Avaliação da purificação, das diferentes fracções de globulinas, por SDS-PAGE-R

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1 Avaliação da purificação, das diferentes fracções de globulinas, por SDS-PAGE-R Fez-se a avaliação do grau de pureza das fracções α-vicinina, β-vicinina, δ-vicinina e γ-vicinina, obtidas anteriormente, tendo como controlo a fracção de globulina total, mediante diferentes tipos de géis; PAGE-ND, SDS-PAGE-NR e, SDS-PAGE-R. Para cada um destes métodos de avaliação comprovou-se que, qualquer destas fracções estava purificada Fracções de α-vicinina e β-vicinina As α-vicinina e β-vicinina purificadas foram subsequentemente analisadas por PAGE-ND (Fig.II-1.8A), por SDS-PAGE-NR (Fig.II-1.6B), e por SDS-PAGE-R (Fig.II- 1.8C). O painel A, da Fig.II-1.8, mostra que a mobilidade electroforética da α-vicinina (coluna 3) é superior à da β-vicinina (coluna 2), e o painel B, que é composta por um conjunto de subunidades de 50 a 78 kda (Fig.II-1.9, coluna 3). Após redução, cada uma destas subunidades é cindida numa cadeia polipeptídica maior, de 34 a kda, e numa cadeia polipeptídica menor, de 21 a 23 kda (Fig.II-1.9C, coluna 3), indicando a presença de pontes dissulfureto. O padrão polipeptídico obtido em condições redutoras é essencialmente o mesmo que o referido previamente para a proteína pura, quando usada para substrato das proteinases da semente da Vicia (Becker et al., 1997 e Fisher et al., 00). A β-vicinina, quando analisada por PAGE-ND, revela uma mobilidade electroforética menodo que a da α-vicinina. É contituída por dois polipéptidos maiores, da massa molecular de 58 e kda, sem pontes dissulfureto (Fig.II-1.9B e C, coluna 2). As globulinas totais, quando separadas na sua forma nativa, separam-se em duas bandas distintas, correspondentes à β-vicininas e à α-vicinina, como se pode comprovar na Fig.II-1.9A (coluna 1). Além disso o seu perfil peptídico corresponde ao somatório dos perfís das β-vicinina e α-vicinina, comprovando-se, assim, a purificação das respectivas vicininas. 106

2 A A B B C C Fig.II-1.9- Análise electroforética das globulinas totais e fracções purificadas de sementes de Vicia. Analisaram-se as seguintes fracções de: globulina total (coluna 1), β-vicinina (coluna 2) e α-vicinina (coluna 3) por PAGE-ND (A), SDS-PAGE-NR (B) e SDS-PAGE-R (C). Coluna 0: marcadores de massa molecular (kda). Em cada coluna foram depositados 150 µg (A, coluna 1), 100 µg (A, colunas 2 and 3) ou 50 µ(g (B e C), das respectivas fracções proteicas. 107

3 Fracção de γ-vicinina e δ-vicinina As fracções menos representativas das globulinas totais, γ-vicinina e δ-vicinina foram também separadas e purificadas. A γ-vicinina foi igualmente analisada por PAGE nativo, registando-se uma única banda (Fig.II-1.10A), atestando o grau de pureza da fracção proteica. Quando submetida a SDS-PAGE-NR (Fig.II-1.10B, coluna 1), e a SDS-PAGE-R (Fig.II-1.10B, coluna 1 ), a γ-vicinina revela ser constituída por seis subunidades maiores, de massa molecular 14, 21, 22, 26, 31 e 43 kda (coluna 1). Após redução, exibe revela um padrão polipeptídico ligeiramente diferente, constituído por bandas de 12, 19, 21, 22, 23 e 31kDa, manifestando a existência de pontes dissulfureto. O polipeptído de 23 kda é glicosilado (Fig.II-1.10C, coluna 1). A δ-vicinina revela, em condições desnaturantes e redutoras, a presença de um polipéptido maior, de 47 kda, e de dois péptidos menores, de 33 e 38 kda (Fig.II- 1.11A), sendo estes dois polipétidos glicosilados (Fig.II-1.11B) Avaliação de possíveis contaminações cruzadas por análise 2D Fez-se ainda, uma dupla confirmação, por electroforese bidimensional, do grau de pureza da α-vicinina, da β-vicinina e da γ-vicinina (Fig.II-1.12), de modo a detectar uma possível contaminação cruzada. Para primeira dimensão efectuou-se uma análise electroforética nativa (PAGE-ND) para cada uma das fracções purificadas e, inclusivé, para as globulinas totais (A e B, coluna 1). As bandas proteicas obtidas foram electrotransferidas para membrana de nitrocelulose, que se corou pelo Ponceau S, se cortou e se aplicou a uma 2D, num gel SDS-PAGE-R, 15% (m/v), acrilamida, como ilustra a Fig.II Em todos os casos, o padrão polipeptídico obtido após electroforese bidimensional, foi idêntico ao obtido por SDS-PAGE-R simples, demonstrando que as α-, β- e γ-vicininas estavam, à partida, numa forma purificada. 108

