AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTILEISHMANIA IN VITRO DE NOVOS DERIVADOS QUINÓNICOS SEMI-SINTÉTICOS SOBRE FORMAS PROMASTIGOTAS DE LEISHMANIA MAJOR

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1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTILEISHMANIA IN VITRO DE NOVOS DERIVADOS QUINÓNICOS SEMI-SINTÉTICOS SOBRE FORMAS PROMASTIGOTAS DE LEISHMANIA MAJOR SOUSA, V.C 1 ; SANTOS, I.L 1 ; SANTOS, R.R.L 1 ; CARNEIRO, S.M.P 1 ; CARVALHO, F.A.A 1 ; GONSALVES, A.A 2 ; GUIMARÃES, D.G 2 ; ARAÚJO, C.R.M 2 ; COSTA, M.P 1 RESUMO UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO 2 Introdução: As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por aproximadamente 20 espécies e subespécies de protozoários do gênero Leishmania. Estão entre as doenças mais negligenciadas do mundo e são transmitidas aos humanos e a outros mamíferos a partir da picada da fêmea de flebotomíneos. O presente trabalho objetivou investigar a atividade antileishmania de novos derivados quinônicos semi-sintéticos (MDH2 e MDH4), em sigilo de patente, sobre formas promastigotas de Leishmania major. Metodologia: Formas promastigotas na fase logarítmica de crescimento foram plaqueadas na quantidade de 1x10 6 por poço, em placa de 96 poços contendo os derivados quinônicos em diluições seriadas (2 a 0,0009 µg.ml -1). Em seguida, foram incubadas em estufa de demanda biológica de oxigênio (B.O.D. ) a 26 C, durante 48 h. A citotoxicidade foi avaliada pelo método colorimétrico da Resazurina, no qual foram adicionados 20 µl desse corante em cada poço na concentração de 1 mm, e incubados por mais 6 horas, seguido da leitura espectrofotométrica a 550 nm. A concentração inibitória 50 (CI 50 ) foi obtida através do cálculo de regressão de probitos. Resultados e discussão Os derivados quinônicos demonstraram potencial contra as formas promastigotas do parasita, apresentando ação dose-dependente. As CI 50 das quinonas MDH2 e MDH4 para L. major foram de 0,447 e 0,031 µg.ml -1, respectivamente. Conclusão: Em se tratando de substâncias com potencial leishmanicida, estes derivados quinônicos são promissores, devido aos resultados leishmanicidas iniciais. Portanto, os novos derivados quinônicos demonstraram potencial citotoxicidade contra formas promastigotas, porém investigações futuras devem ser feitas para avaliar seu potencial citotóxico sobre células de mamíferos, bem como elucidar seus mecanismos de ação. Palavras-chave Leishmaniose; Lutzomyia; Quinonas.

2 ABSTRACT Introduction: Leishmaniasis is a parasitic disease caused by approximately 20 species and subspecies of protozoa of the genus Leishmania. They are among the most neglected diseases in the world and are transmitted to humans and other mammals from the bite of the female phlebotomine. The present work aimed to investigate the antileishmania activity of new semisynthetic quinone derivatives (MDH2 and MDH4), in patent secrecy, on promastigote forms of Leishmania major. Methodology: Promastigote forms in the logarithmic growth phase were plated in the amount of 1x10 6 per well in a 96-well plate containing the quinonic derivatives in serial dilutions (2 to μg.ml-1). Afterwards, they were incubated in a biological oxygen demand oven (B.O.D. ) at 26 C for 48 h. Cytotoxicity was evaluated by the Resazurina colorimetric method in which 20 μl of this dye was added to each well at 1 mm concentration and incubated for a further 6 hours followed by spectrophotometric reading at 550 nm. Inhibitory concentration 50 (IC50) was obtained by calculating probit regression. Results and discussion: Quinone derivatives have demonstrated potential against the promastigote forms of the parasite, presenting dose-dependent action. The CI 50 of the quinones MDH2 and MDH4 for L. major were and μg.ml -1 respectively. Conclusion: In the case of substances with leishmanicidal potential, these quinonic derivatives are promising due to the initial leishmanicidal results. Therefore, the novel quinone derivatives demonstrated potential cytotoxicity against promastigote forms, but future investigations should be made to evaluate their cytotoxic potential on mammalian cells as well as to elucidate their mechanisms of action. Keywords - Leishmaniasis; Lutzomyia; Quinones INTRODUÇÃO As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por aproximadamente 20 espécies e subespécies de protozoários do gênero Leishmania. Estão entre as doenças mais negligenciadas do mundo e são transmitidas aos humanos e a outros mamíferos a partir da picada da fêmea de flebotomíneos pertencentes aos gêneros Phlebotomus ou Lutzomyia (ORYAN; AKBARI, 2016; WHO, 2015). Em seu ciclo evolutivo a Leishmania assume duas formas morfológicas principais: amastigota e promastigota. As amastigotas são intracelulares obrigatórias, encontradas nas células do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados, possuem formato arredondado, sem flagelo livre e medem cerca de 3 a 5 µm de comprimento. Já as promastigotas são extracelulares, encontradas no trato digestivo dos flebotomíneos, são formas alongadas, móveis, apresentam flagelo livre e medem cerca de 15 a 20 µm de comprimento (MONTEIRO, 2013). Dentro do contexto de novas alternativas terapêuticas sintéticas para as leishmanioses destacam-se as quinonas, um grupo de substâncias orgânicas

