AVALIAÇÃO DE CASPASE 3/7 E TUNEL UTILIZANDO NITENSIDINA B ISOLADA DE Pterogyne nitens

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1 XI CURSO DE INVERNO DE GENÉTICA FCAV/UNESP AVALIAÇÃO DE CASPASE 3/7 E TUNEL UTILIZANDO NITENSIDINA B ISOLADA DE Pterogyne nitens CASPASE 3/7 AND TUNEL ASSESSMENT USING NITENSIDINE B ISOLATED FROM Pterogyne nitens Cristiane Randisk Loriano (1) Felipe de Oliveira Souza (2) Resumo O câncer de colo de útero é o terceiro tumor mais frequente na população feminina, e a quarta causa de morte de mulheres por câncer no Brasil. Estudos epidemiológicos e moleculares demonstraram que o principal fator etiológico do câncer cervical é o vírus HPV, Papilomavírus Humano, e pelo menos 13 tipos de HPV são considerados oncogênicos, sendo a infecção por esses tipos o maior fator de risco para o desenvolvimento de lesões malignas no colo uterino. Os produtos naturais têm contribuído intensamente para o desenvolvimento da terapêutica moderna, de modo que, cerca de 70% das drogas disponíveis na quimioterapia podem ser consideradas inspiradas em produtos naturais. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo verificar a atividade citotóxica de nitensidina B, um alcaloide guanidínico isolado de Pterogyne nitens, uma planta distribuída do sudeste ao sul do Brasil. A citotoxicidade foi avaliada em experimentos in vitro, utilizando células de carcinoma cervical (linhagens SiHa e C33A, imortalizada e não imortalizada pelo HPV-16, respectivamente). O ensaio realizado foi sulforrodamina B, no qual foi possível observar um padrão de morte concentração-dependente nas duas linhagens celulares analisadas, estatisticamente significativos em relação ao veículo (DMSO 1%). Palavras-chave: Câncer cervical. Citotoxicidade. HPV. Nitensidina B. Sulforrodamina B. Abstract Cervical cancer is the third most common tumor in the female population, and the fourth cause of death of women for cancer in Brazil. Molecular and epidemiological studies demonstrated that the main etiological factor for cervical cancer is the HPV virus, human papillomavirus and at least 13 types of HPV are considered oncogenes, and infection these types the greatest risk factor for the development of malignant lesions cervix. Natural products have contributed extensively to the development of novel therapeutic, so that about 70% of the drugs in chemotherapy can be considered inspired in natural products. Thus, this study aimed to verify the cytotoxic activity of nitensidine B, a guanidinic alkaloid isolated Pterogyne nitens, a plant distributed Southeast south of Brazil. Cytotoxicity was assessed by in vitro experiments using cell cervical carcinoma (SiHa and C33A lines, immortalized and non-immortalized by HPV-16, respectively). The sulforhodamine B assay was performed in which we observed a pattern of concentration-dependent death in both cell lines analyzed, statistically significant versus vehicle (1% DMSO). Keywords: Cervical cancer. Cytotoxicity. HPV. Nitensidine B. Sulforhodamine B. (1) Aluna de graduação do curso Farmácia-Bioquímica pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas - FCFAr/Unesp, Araraquara-SP. contato: crisrandisk@hotmail.com. (2) Doutorando em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAr/Unesp, Depto de Análises Clínicas, Araraquara-SP. contato: felipeoliveira065@gmail.com.

2 1 Introdução Câncer refere-se ao termo neoplasia, caracterizada pela proliferação descontrolada de células transformadas (ALMEIDA et al., 2005). O câncer cervical, ou câncer de colo uterino, tem como principal fator etiológico o vírus HPV, Papilomavírus Humano (NAKAGAWA et al., 2010). Pelo menos 13 tipos de HPV são considerados oncogênicos, apresentando maior risco ou probabilidade de provocar infecções persistentes e estarem associados com alterações no colo do útero, chamadas lesões precursoras. Dentre os de alto risco oncogênico, os tipos 16 e 18 do HPV estão presentes em 70% dos casos de câncer cervical (INCA, 2015). Em 2012, segundo a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer, o câncer de colo de útero foi o quarto tipo de câncer mais comum entre as mulheres, com uma estimativa de 265 mil mortes para o mesmo ano (IARC, 2015). A nitensidina B é um alcaloide guanidínico isolado de estruturas da Pterogyne nitens (Fabaceae), que apresenta atividade citotóxica sobre linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae e sugere uma potencial atividade antitumoral (REGASINI et al., 2008). O presente trabalho teve por objetivo verificar a atividade citotóxica de nitensidina B in vitro, utilizando linhagem de carcinoma cervical imortalizada pelo HPV-16 (SiHa-ATCC: HTB-35) e não imortalizada pelo HPV (C-33A-ATCC: HTB-31). 2 Materiais e métodos O processo de obtenção da nitensidina B foi realizado no Instituto de Química, UNESP-IQ, Araraquara-SP. Uma exsicata da Pterogyne nitens (SP204319) encontra-se depositada no Instituto Botânico, São Paulo SP, Brasil. As linhagens foram cultivadas em uma mistura 1:1 (v/v) DMEM e Ham s F10 (Sigma Co., St. Louis, EUA) acrescido de 100U/mL de penicilina, 100µg/mL de estreptomicina, 0,25µg/mL de anfotericina B, 0,1mg/mL de kanamicina (Sigma) e 10 % de soro fetal bovino (Cultlab, Campinas, Brasil). Para o tratamento das linhagens foram utilizadas diferentes concentrações da nitensidina B, variando entre 7,5µM a 120,0µM, em tempo de tratamento 24 de horas. O controle positivo foi realizado com a exposição a 90,0µM de doxorrubicina e para as células controle de veículo foi utilizado dimetilsulfóxido (DMSO) a 1%. A Sulforrodamina B (SRB) é um corante que se combina às proteínas, e quando fixado, é medido fotometricamente após solubilização, correlacionado com a taxa de síntese protéica total e, em seguida, com a proliferação celular (metodologia conforme o Kit sigma-aldrich S1402).