4 1 A kda kda B kda C Fig.II Análise electroforética da γ-vicinina; (A) Coluna 1, análise, efectuada em condições nativas (PAGE-ND); (B) Coluna 1 e 1, análise em condições, desnaturaqntes e não redutoras (NR-SDS- PAGE, B, coluna 1), e em condições desnaturantes e redutoras (R-SDS-PAGE, B, coluna 1 ); (C) Glicodetecção efectuada para os polipéptidos da γ-vicinina, em membrana de nitrocelulose. As colunas 0, são os marcadores de massa molecular. Depositaram-se 50 μg (A, B) e 30 μg (C) de proteína em cada poço, dos respectivos géis. 109

5 1 0 kda A kda B Fig.II Análise electroforética da δ-vicinina. (A) Análise realizada em condições redutoras e desnaturantes (SDS-PAGE-R). (B) Glicodetecção para as δ-vicininas, após transferência do perfil polipeptídico, para membrana. Em cada coluna aplicaram-se 30 µg de proteína, a coluna 0 indica os marcadores de massa molecular. 110

6 Determinação do carácter glicosídico das fracções proteicas purificadas A detecção de glicoproteínas fez-se sobre os polipéptidos constituintes das vicininas, imobilizadas em membrana de nitrocelulose, após electrotransferência de um gel SDS-PAGE-R, como indicado em Métodos. A metodologia empregue na detecção de glicoproteínas (método da con- A/peroxidase proposto por Faye e Chrispeels, 1985) reconhece unicamente glicoproteínas do tipo manose e glucose, uma vez que a concanavalina A liga especificamente moléculas que contêm α-d-manopiranosilo e α-d-glucopiranosilo, assim como resíduos espacialmente relacionados, pelo que existem glicoproteínas não detectáveis por este método. A con-a tem, apesar de tudo, uma abrangência grande na detecção da maioria das glicoproteínas. Estudos efectuados mostraram que os resíduos de manose parecem estar presentes em todas as subunidades glicosiladas das globulinas. As Fig. II-1.10 e Fig.II-1.11 mostram a presença de bandas glicosiladas nas fracções de γ-vicinina (23 kda) e de δ-vicinina (47, 38 e 33 kda), enquanto a Fig.II revela, junto com a δ-vicinina, uma fraca glicosilação das β-vicinina, que tudo Indica ser provocado por uma pequena contaminação desta fracção pela δ- vicinina. A fracção das α-vicinina, não exibe bandas glicosiladas. 111

7 A B C 4 D Fig.II Análise 2D das α-vicinina, β-vicinina e γ-vicinina. Analisaram-se as globulinas totais (coluna 1, A e B), a β-vicinina (coluna 2, A e B), α-vicinina (coluna 3, A e B) e γ- vicinina (coluna 4, C e D), para confirmação da composição polipeptídica. As proteínas foram submetidas a PAGE-ND, transferidas para membrana e coradas pelo Ponceau S (A) e (C). As bandas proteicas foram cortadas, da membrana e aplicadas a uma 2ª dimensão, num gel SDS- PAGE-R, que depois foi corado pelo Coomassie Brillante Blue (B) ou sujeito a coloração pelo nitrato de prata (D). Aplicaram-se 150 µg de proteína, na coluna 1 e, 50 µg nas amostras aplicadas nas colunas 2, 3 e 4. A coluna 0, assinala os marcadores de massa molecular. 112

