques Payão a.,c a Laboratório de Genética, Hemocentro, Faculdade de Medicina de Marília FAMEMA, Marília, SP, Brasil b Faculdade de Medicina de Marília, Unidade de Epidemiologia Clínica, Marilia - Brasil c Universidade do Sagrado Coração USC, Bauru, SP, Brasil Running Title: Perfil epidemiológico e citogenético de pacientes com neoplasias hematológicas e sua relação o envelhecimento * Communicating author: Spencer Luiz Marques Payão, PhD, Laboratório de Genética, Hemocentro, FAMEMA, Rua Lourival Freire, 240, Bairro Fragata, CEP , Marília, São Paulo, Brazil. Phone Number.: ; Fax Number: ; slmpayao@famema.br

76 74 Abstract Introdução As neoplasias hematológicas estão associadas a mutações nas células hematopoéticas e a anormalidades cromossômicas. Durante o envelhecimento, o sistema imunológico dos idosos encontra-se comprometido e a medula óssea perde a capacidade de substituição das células sanguíneas. Objetivo Descrever o perfil epidemiológico e citogenético de neoplasias hematológicas, destacando a frequência das alterações cromossômicas nessas neoplasias, durante o envelhecimento. Método Estudo transversal retrospectivo, com análise de resultados de exames de cariótipo realizados pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Marília-FAMEMA entre os anos de 1998 a 2016, provenientes de pacientes com diferentes neoplasias hematológicas, atendidos pelos Ambulatórios de Oncohematologia adulto e infantil do Hemocentro local, hospitais e clínicas externas. Resultados Foi realizada a análise de resultados de exames de cariótipo de 746 pacientes, com média de idade e desvio-padrão (DP) de 54,7 anos (±23,1). Os idosos apresentaram a maior frequência de neoplasias hematológicas (50,9%), seguido dos adultos (38,3%) e dos jovens (10,7%); sendo que as mulheres idosas tiveram o maior porcentual (55%). Os exames com cariótipo normal (46,XX/ 46,XY) foram mais frequentes entre as neoplasias (61,8%), sobretudo, entre os idosos (56,4%). As Neoplasias Mieloproliferativas foram exceção, com 67,4% dos cariótipos alterados. As alterações cromossômicas estruturais foram prevalentes em 73,3% dos casos. Conclusão Os resultados sugerem um aumento na frequência de neoplasias hematológicas entre os idosos. É possível concluir que falhas nos mecanismos genômicos e na hematopoese, na velhice, conduzem a formação de células com alterações cromossômicas e a origem de neoplasias hematológicas. Palavras-chave: Epidemiologia, Aberrações cromossômicas, Neoplasias hematológicas, Envelhecimento.

77 75 Introdução As neoplasias hematológicas estão frequentemente associadas a mutações ou divisões assimétricas nas linhagens imaturas de suas células hematopoéticas e a anormalidades cromossômicas específicas, numéricas e estruturais como: aneuploidias, deleções, translocações e inversões. (1,2) A primeira alteração cromossômica ligada ao câncer foi identificada em 1960, por Peter Nowell e David Hungerford, quando descobriram o cromossomo Philadelphia (Ph) em amostras de sangue de um paciente com LMC (Leucemia Mielóide Crônica). (3) Desde então, o diagnóstico citogenético de alterações cromossômicas em neoplasias hematológicas vem auxiliando médicos e pesquisadores na classificação, no estadiamento e no prognóstico dessas neoplasias. (4) A idade avançada é apontada, por alguns estudos epidemiológicos, como principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer. (5) Durante o envelhecimento, além do comprometimento do sistema imunológico dos idosos, a medula óssea perde a capacidade de substituição adequada das células sanguíneas. (6) Cerca de 2 a 3% dos idosos apresentam anormalidades cromossômicas originadas de mosaicismo clonal, em amostras de sangue. A presença dessas anomalias está associada a um risco de até 10 vezes maior de desenvolvimento de neoplasias hematológicas. (7) O estudo das alterações citogenéticas na área da oncogeriatria hematológica pode proporcionar um melhor direcionamento terapêutico e individual de pacientes idosos e favorecer a saúde e a qualidade de vida dessa faixa etária, mais susceptível a patologias agressivas. O objetivo desse estudo foi caracterizar o perfil epidemiológico e citogenético de diferentes neoplasias hematológicas, descrevendo a prevalência de alterações cromossômicas numéricas e/ou estruturais nessas neoplasias ao longo do processo de envelhecimento. Métodos Desenho do estudo Estudo transversal retrospectivo baseado na revisão de laudos citogenéticos e resultados de exames de cariótipo realizados pelo Serviço de Citogenética do Hemocentro da Faculdade de Medicina de Marília-FAMEMA de março de 1998 a março de O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local da faculdade (Comitê de Ética e Pesquisa-CEP) e conduzido pelo Laboratório de Genética do Hemocentro-FAMEMA. Material Os resultados dos exames de cariótipo são provenientes de amostras de material oncológico de sangue periférico (OB-Oncology Blood) e medula óssea (BM- Bone Marrow) de pacientes com diferentes neoplasias hematológicas, obtidas pela

