Investigação da ação do DMSO em células humanas normais e de câncer de colo de útero

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1 Investigação da ação do DMSO em células humanas normais e de câncer de colo de útero Investigation of the action of DMSO on normal and cervical cancer human cell lines Myllena Mayla Santos de Oliveira (1) Flavia Cristina Rodrigues-Lisoni (2) Resumo O carcinoma de colo de útero afeta grande parte da população mundial e, se não tratado, pode levar a morte. O tratamento desse tumor inclui cirurgia, terapia por irradiação e quimioterapia. Entretanto estes métodos são altamente invasivos, podendo causar lesões estéticas irrecuperáveis, com um significativo comprometimento funcional. Em função disso, algumas plantas vêm sendo utilizadas no tratamento do câncer e uma delas tem despertado interesse científico, a Piper cubeba. Porém, as lignanas da Piper cubeba são diluídas em Dimetilsulfóxido (DMSO), que é considerado citotóxico em quantidades ainda não bem especificadas. Em função disso, o presente trabalho foi proposto com o objetivo geral de avaliar o efeito do DMSO, em diferentes concentrações, sobre a morfologia, proliferação e citotoxicidade, observando como esse composto age e como essas alterações podem participar do processo tumorigênico. Para isso foram utilizadas, uma linhagem humana de células tumorigênicas de colo de útero e uma linhagem humana de células normais, que foram tratadas com DMSO em diferentes concentrações e comparadas com um experimento controle, sem o DMSO. Nas duas linhagens celulares estudadas, a morfologia não se alterou e houve a diminuição da proliferação celular nas concentrações de 1% após 48 horas, e de 5 e 10% nas contagens de 4, 24, 48 e 72 horas. Foi citotóxico a partir de 48 horas em todas as concentrações, na linhagem humana de células normais. Palavras-chave: Morfologia. Proliferação. Citotoxicidade. Abstract Cervical carcinoma affects a large part of the world's population and, if left untreated, can lead to death. Treatment of this tumor includes surgery, radiation therapy, and chemotherapy. However, these methods are highly invasive and can cause irrecoverable aesthetic lesions with significant functional impairment. As a result, some plants have been used in the treatment of cancer and one of them has aroused scientific interest, Piper cubeba. However, Piper cubeba lignans are diluted in Dimethylsulfoxide (DMSO), which is considered to be cytotoxic in amounts not yet well specified. As a result, the present work was proposed with the general objective of evaluating the effect of DMSO, in different concentrations, on morphology, proliferation and cytotoxicity, observing how this compound acts and how these alterations can participate in the tumorigenic process. 1 Graduanda em Ciências Biológicas pela Unesp/FEIS, myllenaharuno@gmail.com; 2 Professora Doutora em Ciências Biológicas/Genética. Departamento de Biologia e Zootecnia, Unesp/FEIS, lisoni@bio.feis.unesp.br

2 A human lineage of tumorigenic uterine cervix cells and a human normal cell line, which were treated with DMSO at different concentrations and compared to a control experiment, without DMSO, were used. In the two cell lines studied, the morphology did not change and there was a decrease in cell proliferation at 1% concentrations after 48 hours, and at 5 and 10% at the 4, 24, 48 and 72 hours counts. It was cytotoxic from 48 hours at all concentrations, in the human cell line of normal cells. Keywords: Morphology. Proliferation. Cytotoxicity. 1. Introdução O carcinoma de colo de útero afeta grande parte da população mundial e, se não tratado, pode levar a morte. O tratamento desses tumores inclui cirurgia, terapia por irradiação e quimioterapia. Entretanto, esses métodos são altamente invasivos, podendo causar lesões estéticas irrecuperáveis, com um significativo comprometimento funcional (KAWECKI;KRAJEWSKI, 2014). Em função disso, algumas plantas vêm sendo utilizadas no tratamento do câncer e uma delas tem despertado interesse científico, a Piper cubeba. Porém, as lignanas da Piper cubeba são diluídas em Dimetilsulfóxido (DMSO) que é considerado citotóxico em quantidades ainda não bem especificadas. O DMSO é um solvente polar e aprótico que tem sido empregado como ingrediente inativo em vários produtos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA). Também é um eliminador de radicais livres que atua no transporte de membrana, solubilidade em água e é agente de diferenciação com uma respectiva atividade anti-neoplásica (MICKEY et al., 1989). Além disso, é um antioxidante exógeno devido à sua capacidade de reagir com radicais de hidroxila e apresenta uma alta solubilidade sobre diversos compostos (ALEMÓN-MEDINA et al., 2008, p. 713). Em função disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do DMSO, em diferentes concentrações, sobre a morfologia, proliferação e citotoxicidade nas linhagens de células humanas de câncer de colo de útero (SiHa) e células normais (HaCaT), observando como esse composto age e como essas alterações podem participar do processo tumorigênico. 2. Materiais e Métodos 2.1 Linhagem celular Foram utilizadas uma linhagem tumorigênica de carcinoma de colo de útero (SiHa) e uma linhagem de células normais de queratinócitos da pele humana (HaCaT), cedidas gentilmente pela Profa. Dra. Eloiza Helena Tajara da Silva, Faculdade de Medicina de São