8 A B δ β 1 β 2 α 1 α 2 0 kda kda δ β 1 β 2 α 1 α , ,4 28,9,6 7,1 Fig.II Detecção das subunidades glicosiladas das δ-vicinina, α-vicinina e β- vicinina. (A) SDS-PAGE-R dos eluídos provenientes da coluna de exclusão molecular, Superose-12, em fase de purificação (Métodos ), que foram electrotransferidos para membrana de nitrocelulose. (B) Glicodetecção das proteínas transferidas, de acordo com o método desenvolvido por Faye e Chrispeels (1985). Depositaram-se 50 µg de cada fracção proteica, nas respectivas colunas, e 10 µl de marcadores de massa molecular, coluna Determinação dos coeficientes de sedimentação para as formas nativas das proteínas α-vicinina e β-vicinina As fracções de α-vicinina e β-vicinina, foram sujeitas, por ultracentrifugação, a um gradiente isopícnico de densidade em sacarose (5% a % (m/v)) de modo a determinar o seu coeficiente de sedimentação. Neste tipo de gradiente as partículas movem-se a uma velocidade constante para uma velocidade fixa de rotação do rotor, independentemente da distância de sedimentação. O coeficiente de sedimentação de proteínas nativas, foi determinado, por comparação com o coeficiente de sedimentação de um padrão, ou por cálculo a partir do conhecimento detalhado das condições de centrifugação (Pombeiro, 1991). O coeficiente de sedimentação de uma proteína é facilmente obtido por comparação da sua posição, no gradiente, com a posição de uma proteína com coeficiente de sedimentação já conhecido, mediante a 113

9 aplicação de duas fórmulas (a) e (b), que relacionam as distâncias de imobilização, da(s) espécie(s) em estudo, com as de padrões de coeficiente de sedimentação conhecido; R = Dd / Dp (a) em que Dd é a distância migrada pela partícula desconhecida e Dp a distância migrada pela proteína padrão (Martin e Ames, 1961). Devido ao facto do movimento de macromoléculas com volume específico ser aproximadamente constante (Martin e Ames, 1961), o sedimento de sedimentação desconhecido é obtido por; R = Sd / Sp (b) em que R resulta da relação obtida em (a) e em que Sd é o coeficiente de sedimentação desconhecido e Sp o coeficiente de sedimentação da molécula utilizada como padrão. A reunião das duas fórmulas resulta na seguinte relação; Cálculos: Dd / Dp = Sd / Sp 1- Para este ensaio construiu-se uma recta de calibração estabelecendo uma relação entre os volumes de sedimentação e os respectivos coeficientes de sedimentação de proteínas padrão: RuBP carboxilase (de Lemna minor, purificada no nosso laboratório), catalase, albumina de soro de bovino, citocromo C (fornecidos pela Sigma) e imunoglobulina G de cabra (purificada no nosso laboratório), com massas moleculares de 532, 232,, 12,4 e 150 kda, respectivamente. Os volumes de sedimentação da RuBP carboxilase, catalase, imunoglobulina G de cabra, albumina de soro de bovino e citocromo C, foram de: 22,3, 15,4, 9,8, 6,9, e 3,9 ml, respectivamente, em relação ao menisco do gradiente. Tendo como base o coeficiente de sedimentação para a catalase de 11,3 S (Martim e Ames, 1961), e utilizando as relações (a) e (b), foi possível calcular os coeficientes de sedimentação para os outros padrões tendo sido obtidos os valores de: 16,3, 7,2, 5,04 e 2,9 S, para a RuBP carboxilase, imunoglobulina G de cabra, albumina de soro de bovino e citocromo C, respectivamente, obtendo-se a seguinte equação de recta: 114

10 y= 21, ,73 χ r = -0, Coeficiente de sedimentação (S) Distância ao menisco (ml) Fig.II Recta de calibração para determinação dos coeficientes de sedimentação das α-vicinina e β-vicinina de Vicia. A recta foi obtida usando os valores dos coeficientes de sedimentação da RuBP carboxilase, Ig G, BSA e citocromo c, obtidos pelas equações (a) e (b), e da catalase obtido por Martin e Ames (1961). 2- Depositaram-se 1,5 a 3,0 mg de proteína nativa purificada (α- e β-vicinina em tampão fosfato 0,035 M, ph 7,6, contendo β-mercaptoetanol 0,01 M e NaCl 0,4 M) no topo do gradiente de sacarose (5 a % (m/v)) e, centrifugou-se durante 22 h, a g a 4 ºC, na ultracentrífuga Optima XL-90 da Beckman, num rotor basculante SW-28. Foram colhidas fracções de 1 ml, sempre com leitura da absorvência a 280 nm e realização de SDS-PAGE-R, de modo a haver certificação do gradiente em que as proteínas se imobilizavam. Os valores dos coeficientes de sedimentação obtidos para as amostras proteicas de α-vicinina e β-vicinina, foram calculados a partir da equação da recta de calibração. Os volumes de eluição obtidos para a α-vicinina e β-vicinina, foram de 19 ml e 15 ml, respectivamente, para um volume total de gradiente de 34,5 ml, em que χ = 34,5 (volume em que saiu o pico). Assim, para a fracção da α-vicinina purificada, y= 21, ,73 (34,5 ml vol. pico) 115