78 76 coleta de sangue periférico ou pela punção e aspiração de medula óssea da crista ilíaca ou do osso esterno. A interpretação dos laudos citogenéticos e a classificação dos exames de cariótipo em cariótipos normais ou alterados (alteração cromossômica numérica; alteração cromossômica estrutural e alteração cromossômica numérica e/ ou estrutural) foram realizados segundo a Classificação Citogenética Internacional - ISCN 2013 (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature). (8) População do estudo Laudos de exames de cariótipo de pacientes com neoplasias hematológicas e linfoides, atendidos pelos Ambulatórios de Onco-hematologia adulto e de Oncohematologia infantil do Hemocentro-FAMEMA, Oncologia clínica-hc, Hospital Regional de Assis, Santa Casa e clínicas oncológicas externas, com monitoramento citogenético das neoplasias, em fases diversificadas, conforme a evolução clínica e o prognóstico, divididos em dois grupos, sendo: um grupo de pacientes que realizou o exame de cariótipo por uma única vez no período e um segundo grupo que realizou mais de um exame de cariótipo, ao longo dos anos. A faixa etária dos pacientes foi estruturada de acordo com a classificação do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) e da OMS (Organização Mundial da Saúde): pacientes jovens (0-19 anos), pacientes adultos (20-59 anos) e pacientes idosos (60 anos ou mais). (9,10) Foi considerado, para definição das faixas etárias, a idade do paciente no momento de realização do primeiro exame de cariótipo e diagnóstico citogenético. Critérios de inclusão e de exclusão Pacientes com resultados de exames de cariótipo associados a doenças onco-hematológicas que seguem os critérios de Classificação das neoplasias hematológicas e linfoides da Organização Mundial da Saúde, com base na morfologia e na alteração citogenética específica de cada malignidade foram incluídos no estudo (11,12) : Neoplasias mieloproliferativas; Neoplasias mieloproliferativas/ mielodisplásicas; Síndromes Mielodisplásicas (SMDs); Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e neoplasias de células precursoras relacionadas; Leucemias agudas de linhagens ambíguas (LA); Neoplasias de células precursoras linfoides (Leucemias linfoides agudas); Neoplasias de células linfoides B maduras (leucemia/linfoma de células B linfoblásticas). Outras neoplasias hematológicas: Neoplasias de células T ou NK maduras; Linfoma de Hodgkin (LH); Neoplasias de células histiocíticas e dendríticas; Doenças linfoproliferativas associadas à imunodeficiência (DLP-ID); Doenças linfoproliferativas B ou T; Linfomas; Leucemias. Foram excluídos, os pacientes pós-transplante de medula óssea (PTMO), provenientes de exames particulares, sem identificação da data de nascimento (DN) e da hipótese diagnóstica (HD) da neoplasia e pacientes que apresentavam sintomas ou características associadas as neoplasias, sem referência a patologia específica. Os pacientes não estavam sob tratamento quimioterápico durante a primeira coleta de material oncológico e análise citogenética. Análise estatística

