Estudo Fitoquímico e Avaliação da Capacidade Leishmanicida de Espécies Vegetais do Cerrado-TO

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1 Estudo Fitoquímico e Avaliação da Capacidade Leishmanicida de Espécies Vegetais do Cerrado-TO Jacqueline P. Cursino 1 ; Márcio G. dos Santos 2 1 Aluno do Curso de Ciências Biológicas; Campus de Porto Nacional; jacquelinejackpereira@hotmail.com PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Ciências Biológicas; Campus de Porto Nacional; galdino@uft.edu.br RESUMO: O estudo da capacidade de tratamento de doenças por espécies vegetais, utilizadas pela medicina popular, configura-se em um atalho na pesquisa alternativa para o tratamento de doenças, neste caso, a leishmanioses. O teste de triagem para avaliação da atividade leishmanicida dos extratos hidroalcoólicos preparados a partir da entrecasca de Dipterix alata (Vog.) e das folhas de Sipurana guianensis Aubl. foram testadas in vitro utilizando formas promastigotas de Leishmania amasonensis. Os extratos foram diluídos em DMSO e posteriormente em meio de cultivo do parasito nas concentrações de 500 a 0.97 μg/ml, a partir do qual foi analisado qual concentração foi capaz de deter 100% dos parasitos. A atividade citotóxica foi avaliada em cultura de PEC (células do exsudato peritonial). A espécie D. alata apresentou eficiência contra 100% das formas amastigotas na concentração de 125 μg/ml, já a espécie S. Guianenses não apresentou eficiência em nenhuma das concentrações usadas. Porém, o extrato de D. alata apresentou um considerável efeito citotóxico, comprometendo sua utilização in vivo. Segundo a literatura, do sub-extrato diclorometânico de D. alata foi isolado e identificado tritepernóides, isoflavonóides, chalconas, aurona e compostos fenólicos. Palavras chaves: triagem; Dipterix alata Vog.; Siparuna guianenses Aubl.OPEN ACCESS INTRODUÇÃO As leishmanioses são um grupo de doenças endêmicas causadas por protozoários do gênero Leishmania, transmitidas através da picada da fêmea de insetos hospedeiros infectados, flebotomíneos hematófagos (Ordem Díptera, Família Psychodidae, Sub-família Phlebotominae), manifestando-se sob várias formas clínicas, dependendo da virulência da espécie infectante, suscetibilidade do hospedeiro e co-infecções. A droga de primeira escolha é o antimonial pentavalente, Sb +5, havendo drogas alternativas como stibugluconato de pentamidina e anfotericina B, utilizadas nas formas rebeldes ao tratamento convencional. As dificuldades em relação à terapêutica atual têm conduzido a estudos com o objetivo de avaliar terapias alternativas, como a fitoterapia (PHILLIPSON; WRIGHT, 1991 a, b). A busca de novas drogas anti-leishmaniais tem levado a um grande interesse no estudo de medicamentos tradicionais como origem de protótipos para o desenvolvimento de novos compostos quimioterápicos com melhor atividade e menos efeitos colaterais (ARAÚJO et al., 1998). O uso de plantas no tratamento da Leismaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma prática antiga entre as populações das áreas endêmicas ( FOURNET et al., 1992; MOREIRA et al., 1998; 2002). Porém, esses tratamentos são empíricos e pouco se sabe sobre sua real eficácia, uma vez que a LTA pode ocorrer a cura espontânea das lesões (MARSDEN et al., 1984; COSTA et al., 1990; ROSSEL et al., 1992; MARSDEN, 1994), o que torna-se necessário estudos científicos sobre essas plantas para comprovar, ou não, sua real eficácia. A paisagem do Cerrado possui grande biodiversidade, pouco afetado até a década de 1960, está desde então crescentemente ameaçado, seja pela instalação de cidades e rodovias, seja pelo