11 obteve-se um coeficiente de sedimentação de 10,6 S, sendo esta fracção constituída por um grupo de subunidades de massa molecular de 50 a 78 kda, enquanto que para a β-vicinina se obteve-se um coeficiente de sedimentação de 7,7S, sendo esta fracção constituída por dois polipéptidos de massa molecular de 58 e kda. Qualquer destes valores está em concordância com os valores normalmente descritos na literatura, para a fracção proteica maioritária, das proteínas de reserva do tipo legumina (globulinas 11S) e do tipo vicilina (globulinas 7S) (Duranti e Gius, 1997) Estudo das propriedades hemaglutinantes do extracto total, fracção de albuminas, globulina total e fracções purificadas de δ-vicinina, β-vicinina e α- vicinina da semente seca de Vicia Determinou-se a actividade hemaglutinante para as diferentes amostras proteicas da V., na forma de extracto total e de fracção purificada. Da observação da Fig.II-1.15, representativa de um teste de hemaglutinação em microplaca, verifica-se que a globulina total exibe um apreciável poder hemaglutinante (U.H.= 53 μg /ml) relativamente à fracção purificada da β-vicinina (U.H= 476 μg /ml), que tem uma actividade fraca, podendo ser produto de uma possível contaminação com a δ-vicinina, que exibe uma forte actividade hemaglutinante. A fracção purificadada de α-vicinina (coluna D, diluições 1 a 10) não revela qualquer poder hemaglutinante. A B C D E Fig.II Avaliação do poder hemaglutinante das principais fracções proteicas constituíntes das globulinas de Vicia. A cada poço da placa aplicaram-se 70 μl de soro fisiológico e 70 μl de eritrocitos a 4% (v/v). Na coluna 1 aplicaram-se 100 μg de cada amostra, no volume de 70 μl. As colunas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 representam diluições sucessivas (1:3) dos 100 μg de proteína. As colunas horizontais A, B, C, D e E representam o controlo + (Con-A, 70 μg), globulina total, a β-vicinina, a α-vicinina e o controlo - (soro fisiológico), respectivamente. 116

12 Resultados apresentados relativamente à actividade hemaglutinante manifestada pelo extracto proteico total, pela fracção de albuminas totais e pela δ-vicinina, revelaram óbvia actividade hemaglutinante, tendo-se obtido as seguintes concentrações mínimas de actividade hemaglutinante: extracto proteico total, 1 U.H.=1,2 µg (5,71 µg / ml), fracção de albuminas totais, 1 U.H.= 2,22 µg (10,57 µg / ml) e δ-vicinina, a fracção com maior actividade, 1 U.H.= 0,137 µg (0,65 µg / ml). Tendo por base, os resultados obtidos, para o extracto proteico total e, albuminas totais, iniciou-se o estudo da inibição da actividade hemaglutinante pelos açúcares Estudo da inibição, pelos açúcares, da actividade hemaglutinante das proteínas do extracto total e da fracção de albuminas da semente seca de Vicia Os testes de especificidade aos açúcares determinaram-se por incubação, de 4 U.H da proteína a ser testada, com uma bateria de 15 açúcares, cada um deles diluído seriadamente de 1:3. Testou-se uma série de açúcares (fornecidos pela Sigma, salvo as excepções assinaladas) de concentração 0,1 M: 1- glucose, 2- glucosamina, 3- N- acetil-d-glucosamina, 4- galactose, 5- galactosamina (fornecido pela Calbiochem), 6- N- acetil-d-galactosamina, 7- lactose, 8- manose, 9- rafinose, 10- L-fucose (fornecido pela Fluka), 11- melezitose, 12- metil-α-glucopiranosído, 13- metil-α-manosído, 14- sacarose e 15- maltose. A tabela II-1.2 mostra o registo obtido para os ensaios de inibição pelos açúcares, da actividade hemaglutinante, para a fracção de albuminas totais e extracto proteico total, da Vicia. Para os açúcares que inibem a actividade hemaglutinante os resultados estão em concordância com a literatura descrita (Falasca et al., 1979; Gebaur et al., 1979), com excepção para a N-acetilglucoseamina para o extracto total e da sacarose para o extrato total e fracção de albuminas. A lectina isolada da Vicia por Gebauer e colaboradores (1979) e caracterizada por Falasca et al. (1979), de massa molecular de 40 kda, exibe, além da especificidade para a manose/glucose, uma tendência para outros açúcares, que também se revelaram bons inibidores: metil-α-manosídeo, metilα-glucopiranosídeo, sacarose, glucosamina, frutose e melezitose, sendo o último trissacárido o melhor inibidor (Falasca et al. 1979; Gebauer et al., 1979). 117