79 77 As variáveis categóricas como os dados demográficos, clínicos e citogenéticos dos pacientes receberam análise descritiva, com descrição das frequências relativas (porcentuais) e absolutas (números absolutos). A média e o desvio-padrão da idade dos pacientes foram determinados, assim como, a frequência das variáveis contínuas. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa estatítico SPSS (Statistical Package for Social Science) versão Resultados A pesquisa envolveu a análise de laudos citogenéticos com resultados de exames de cariótipo de 746 pacientes, com neoplasias hematológicas e linfoides, no momento em que tais pacientes realizaram o primeiro exame de cariótipo para diagnóstico. As informações coletadas estavam armazenadas no banco de dados do Serviço de Citogenéica do Hemocentro-FAMEMA (Arquivo de Exames), desde Dos 746 pacientes envolvidos no estudo, 604 pacientes realizaram o exame por uma única vez e 142 pacientes, que haviam continuado o monitoramento citogenético ao longo dos anos, realizaram o exame de cariótipo por mais de uma vez (Gráfico 1). A figura 1 representa o número de pacientes com neoplasias hematológicas em função do ano de análise do exame de cariótipo, no período Percebe-se que entre os anos de , a participação dos pacientes com neoplasias hematológicas, foi maior, em relação aos anos anteriores. Figura 1 Os pacientes avaliados apresentam média de idade e desvio padrão (DP) de 54,7 (±23,1) anos; sendo 379 do gênero feminino (50,8%). De todas as faixas etárias analisadas pelo estudo, a maior prevalência de neoplasias hematológicas foi encontrada nos idosos (50,9%), seguida da faixa etária dos adultos (38,3%) e dos jovens (10,7%). As mulheres idosas foram diagnosticadas com o maior porcentual de neoplasias hematológicas (55%). Os resultados sugerem uma prevalência no número de cariótipos normais entre os idosos (56,4%), quando comparado aos adultos (32,7%) ou jovens (10,9%) (Tabela 1). Tabela 1 No estudo, a frequência de exames de cariótipo normais (46,XX/ 46,XY), 461 (61,8%), foi maior do que a de exames alterados (alteração cromossômica numérica e/ ou estrutural), 285 (38,2%). As neoplasias Mielodisplásicas, Síndromes mielodisplásicas e neoplasias Linfóides B maduras e LLA evidenciaram cariótipo normal, 82,9%, 79,3%, 76,7%, 75,7%, respectivamente, com exceção das neoplasias Mieloproliferativas, que apresentaram 67,4% dos cariótipos alterados (Tabela 2). Uma análise das hipóteses diagnósticas, por gêneros, mostrou que as Neoplasias mielodisplásicas, as Síndromes mielodisplásicas e as Neoplasias de células precursoras linfoides, como LLA (Leucemia Linfóide Aguda), foram mais comuns entre as mulheres, 53,8%, 68,3% e 54,1%, respectivamente. Já as Neoplasias mieloproliferativas, a LMA (Leucemia Mieloide Aguda) e as Neoplasias de células B maduras foram mais frequentes no gênero masculino, 52,1%, 56,1% e 56,7%, respectivamente (Tabela 2).

80 78 Avaliando as hipóteses diagnósticas em diferentes faixas etárias, observou-se que as neoplasias de células precursoras linfoides, como a LLA, foi mais frequente entre os pacientes jovens, com idade média de 13,4 anos, representando 81,1% dos casos; enquanto as Neoplasias mielodisplásicas, Síndromes mielodisplásicas e Neoplasias linfoproliferativas de células B maduras foram predominantes nos pacientes idosos com porcentual de 70,9%, 81,4% e 66,7% e idade média de 66,1 anos, 67,7 anos e 63,8 anos, respectivamente. Nos pacientes adultos, predominaram as Neoplasias mieloproliferativas e LMA, 58,1% e 57,9%, respectivamente (Tabela 2). Tabela 2 As alterações citogenéticas mais frequentes foram as estruturais, observadas em 73,3% dos casos (209 cariótipos), sendo que ambas, alterações estruturais e numéricas, foram identificadas em 15,5% dos casos (44 cariótipos) (Tabela 3). Entre as neoplasias hematológicas com alteração citogenética estrutural estão: as neoplasias Mieloproliferativas (93,1%), as neoplasias Mielodisplásicas (45%), as Síndromes mielodisplásicas (53,3%) e as LMA (68%). No entanto, as LA (leucemias agudas) apresentaram uma frequência maior de alterações citogenéticas tipo numérica/ estrutural (42,9%)RA, seguida de alterações estruturais (35,7%) e numéricas (21,4%). As neoplasias de células linfóides B maduras apresentaram resultados similares em relação aos três tipos de alterações citogenéticas citadas (33,3%) (Tabela 3). Tabela 3 Discussão Os resultados destacaram a população idosa como a faixa etária mais afetada pelas neoplasias hematológicas. Dados da literatura confirmam essa prevalência entre os idosos. Segundo o projeto HAEMACARE, desenvolvido na Europa, entre , a incidência de malignidades linfoides e neoplasias mieloides tende a aumentar com a idade, alcançando seu pico entre anos. (13) Estudos semelhantes constataram que a probabilidade de ser diagnosticado com alguma malignidade hematológica aumenta em indivíduos com mais de 65 anos. (14) O envelhecimento está associado a modificações estruturais e funcionais fisiológicas, que favorecem o predomínio de doenças crônicas e cânceres entre os idosos. A prevalência no número de neoplasias hematológicas em pacientes mais velhos é resultante da associação de 3 fatores principais: comprometimento fisiológico típico da idade, o estilo de vida moderno e aspectos genéticos. (5) As neoplasias hematológicas são mais agressivas na população idosa, havendo comprometimento da medula óssea e do sistema imunológico. Alterações associadas a hematopoese ineficaz incluem deficiências no sistema imunológico inato (queda na atividade de células natural killers e na fagocitose) e no sistema imune adaptativo (redução de linfócitos B e T). (15) Os resultados desse estudo demonstraram um predomínio de neoplasias hematológicas, sobretudo, em mulheres idosas, 209 casos (55%). Uma das razões é o fato de as mulheres viverem mais do que os homens e a mortalidade do gênero masculino ser superior. A expectativa de vida para os homens, ao atingir 60 anos, é de 8,4 anos e para as mulheres é de 9,1 anos, e a mortalidade por câncer é também