3 geralmente coloridas e semivoláteis, onipresentes na natureza e pertencentes à classe dos Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos Oxigenados (HPAO). A estrutura das quinonas apresenta dois grupamentos carbonilas em um anel insaturado de seis átomos de carbono, situados relativamente em posições orto (adjacentes) ou para. Utilizando-se como critério o tipo de sistema aromático, as quinonas são classificadas como benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas e fenantraquinonas. Em estudos farmacológicos as quinonas mostram variadas biodinamicidades, destacando-se, dentre muitas, as propriedades microbicidas, tripanossomicidas, viruscidas, antitumorais e leishmanicidas (TUKAJ; AKSMANN 2007). Nesse contexto o objetivo desse estudo foi avaliar a atividade antileishmania in vitro de novos derivados quinônicos semi-sintéticos sobre formas promastigotas de Leishmania major. METODOLOGIA O ensaio foi realizado com formas promastigotas de Leishmania major em fase logarítmica de crescimento. Os parasitos foram semeados em placas de cultivo celular de 96 poços contendo meio Schneider s suplementado, na quantidade de Leishmania/100 µl de meio. Em seguida as substâncias MDH2 e MDH4 foram adicionadas aos poços em duplicata e realizadas diluições seriadas, atingindo doze faixas de concentrações desejadas [2 µg/ml -1 ]. A placa foi incubada em estufa de demanda bioquímica de oxigênio (B.O.D.) a temperatura de 26 ºC por 48 h, restando 6 h para o término deste período, foram adicionados 20 µl de resazurina mol/l, quando incubou-se novamente a placa. A leitura da placa foi realizada num leitor de placas de absorbância - Biotek (modelo ELx800), no comprimento de onda de 550 nm, e os resultados foram expressos em termos de inibição do crescimento (%). O controle positivo foi realizado com 2 µg/ml de anfotericina B (Anf B) diluído em meio Schneider s contendo promastigotas por poço. Já o controle negativo equivaleu ao meio Schneider s contendo promastigotas por poço e, neste caso, a viabilidade foi de 100% para o parasito. A leitura do branco, para cada concentração e para os controles, fez-se necessária para desprezar a absorbância resultante do próprio meio com interferência ou não dos compostos estudados (SOARES et al., 2007; VALADARES et al., 2011). A concentração inibitória médias (CI50) com limite de confiança de 95%, foram calculadas utilizando regressão de probitos do programa SPSS Foram realizadas análises de variância ANOVA seguida pelo teste de Bonferroni, através de programa estatístico específico, tomando-se o valor de p < 0,05 como nível máximo de significância estatística. RESULTADOS E DISCUSSÃO As substâncias testadas apresentaram potencial citotóxico para as formas promastigotas de L. major dependente da concentração. As concentrações inibitórias 50 (CI50) obtidas estão descritas na tabela 1.0: Substância CI50