2 crescimento das monoculturas, como soja e o arroz, a pecuária intensiva, a carvoaria e o desmatamento causado pela atividade madeireira e por frequentes queimadas, devido às altas temperaturas e baixa umidade, quanto ao infortúnio do descuido humano. Considerando a diversidade da flora do Cerrado bem como o imensurável potencial de produtos naturais bioativos da mesma e, concomitantemente, as devastações que estão ocorrendo nesse bioma, torna-se necessário o seu estudo, visto que existe a possibilidade da cura de várias doenças, como a leishmaniose, ser produzida por alguma planta que pode estar sendo ameaçada de extinção, como é o caso das espécies vegetais Dipteryx alata Vog. e Siparuna guianensis Aubl., conhecidas popularmente como baru e negramina, respectivamente, plantas encontradas no Cerrado, ameaçadas de extinção que tiveram sua atividade leismanicida (triagem), e citotoxidade testadas neste trabalho. MATERIAIS E MÉTODOS Preparação dos extratos vegetais hidroalcoólicos O material vegetal foi seco à uma temperatura média de 60 0 C durante sete dias, em seguida triturado e posteriormente dissolvido em solução etanólica (etanol/água 70/30, v/v). Após três dias a solução foi filtrada e concentrada em Evaporador Rotativo (MARCONI, Mod. MA120-TH), posteriormente o extrato bruto foi liofilizado (LIOTOP/ Mod. L101) por cerca de 24 horas até obtenção do extrato em pó. Atividade leishmanicida (Triagem dos compostos) Os extratos vegetais foram enviados para o Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia da FIOCRUZ Rio de Janeiro, onde foi realizado os procedimentos para o teste de triagem frente às formas promastigotas do parasita L. amazonensis. Inicialmente foi calculada a concentração necessária para preparar uma solução com o dobro da maior concentração da solução de teste (ST), 125 μg/ml, sendo o dobro 500μg/mL, a partir do qual foi pesado quantidade referente à concentração 100 vezes mais concentrada, 50 mg, e diluído em 1 ml de DMSO. Para realização da triagem os extratos foram diluídos na proporção 1:100, isto é, 10 μl da solução DMSO em 990 μl de meio. Essa solução foi utilizada para a realização das diluições seriadas, o que resultou nas seguintes concentrações: 500 μg/ml, 250 μg/ml, 125 μg/ml, 60.5 μg/ml, μg/ml, μg/ml, 7.81 μg/ml, 3.90 μg/ml, 1.95 μg/ml e 0.97 μg/ml. Como droga de referência, utilizou-se a Anfotericina B, em diluição seriada a partir do dobro da concentração referente ao IC 50 (concentração inibitória de 50% dos parasitos). Como controle utilizou-se 100 μl de meio e 100 μl de cultura, e nos poços Branco 200 μl de meio diluídos em triplicata. Para a realização do preparo da cultura foi feito a contagem de formas promastigota entre 2 a 4 dias de passagem. Foram utilizadas as culturas de 10 6 parasitos por ml, pipetou-se 100 μl da cultura de promastigota com 10 6 por ml em cada poço exceto nos poços Branco. A placa foi mantida em estufa BOD a 24ºC durante 24 horas. Após esse período, cada poço foi observado em microscópio invertido, sendo classificados de acordo com a mortalidade dos parasitos. Foi identificado em qual concentração os extratos foram capazes de matar 100% dos parasitos. Atividade citotóxica in vitro Camundongos foram estimulados pela inoculação intraperitoneal de 3 ml de tioglicolato de sódio. Foram injetados 5,0 ml de solução salina tamponada com fosfatos (PBS) estéril em ph 7,2 e