81 79 superior entre os homens quando comparado as mulheres (207.9 por 100,000 homens/ por mulheres). (16) Apesar desse estudo demonstrar uma frequência maior de cariótipos normais entre os idosos, algumas pesquisas apontam um aumento no número de cariótipos com alterações cromossômicas durante o envelhecimento. Dois estudos, conduzidos por pesquisadores do National Cancer Institute (NCI) e Gene Environment Association Studies (GENEVA), vinculados ao National Institute of Health (NIH), demonstraram que as alterações cromossômicas aumentam, conforme o envelhecimento e que a presença de mosaicismo genético, sobretudo em células de idosos, pode predispor esse grupo ao desenvolvimento de cânceres hematológicos (leucemia, linfoma, mieloma). (7,17) O estudo GENEVA, que investigou amostras de sangue de mais de 50,000 participantes, com mosaicismo clonal (duplicações, deleções e dissomia uniparental) em 404 dos pacientes, relatou uma frequência de mosaicismo clonal <0.5% em sujeitos com menos de 50 anos e de 2-3% entre os idosos. (7) A frequência elevada de alterações cromossômicas na velhice pode estar associada ao aumento no número de divisões celulares nos linfócitos e do número de células somáticas com mutações, resultantes do declínio progressivo da manutenção dos mecanismos genômicos, nessa fase da vida. (18,19,20) Um estudo do Hospital de Base de São José do Rio Preto (SP), com análise 51 casos de diferentes tipos de leucemias (LMC/ LMA/ LLA), em 14 anos, demonstrou, que 74% dos pacientes apresentaram anomalias cromossômicas clonais, como translocações, deleções, monossomias e trissomias e apenas 21,6% dos casos, cariótipos normais, ao contrário dos resultados apresentados neste estudo onde foi observada uma frequência maior de cariótipos normais (61,8%). A presença de cariótipos normais não exclui a existência de anormalidades cromossômicas submicroscópicas, dificilmente detectadas com técnicas citogenéticas convencionais. (21) A hipótese mais aceita, sobre a presença de cariótipos normais em células cancerígenas, sugere que essas anormalidades representariam mudanças secundárias a progressão do câncer. (22) Em contrapartida, entre os cariótipos alterados, as alterações cromossômicas estruturais foram mais prevalentes (73,3%). Segundo a base de dados - Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer -, os rearranjos mais comuns nas neoplasias hematológicas são as translocações balanceadas. Logo, as alterações estruturais podem ser consideradas as anormalidades mais frequentes. (2,23) Existem duas hipóteses que explicam o desenvolvimento do câncer a partir de alterações estruturais: a primeira estaria associada a anormalidades constitucionais em genes específicos do câncer e a segunda, à inativação de alelos por mutações. (24) Os resultados observados com referência as neoplasias hematológicas e a faixa etária dos pacientes se assemelham a outros estudos. Segundo a base de dados populacional SEER Cancer Statistics Review, com informações de , a LLA é uma neoplasia mais comum em crianças, adolescentes e jovens adultos e a SMD é uma doença mais frequente em idosos, com idade de anos e anos. Ao contrário dos resultados apresentados, a LMC, entre as neoplasias mieloproliferativas, é conhecida por ser diagnosticada na população idosa, de anos, assim como a LMA, em pacientes com média de idade de 67 anos. (25) Ainda não é possível saber se a associação entre LMC e velhice se deve-se a piora no quadro da doença ou a outros fatores ligados a idade avançada, como: complicações no tratamento, contra-indicações a transplantes de medula óssea e causas de morte diversificadas. (26)