4 L. Major MDH2 0,447 MDH4 0,031 Tabela 1 Concentração inibitória (CI50) em µg.ml -1 promastigotas de Leishmania major. Significância: (p <0,05). dos derivados quinônicos sobre formas A figura 1 mostra que houve quase 100% de inibição de crescimento das formas promastigotas de L.major na concentração de 2 µg/ml -1 na presença dos compostos MDH2 e MDH4. Sendo o MDH4 mais potente apresentando menor viabilidade da promastigota nas concentrações testadas. Dessa forma, de acordo com a tabela 1 observou-se que as quinonas sintéticas testadas apresentam atividade antileishmania considerável sobre as formas promastigotas, segundo Silva et al., (2003) a citotoxicidade ocasionada sobre L.major pode ser atribuída ao núcleo quinonóide (estrutura básica das quinonas), este núcleo é sustentado por anéis aromáticos em que as alterações na posição das carbonilas resulta em alteração significativa nas propriedades físico químicas e biológicas, que pode ser intensificado de acordo com os grupos químicos presentes em cada molécula (MDH2 e MDH4). Além disso, um outro possível mecanismo a ser considerado é a capacidade de redução dessas quinonas por flavoenzimas celulares ou a redução das carbonilas presentes que ativam a saída de grupos abandonadores presentes no núcleo quinoide resultando na destruição do parasita. Com isso, os níveis de inibição podem ser atribuídos as características intrínsecas de cada molécula, tornando-a mais potente contra as formas promastigotas de determinada espécie. As diferenças na atividade dos compostos quinônicos contra ambos os parasitas também podem ser correlacionadas às condições de cultura, uma vez que a literatura relata que as promastigotas de cada espécie possuem uma sensibilidade variada a quantidade de soro fetal bovino, esse fato resultaria em uma menor disponibilidade do composto, uma vez que algumas proteínas séricas ou proteínas da urina poderiam se agregar com o fármaco testado. Esse fato pode explicar a diferença obtida entre as cepas testadas. Além disso, considerando que ambos os parasitas têm suas próprias características metabólicas, seria esperado uma diferença na atividade de diferentes compostos (DA SILVA et al., 2002).

5 Figura 1 - Atividade antileishmania dos derivados quinônicos sobre formas promastigotas de L. major. Os parasitas (1 x 10 6 ) foram expostos a diferentes concentrações das substâncias por 48h e a viabilidade celular foi avaliada por ação da Resazurina. MDH2 e MDH4 *P<0.05; **P<0.01 vs. controle; ***P<0.001 vs. Controle. CONCLUSÕES Os derivados quinônicos testados apresentaram considerável atividade citotóxica contra as formas promastigotas de L. major nas concentrações usadas. A diferença de inibição de crescimento pode ser atribuída as características intrínsecas de cada molécula. Portanto, são necessários mais ensaios para comprovar sua atividade em formas amastigotas de macrófagos murinos na busca de esclarecer seu mecanismo de ação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS MONTEIRO, D.C.S. Prevalência de leishmaniose visceral assintomática em doadores de sangue, em área endêmica do Ceará. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Ceará- Faculdade de Medicina, Departamento de Patologia e Medicina Legal, Programa de Pós Graduação em Patologia, Fortaleza, ORYAN, A.; AKBARI, M. Application of nanotechnology in treatment of leishmaniasis: A Review. Acta Tropica, v. 172, n.4 p , SILVA, M. N.; FERREIRA, V. F.; SOUZA, M. C. B. V. Um panorama atual da química e da farmacologia de naftoquinonas, com ênfase na β Lapachona e derivados. Química Nova, Niterói, v. 26, n. 3, p , SILVA, E.D.; CANTO-CAVALHEIRO, M.M.; BRAZ, V.R.; CYSNEFINKELSTEIN, L.; LEON, L.L.; ECHEVARRIA, A. Synthesis and biological evaluation of a new 1,3,4-

6 thiadiazolium-2-phenylamine derivatives against Leishmania amazonensis promastiogtes and amastigotas. Eur J Med Chem, v. 37, n.1, p , SOARES, D. C. et al. Leishmanicidal activity of a supercritical fluid fraction obtained from Tabernaemontana catharinensis. Parasitol Int, v. 56, n. 2, p , TUKAJ, Z.; AKSMANN, A. Toxic effects of anthraquinone and phenanthrenequinone upon Scenedesmus strains (green algae) at low and elevated concentration of CO2. Chemosphere, v. 66, n.2 p. 480, VALADARES, D. G. et al. Leishmanicidal activity of the Agaricus blazei Murill in different Leishmania species. Parasitol Int, v. 60, n. 4, p , WHO. World Health Organization. Investing To Overcome the Global Impact of Neglected Tropical Diseases