3 a 4 C na região do peritônio na porção mediana superior do abdome. As células coletadas foram centrifugados a 2000 rmp por 5 min, e posteriormente lavadas com 5mL de PBS (ph 7,2) e centrifugadas a 2000rpm por 5 minutos à temperatura ambiente. As células sedimentadas foram ressuspendidas em 1,0 ml de meio de cultura RPMI-1640 Completo (RPMI-1640-C) e ajustadas à concentração de 5x10 6 células/ml. Para o ensaio de citotoxidade foi utilizado o método de MTT de acordo com o descrito por Mosmann (1983). 100 μl de suspensões de PEC foram adicionados em placas de 96 cavidades (Corning), durante uma hora. Posteriormente foi feita a reposição do meio RPMI-C acrescentando 100 µl em cada poço e depois 100 μl do extrato bruto em diferentes concentrações: 8 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625mg/mL, 0,03125 mg/ml, 0, mg/ml, e 100 μl de meio de cultura RPMI As placas foram incubadas em estufa a 37 0 C com 5% de CO 2 e após 24 horas descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 100 μl de solução de MTT (AcrossOrganics) sobre a cultura celular a 0,5 mg/ml em RPMI-1640, retornado assim à estufa a 37 0 C com 5% de CO 2 durante 3 horas. A leitura foi feita em espectrofotômetro UV/Visível (MultiskanAscent, LabsystemsResearch Tech. Div., Helsinki, Finland) a 540nm com filtro de referência a 620nm (MOSMANN, 1983). A concentração inibitória que reduz 50% da viabilidade celular foi calculado através da equação da reta gerada (GraphPadPrism5) quantificada por regressão linear (concentração X viabilidade celular) com limite de confiança de 95%. RESULTADOS E DISCURSÃO A atividade leishmanicida de extratos vegetais tem sido demonstrada por muitos investigadores. O entusiasmo em relação ao uso de plantas medicinais e seus extratos na assistência à saúde podem ser entendidos pela sua aceitabilidade, derivada da inserção cultural e pela atual disponibilidade desses recursos, ao contrário do que ocorre com outros medicamentos, que na sua maioria são dependentes de matéria-prima e tecnologias externas (SCHENKEL et al., 1985; SIMÕES et al., 1986). Neste trabalho foi realizado apenas uma triagem para identificação de atividade leishmanicida das plantas em estudo, de modo que ao final do teste, identificou-se as concentração capaz de inibir 100% das formas promastigotas de Leishmania amazonensis em um período de 24 horas. Sendo que, os extratos da entrecasca de D. alata e das folhas de S. guianensis, apresentaram as concentrações tóxicas para os parasitos de 125 μg/ml e >500 μg/ml, respectivamente. A espécie vegetal D. alata apresentou um melhor resultado, visto que nem mesmo a maior concentração usada de S. guianensis para a avaliação foi capaz de deter 100% dos parasitos. Quanto a citotoxidade a espécie D. alata Vog. apresentou uma concentração tóxica necessária para matar 50% de células do exsudato peritonial de 0,249 ± 0,018 mg/l. Comparando as citotoxidades da espécie D. alata em g/l, temos: citotoxidade para PEC (IC 50), 0,000249g/L e citotoxidade para 100% das promastigotas, 0,125g/L. Segundo a literatura, foi isolado e identificado do sub-extrato diclorometânico da espécie D. alata, quatro triterpenóides do tipo lupano, nove isoflavonas, uma chalcona, uma aurona e três compostos fenólicos (PUEBLA et al., 2010). Os resultados do presente trabalho demonstram que mesmo o extrato da espécie D. alata apresentando uma citotoxidade considerável para o parasito, a concentração necessária para inibi-lo é altamente tóxica para os macrófagos, de modo que a utilização desta planta in vivo torna-se problemática uma vez que iria comprometer as células sadias. Produtos naturais têm um grande potencial na pesquisa por novos e seletivos agentes para o tratamento de importantes doenças causadas por protozoários (WRIGHT; PHILLIPSON, 1990). Apesar dos estudos nesta área estarem crescendo cada vez mais, ainda existe muitas plantas a serem