3 José do Rio Preto/FAMERP, SP e Profa. Dra. Andréia Machado Leopoldino da USP/Ribeirão Preto, SP, respectivamente. 2.2 Dimetilsulfóxido Esse composto foi utilizado na concentração absoluta (PA) da marca Merck, nas concentrações de 1, 5 e 10 % do volume total do meio de cultura adequado para cada tipo celular. 2.3 Cultivo e Análise da Morfologia Celular A linhagem celular SiHa foi semeada em meio completo (MEM) e a HaCaT (DMEM), ambos suplementados com 10% de soro bovino, 10mM aminoácidos não essenciais, 100mM piruvato de sódio, 100µg/mL de antibiótico/antimicótico) e mantidas a 37 C e atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas, até se fixarem no substrato. Após esse período, o meio foi trocado a cada dois ou três dias, ou até se tornar confluente. A morfologia celular foi avaliada diariamente em microscópio invertido e, quando a densidade celular se mostrou alta, o material foi submetido à tripsinização e subdividido em duas réplicas. 2.4 Índice de proliferação celular Os tempos de contagem para a realização do Índice de proliferação celular foi realizado em 4, 24, 48 e 72 horas após o tratamento com o DMSO. Para cada linhagem celular foram realizados quatro experimentos, um experimento controle (sem tratamento) e três tratados com diferentes concentrações de DMSO (1, 5 e 10 %). As células foram cultivadas em placas de cultura de 24 poços, semeadas na concentração de 1x10 4 em 300µL de meio MEM (SiHa) e DMEM (HaCaT) com 10% de soro fetal bovino e mantidas a 37 C em câmara úmida e atmosfera com 5% de CO2, por 48 horas, até se fixarem no substrato. Após esse período, o meio de cultura foi substiuído por meio de cultura sem soro (MEM/DMEM 0%), a fim de deixar todas as células na mesma etapa celular. Após 24 horas foi trocado o meio de cultura, substituído de acordo com os experimentos referidos acima. No dia zero do experimento, o meio sem soro foi substituído pelo meio completo e adicionado o DMSO nas concentrações desejadas. Após 4 horas de experimento, as células dos primeiros poços da placa foram tripsinizadas e contadas em câmara de Neubauer (hemocitômetro). As células dos outros poços foram tripsinizadas e contadas após 24, 48 e 72 horas do experimento, o qual foi realizado em duplicatas.