13 Para os açúcares que manifestam inibição da actividade hemaglutinante, nem sempre são os mesmos açúcares os que conferem inibição para as diferentes amostras ensaiadas. Para o extracto total encontra-se maior número de açúcares que provoca inibição, comparativamente à fracção de albuminas, podendo levar a pensar na existência de tipos distintos de lectinas no extrato total. Para os açúcares que provocam, simultâneamente, inibição para as duas amostras proteicas, (manose, Tabela II-1.2: Inibição pelos açúcares da actividade hemaglutinante das proteínas do extracto total e da fracção de albuminas de Vicia fracção de albuminas Açúcares concentração inicial (0,1 M) Mínima conc. de Máxima conc. açúcar inibitória de proteína extracto proteico total Mínima conc. de açúcar inibitória Máxima conc. de proteína inibida (μg/ml) inibida (μg/ml) glucose ,1 M 32 glucosamina ,1 M 32 N- acetil-glucosamina mm 32 galactose galactosamina N-acetil-galactosamina lactose manose 0,1 M mm 32 rafinose fucose melezitose 3,7 mm mm 32 metil-α-glucopiranosído 0,1 M 59 0,1 M 32 metil-α-manosído 33 mm mm 32 sacarose maltose 0,1 M A aglutinação foi ensaiada, como descrito em Métodos, frente a uma suspensão a 4% (v/v) de eritrocitos de coelho e segundo diluições seriadas do açúcar de 1:3. A concentração proteica usada, previamente estabelecida nos ensaios de hemaglutinação para cada uma das proteínas testadas, foi de 4 U.H. para cada açúcar e diluição ensaiada. (----) significa que o açúcar não provocou inibição da hemaglutinação melezitose, metil-α-glucopiranosído e metil-α-manosído), a melezitose é sem dúvida o açúcar com efeito inibitório máximo, inibindo na concentração de 3,7 mm. 118

14 Sequenciação da δ-vicinina A forte actividade hemaglutinante, evidenciada por este polipéptido, tornou óbvia a necessidade da sua sequenciação. Fez-se a sequenciação do seu N-terminal, por degradação de Edman, tendo-se sequenciado 13 resíduos aminoacídicos N terminais. 1 KSQSHPPKPBLLV 13 A pesquisa na base de dados NCBI (BLASTP ) (Altschul et al., 1997), revela alguma identidade, por vezes de 100%, para algumas proteínas. Para a Vitis vinífera, encontrou-se para a sequência dada, identidade em algumas regiões, da ordem dos 87%, 80% para uma hipotética proteína de Oryza e, 100% para uma Peptidase A1 de Medicago truncatula, e conglutina gama de Lupinus angustifolius (BLASTP ), com uma identidade de 58%. A título de exemplo, mostram-se os registos das identidades encontradas (ver Anexo). As identidades encontradas, encontram-se distribuídas de uma forma abrangente para fungos, parasitas, bactérias e enzimas (tendo em atenção a totalidade de identidades encontradas), apesar, de se ter encontrado homologias com a Vitis vinífera, Oryza e Medicago truncatula, respectivamente; vinha, arroz e luzerna, o que permite estreitar a relação com estas espécies, bastantes diferentes. A Vitis vinífera (para resíduos de aminoácidos), foi a espécie que revelou identidade mais extensa, tendo-se estabelecido homologia entre os seguintes resíduos de aminoácidos: 21 a, 2 a 9, 9 a 4, 494 a 501, 499 a 506 e, 13 a. Também, para o fungo patogénico, Phaeosphaeria nodorum, responsável por necrose, no trigo e milho, encontrou-se identidade da ordem dos 77%. A identidade encontrada, por vezes, para espécies filogeneticamente distantes, tem sido referida cientificamente. Chapot et al. (1986) identificaram, a sequência N-terminal das lectinas de Oryza (arroz) e Urtica dioica (urtiga) e, estabeleceram as identidades existentes entre estas lectinas e o monómero da lectina WGA (do inglês, wheat germ agglutinin), tendo-se revelado uma identidade extensa. A homologia encontrada entre a lectina de urtiga e do trigo, revela o mesmo terminal amino. Este estudo sugere assim, as extensas homologias que poderão existir entre lectinas de cereais e, outros grupos de plantas, de origem não-leguminosa. 119