4 avaliadas. LITERATURA CITADA ARAÚJO, C.A.C.; ALEGRIO, L.V.; LEON, L.L. Antileishmanial activity of compounds extracted and characterized from Centrolobiumsclerophyllum. Phytochemistry, v. 49, n. 3, p , COSTA, J.M.L.; VALE, K.C.; FRANÇA, F.; SALDANHA, A.C.R.; SILVA, J.O.; LAGO, E.L.; MARSDEN, P.D.; MAGALHÃES, A.V.; SILVA, C.M.P.; NETTO, A.S.; GALVÃO, C.E.S. Cura espontânea da leishmaniose causada por Leishmania (Viannia) braziliensis em lesões cutâneas. RevSocBrasMedTrop v. 23, p , FOURNET, A.; BARRIOS, A.A.; MUÑOZ, V.; HOCQUEMILLER, C.A. Effects of natural naphtoquinones in Balb/c mice infected with Leishmaniaamazonensis and L. venezuelensis. Ann TropMedParasit, v. 43, p , MARSDEN, P.D. Personal experience with diagnostic and therapeutic aspects of human Leismania (Viannia) braziliensis in TrêsBraços. Mem I Oswaldo Cruz, v. 89, p , MARSDEN, P.D.; TADA, M.S.; BARRETO, A.C.; CUBA, C.C. Spontaneous healing of Leishmania braziliensis braziliensis skin ulcers. Trans Royal Soc Trop Med Hyg, v. 78, p , MOREIRA, R.C.R.; COSTA, J.M.L.; SALDANHA, A.C.; SILVA, A.R. Projeto Buriticupu Maranhão II. Plantas usadas como terapêutica da leishmaniose tegumentar americana na região de Buriticupu-Maranhão. RevSocBrasMedTrop, v. 31(Supl. I): T248, p. 126, MOREIRA, R.C.R.. REBÊLO, J.M.M.; GAMA, M.E.A.; COSTA, J.M.L. Nível de conhecimento sobre Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e uso de terapias alternativas por populações de uma área endêmica da Amazônia do Maranhão, Brasil. Caderno de Saúde Pública, v. 18, p , MOSMANN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival. J. Immunol. Methods, v. 65, p , PHILLIPON, J.D.; WRIGHT, C.W. Medicinal plants in tropical medicine: Medicinal plants, against protozoal diseases. Trans Royal Soc Trop Med Hyg, v. 85, p , 1991a. PHILLIPSON, J.D.; WRIGHT, C.W. Antiprotozoal agents from plant sources. Planta Med, v.57, p , 1991b.

5 PUEBLA, P.; OSHIMA-FRANCO, Y.; FRANCO, L.M.; SANTOS, M.G.; SILVA, R.V.; RUBEM-MAURO, L.; FELICIANO, A. S.. Chemical Constituents of the Bark of Dipteryx alata Vogel, an Active Species against Bothrops jararacussu Venom. Molecules, v. 15, p , ROSSEL, R.A.; DURAN, R.J.; ROSSEL O.; RODRIGUES,A.M. Is leishmaniasis ever cured? Trans Royal Soc Trop Med Hyg, v. 86, p , SCHENKEL, E.P.; SIMÕES, C.M.O.; MENGUE, S.S.; MENTZ, L.A.; IRGANG, B.E.; STEHMANN, J.R. O espaço das plantas medicinais e suas formas derivadas na medicina científica. Caderno de Farmácia,v. 1, p , SIMÕES, C.M.O.; MENTZ, L.A.; SCHENKEL, E.P.; IRGANG, B.E.; STEHMANN, J.R. Plantas da medicina popular no Rio Grande do Sul. Porto Alegre: Editora da Universidade UFRGS, WRIGHT, C.W.; PHILLIPSON, J.D. Natural products and the development of selective antiprotozoal drugs.phytother, v. 4, p , AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico- CNPq- Brasil, Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia FIOCRUZ Rio de Janeiro, RJ, e Laboratório de Patologia Molecular Universidade Estadual do Maranhão, São Luis, MA.