4 Todos os procedimentos de cultivo celular foram realizados em fluxo laminar bidirecional, específico para esse fim, para manutenção da esterilidade dos materiais, bem como para evitar a contaminação das culturas Ensaio de citotoxicidade Para a linhagem celular HaCaT foram realizados quatro experimentos, um experimento controle (sem tratamento) e três tratados com diferentes concentrações de DMSO (1, 5 e 10 %), nos tempos de 4, 24, 48 e 72 horas. O ensaio foi realizado utilizando o reagente MTS CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (PROMEGA, USA). O ensaio com MTS, 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2h-tetrazólio, é um método colorimétrico que avalia quantitativamente a viabilidade celular/citotoxicidade. Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços em uma concentração celular de 5x10 3 células/ml num volume total de 100uL de meio DMEM com 10% de soro fetal bovino e mantidas a 37 C em câmara úmida e atmosfera com 5% de CO2, por 24 horas, até se fixarem no substrato. Após esse período, o meio de cultura foi substituído por meio de cultura sem soro (DMEM 0%), a fim de deixar todas as células na mesma etapa celular. Após 24 horas foi trocado o meio de cultura, substituído de acordo com os experimentos referidos acima. Nesse dia zero do experimento, o meio sem soro foi substituído pelo meio completo e adicionado o DMSO nas concentrações desejadas. Após 4h de experimento foi adicionado 20ul de reagente MTS (de acordo com o protocolo do fabricante). A leitura foi realizada após 4 horas de incubação do reagente (na estufa a 37 C, CO2 a 5%, umidificada) em leitor de ELISA no comprimento de onda de 492nm (Polaris), sendo esse ensaio realizado em duplicata. As células dos outros poços foram mantidas para a continuação do experimento nos tempos de 24, 48 e 72 horas, no qual as células receberão o MTS para a leitura em espectrofotômetro. Após esse ensaio de citotoxicidade será aplicado o teste estatístico para a análise da viabilidade celular versus concentração, bem como o cálculo do IC50 (Concentração Inibitória para 50% das células), os valores de absorbância obtidos no tratamento com os compostos (A), serão normalizados para os valores obtidos com o solvente (B) para obtenção da porcentagem de viabilidade celular (C) através da equação: C = A/B x 100 para todas as concentrações estudadas, no qual o tempo e o número de células viáveis serão avaliados para

5 sabermos qual dará uma maior diferença estatística significativa em relação à viabilidade celular. 3 Resultados e Discussão 3.1 Morfologia Celular A morfologia das células SiHa e HaCaT (Figura 1) é caracterizada por células pequenas com um citoplasma escasso, núcleo grande e nucléolos evidentes, com aspecto variando de estrelado a fusiforme, e geralmente se encontram agrupadas pois dependem de adesão celular para o crescimento. Após os tratamentos com as diferentes concentrações de DMSO não houve modificação da morfologia celular. A Figura 1: Microscopia óptica: análise da morfologia da linhagem celulares SiHa (A) e HaCaT (B) sem tratamento, em aumento de 10X. B 3.2. Índice de Proliferação Celular No experimento de curva de crescimento (Figura 2 e 3), foi possível observar o efeito inibidor do crescimento celular pela ação do DMSO em relação às células sem o tratamento (controle). Ao que tudo indica, quando usado, o DMSO causa morte celular, fazendo com que o crescimento dessas células diminua. A concentração de 1% reduziu o crescimento das células nomais e tumorigênicas a partir da contagem de 48 horas, nas concentrações de 5 e 10% houve uma redução na proliferação das células das duas linhagens em todos os tempos de contagem. Para análise da linhagem tumorigênica (SiHa) tratada com DMSO (figura 2), observase no tempo de 4 horas, em relação ao controle uma maior proliferação das células tratadas com DMSO a 1%, já nas concentrações de 5 e 10% houve uma grande diminuição no crescimento dessas células, no tempo de 24 horas o controle e o tratado a 1% não apresentaram diferenças significativas, mas em relação ao controle e as tratadas a 5 e 10% houve uma relevante diferença