82 80 Com relação a LMA, três hipóteses diferenciam a neoplasia entre jovens ou idosos. Nos jovens, ocorre pelo número restrito de eventos mutacionais limitantes da diversidade dos subclones nas leucemias que são responsáveis por deixar as funções celulares intactas. Nos idosos, eventos mutacionais originam múltiplos subclones leucêmicos com mecanismos de resistência química. A última hipótese estabelece que a natureza da neoplasia é determinada pela idade da célula-tronco hematopoética da leucemia. (27) Conclusão Os resultados sugerem uma frequência elevada de malignidades hematológicas entre os idosos, e uma possível associação do envelhecimento com a origem de alterações citogenéticas nessas neoplasias. Pode-se concluir que, erros nos mecanismos de manutenção gênica e falhas na produção das células sanguíneas pela hematopoiese ligadas a deficiências do sistema imune dos idosos, podem conduzir a formação de células com mutações, em genes e alelos, favorecendo o surgimento de alterações cromossômicas e neoplasias hematológicas nessa faixa etária. Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Aos funcionários do Laboratório de Genética do Hemocentro de Marília pela colaboração com o processamento e a análise do material oncológico: Jamile Lopes, Kênia Patrícia dos Santos do Carmo, Fernanda Miller e com o auxílio em procedimentos burocráticos: Cristielle Azevedo Santos. Esta pesquisa recebeu apoio da Faculdade de Medicina de Marília, FAMEMA Conflito de interesse Os autores declaram nenhum conflito de interesse.

83 81 REFERÊNCIAS 1. Zagozdzon R, Golab J. Cancer stem cells in haematological malignancies. Contemp Oncol. 2015;19(1A):A Mitelman F, Johansson B, Mertens F, editors. Mitelman database of chromosome aberrations in Cancer and Gene Fusions. Bethesda: National Cancer Institute; [cited 2016 Dec 7]. Available from: 3. Nowell PC. Discovery of the Philadelphia chromosome: a personal perspective. J Clin Invest. 2007;117(8): Quixabeira VBL, Saddi V. A importância da imunofenotipagem e da citogenética no diagnóstico das leucemias: uma revisão da literatura. Rev Bras Anal Clín. 2008;40(3): Frizzo MN, Silva FC, Silva AL. Neoplasias hematológicas no idoso: uma revisão. Rev Sau Int. 2016;(8): Hodkinson CF, O'Connor JM, Alexander HD, Bradbury I, Bonham MP, Hannigan BM, et al. Whole blood analysis of phagocytosis, apoptosis, cytokine production, and leukocyte subsets in healthy older men and women: the ZENITH study. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2006;61(9): Laurie CC, Laurie CA, Rice K, Doheny KF, Zelnick LR, McHugh CP, et al. Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer. Nat Genet. 2012; 44(6): Shaffer LG, McGowan-Jordan J, Schmid M, editors. ISCN 2013: an international system for human cytogenetic nomenclature. Basel: Karger Medical and Scientific Publishers; Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Perfil dos idosos responsáveis pelos domicílios no Brasil, 2000 [Internet]. Rio de Janeiro (RJ): IBGE; [citado 6 jun 2016]. Disponível em: pdf 10. World Health Organization. Women s health [Internet]. Geneva; [cited 2016 May 17]. Available from: Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau MM, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016;127(20): Zerbini MCN, Soares FA, Morais JC, Vassallo J, Velloso EDRP, Chauffaille MDLLF, et al. Classificação dos tumores hematopoéticos e linfoides de acordo

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86 84 ANEXO A Protocolo de aprovação pelo CEP- FAMEMA

87 85

88 86 ANEXO B Formulário de requisição médica para análise cromossômica