3 % céls vivas As análises estatísticas foram realizadas com software GraphPad Prism Versão 5.01 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA), utilizando-se o teste oneway ANOVA com pós-teste de Tukey (Tratados vs CV). 3 Resultados e Discussão A citotoxicidade da nitensidina B sobre as células cervicais foi avaliada nas concentrações: 7,5µM, 15µM, 30µM, 60,0µM e 120,0µM. As devidas quantidades do composto foram solubilizadas em meio de cultura e aplicadas nas duas linhagens celulares estudadas (SiHa e C-33A), por 24 horas, determinando o CI 50 (concentração do composto capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular). Figura 1 Ensaio de citotoxicidade (Sulforrodamina B). Nitensidina B em linhagem celular SiHa nas concentrações de 7,5µM, 15,0µM, 30,0µM, 60,0µM e 120,0µM em 24 horas de tratamento. Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e erro padrão (M ± EP). DOXORRUBICINA (controle positivo a 90µM) e DMSO (controle de veículo a 1%). Oneway ANOVA com pós-teste de Tukey (Tratados vs CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 p < 0, SiHa DOXORRUBICINA DMSO (1%) 7,50 15,0 30,0 60,0 120,0

4 % de céls vivas Em relação à linhagem celular SiHa (infectada pelo vírus HPV16) foi possível observar um aumento da citotoxicidade em uma resposta concentração-dependente, de forma que, nas concentrações de 30µM, 60,0µM e 120,0µM, a citotoxicidade apresentou-se significantemente maior em relação ao controle de veículo (DMSO a 1%) e o CI50 foi de 40,98µM. Figura 1 Ensaio de citotoxicidade (Sulfarrodamina B). Nitensidina B em linhagem celular C-33A nas concentrações de 7,5µM, 15,0µM, 30,0µM, 60,0µM e 120,0µM em 24 horas de tratamento. Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e erro padrão (M ± EP). DOXORRUBICINA (controle positivo a 90µM) e DMSO (controle de veículo a 1%). Oneway ANOVA com pós-teste de Tukey (Tratados vs CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 p < 0, C-33A 100 ** 50 0 DOXORRUBICINA DMSO (1%) 7,50 15,0 30,0 60,0 120,0 No estudo da linhagem C-33A (não infectada pelo vírus HPV16) foi possível observar uma diminuição da citotoxicidade da nitensidina B, como demonstrado na figura 2. A comparação com o resultado obtido para as células tratadas com DMSO 1% (controle de veículo) demonstra que a significância estatística apresentou-se menor, uma vez que apenas nas maiores concentrações testadas (60,0µM e 120,0µM) com o alcaloide estudado, houve um número relevante de morte desta linhagem de células cervicais. A concentração inibitória de 50% das células (CI 50 ) encontrada foi de 90,17µM.

5 4 Conclusão O alcaloide guanidínico nitensidina B, extraído de Pterogyne nitens, apresentou citotoxicidade concentração-resposta nas linhagens de carcinoma cervical imortalizada pelo HPV-16 (SiHa) e não imortalizada (C-33A). Observou-se que a nitensidina B induziu citotoxicidade proporcionalmente ao aumento da concentração nas duas linhagens celulares estudadas, sendo esta maior na linhagem celular SiHa em relação a C-33A. Tal resultado sugere possível seletividade da nitensidina B para as células infectadas por HPV 16, um dos principais tipos de vírus de alto risco associados com lesões pré-cancerosas, sendo responsável por 90% dos casos de câncer cervical no mundo (PSYRRI; DIMAIO, 2008). Referências ALMEIDA, V. L.; LEITÃO, A.; REINA, L. C. B.; MONTANARI, C. A.; DONNICI, C. L.; LOPES, M.T.P. Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-celular não específicos que interagem com o DNA: uma introdução. Química Nova, v.28, n.1, p , IARC, INTERNATIONAL AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER. GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in França. Disponível em: < Acesso em: 13 Maio INCA, INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA. HPV e câncer - Perguntas mais frequentes. Rio de Janeiro. Disponível em: < Acesso em: 13 Maio NAKAGAWA, J.T.T.; SCHIRMER, J.; BARBIERI, M. Vírus HPV e câncer de colo de útero. Revista Brasileira de Enfermagem, v.63, n.2, p , PSYRRI, A.; DIMAIO, D. Human papillomavirus in cervical and head-and-neck cancer. Nature Clinical Practice Oncology, v.1, n.5, p.24-31, REGASINI, L.O.; FERNANDES, D.C.; CASTRO-GAMBOA, I.; SILVA, D.H.S.; FURLAN, M.; BOLZANI, V.S.; BARREIRO, E.J.; CARDOSO-LOPES, E.M.; YOUNG, M.C.M.; TORRES, L.B.; VELLOSA, J.C.R.; OLIVEIRA, O.M.M. Constituintes químicos das flores de Pterogyne nitens (caesalpinioideae). Química Nova, v.31, n.4, p , TUKEY, J. Comparing Individual Means in the Analysis of Variance. Biometrics, v.5, n.2, p