6 na proliferação. Para os tempos de 48 e 72 horas de tratamento, observa-se uma diminuição na proliferação celular para todas as concentrações, quando comparadas ao controle. Nota-se que o DMSO, nas células tratadas, passa a afetar consideravelmente, a partir do tempo de 48 horas e que não altera diretamente na concentração de 1%, nos tempos de 4 e 24 horas. S ih a n. c é lu la s x c o n tro le 6 0 D M S O 1 % D M S O 5 % 4 0 D M S O 1 0 % h 2 4 h 4 8 h 7 2 h te m p o (h o r a s ) Figura 2. Gráfico representativo do ensaio de proliferação celular da linhagem celulare SiHa. Células tratadas com DMSO a 1, 5 e 10%. vs controle, p <0.05. Para análise da linhagem de células normais de queratinócitos da pele humana (HaCaT) tratadas com DMSO (figura 3), nos tempos de 4 e 24 horas, o controle e o tratado a 1% não apresentaram diferenças significativas, já nas concentrações de 5 e 10% houve uma grande diminuição no crescimento dessas células. Para os tempos de 48 e 72 horas de tratamento verifíca-se uma diminuição na proliferação celular para todas as concentrações, quando comparadas ao controle. Nota-se que o DMSO, nas células tratadas, passa a afetar consideravelmente, a partir do tempo de 48 horas e que não altera diretamente na concentração de 1%, nos tempos de 4 e 24 horas.

7 H a C a T C o n t r o l e n. c é l u l a s x D M S O 1 % D M S O 5 % D M S O 1 0 % h 2 4 h 4 8 h 7 2 h T e m p o ( h o r a s ) Figura 3. Gráfico representativo do ensaio de proliferação celular da linhagem HaCaT. Células tratadas com DMSO a 1, 5 e 10%. vs controle, p <0.05. Podemos inferir, a partir do ensaio de proliferação celular e análise dos gráficos, que as concentrações que mais alteraram a proliferação celular foram 5 e 10% e os tempos de experimento de 48 e 72 horas, causando uma redução da proliferação. Nossos dados corroboram com os resultados de Abreu Costa e colaboradores (2017), que também observaram uma diminuição da proliferação celular e na produção de citocinas em culturas de linfócitos periféricos quando tratados com DMSO. Os relatos na literatura de inibição do crescimento celular após o tratamento com DMSO são antigos, que envolvem desde células de melanoma até adenocarcinoma retal humano (Huberman et al.,1979; Tsao et al., 1982). Em linhagem celular de colo de útero, também foi mostrado que o DMSO suprimiu a proliferação celular, diminuiu os níveis de dois fatores pró-angiogênicos (substância P e VEGF) e aumentou a liberação de um fator anti-angiogênico IFNγ (Simsek et al., 2015) Ensaio de Citotoxicidade O ensaio de citotoxicidade foi realizado para a linhagem celular HaCaT nos tempos de 4, 24, 48 e 72 horas, nas concentrações de 1, 5 e 10%. Foi observado que o DMSO reduziu a

8 C i t o t o x i c i d a d e ( % ) viabilidade celular inferior a 50% no tempo de 4 horas, nas concentrações de 5 e 10% e em 48, e 72 horas em todas as concentrações (Figura 4), enquanto no tempo de 24 horas o composto não foi citotóxico para nenhuma concentração testada. Nossos dados corroboram com os resultados de Chen e Thibeault (2013) que estudaram três concentrações de DMSO (0.1, 0.5 e 1%) e observaram que quando a concentração de DMSO foi aumentada para 1%, as células exibiram uma taxa de sobrevivência muito baixa. Realmente, a maioria dos estudos demonstram que o tratamento com DMSO altera substancialmente a morfologia e adesão de células em concordância com uma redução significativa na viabilidade celular de uma maneira dependente (Pal et al., 2012). H a C a T c o n t r o l e D M S O 1 % D M S O 5 % D M S O 1 0 % h 2 4 h 4 8 h 7 2 h t e m p o ( h o r a s ) Figura 4 - Percentual de viabilidade celular em função do tempo de exposição a diferentes concentrações de dimetilsulfóxido (DMSO) avaliado pelo método MTS. 4 Conclusão Os resultados obtidos até o momento com as linhagens celulares SiHa e HaCaT permitem concluir que o tratamento com o DMSO: Não modifica a morfologia celular; Altera a proliferação celular (nas concentrações de 1% após 48 horas e de 5 e 10% nas contagens de 4, 24, 48 e 72 horas); É citotóxico a partir de 48 horas em todas as concentrações.

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