TRATAMENTO CONTRA O ADENOCARCINOMA MAMÁRIO HUMANO POR MEIO DA TERAPIA FOTODINÂMICA UTILIZANDO O AZUL DE METILENO

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1 TRATAMENTO CONTRA O ADENOCARCINOMA MAMÁRIO HUMANO POR MEIO DA TERAPIA FOTODINÂMICA UTILIZANDO O AZUL DE METILENO B. S. Prado, M.L. Castilho, L.P. Leite, L. Raniero Universidade do Vale do Paraı ba/laborato rio de Nanossensores Instituto de Pesquisa & Desenvolvimento, Av. Shishima Hifumi, 2911 Sa o Jose dos Campos/SP, Brasil, biancasilvaprado@hotmail.com Resumo - A terapia fotodinâmica (TFD) é um método promissor e alternativo para o tratamento contra o câncer, ocasionando baixa toxicidade sistêmica podendo ter ação localizada. O seu mecanismo de ação é baseado na combinação de um fotossensibilizador, luz e o oxigênio presente nos tecidos. Neste trabalho foi avaliada a ação do fotossensibilizador azul de metileno (AM) no tratamento contra o adenocarciona mamário humano da linhagem celular MDA-MB-468 por meio da terapia fotodinâmica. A linhagem celular foi cultivada utilizando o meio de cultura Leibovitz s complementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas em estufa a 37ºC para crescimento. O tratamento via TFD foi realizado utilizando o fotossensibilizador AM nas concentrações de 0,4 µg/ml, 1,2 µg/ml e 2,0 µg/ml sendo irradiadas com LEDs 660 nm, com a fluência de 25 J/cm 2. A viabilidade celular foi realizada utilizando o método de exclusão Azul de Tripan. Os resultados obtidos sugerem que o azul de metileno apresenta grande potencial, pois possibilitou uma redução da taxa de viabilidade celular sob irradiação e baixa citotoxicidade quando não irradiando. Palavras-chave: Terapia Fotodinâmica, Azul de Metileno, Câncer de mama. Área do Conhecimento: Biomedicina Introdução O câncer de mama é problema de saúde pública mundial, pois é o tipo que possui a maior incidência e a maior mortalidade na população feminina de países em desenvolvimento ou em países desenvolvidos (INCA, 2016). Os tratamentos convencionais, como a quimioterapia e radioterapia, são agressivos e em muitas vezes causam efeitos colaterais a curto e longo prazo, ocasionando em um prognóstico insatisfatório, podendo este efeito estar relacionado a heterogeneidade clínica dos tumores, dentre outros fatores (NIE et al., 2007; PARHI; MOHANTY; SAHOO, 2012). Levando em conta os efeitos prejudiciais destas terapias tradicionais têm-se buscado formas alternativas para o aperfeiçoamento/desenvolvimento de novos métodos de tratamento. A terapia fotodinâmica (TFD) é um método promissor e alternativo para o tratamento contra o câncer, que também pode ser associado a outros tratamentos existentes. A vantagem deste tratamento localizado é a baixa toxicidade sistêmica (KHANAL et al., 2014). O mecanismo de ação da TFD se baseia em uma reação fotoquímica, que consiste no aumento da citotoxidade por meio da ativação de um fotossensibilizador (FS) por uma radiação eletromagnética de comprimento de onda adequado. Assim, espécies reativas de oxigênio e radicais livres são formados, podendo induzir a morte celular por apoptose, necrose e/ou autofagia. O azul de metileno (A.M.) pertence a classe de corantes fenotiazinicos e sendo um composto aromático heterocíclico solúvel em água, com a massa molar de 373,90 g/mol. Este FS possui um perfil eficaz para ser usado na TFD, pois apresenta uma elevada absorção na região do vermelho, rápida eliminação corpórea e baixa toxicidade (KHANAL et al., 2014, LIM et al. 2013). Neste contexto, este trabalho irá avaliação a ação do AM associado a TFD em células de adenocarcinoma mamário humano. Metodologia Cultura das células A linhagem celular de adenocarcinoma mamário humano (MDA-MB-468), com morfologia epitelial, provenientes do Banco de Células do Rio de Janeiro (BCRJ) foram mantidas em meio Leibovitz (L-15 1

2 medium, Sigma Life Science, L x1L) e 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB, Sigma Aldrich, FC561x500mL), sem a adição de antibiótico. O cultivo em monocamadas foi mantido em estuda de crescimento a 37 ºC sem a adição de CO2. Fotossensibilizador O azul de metileno (Sigma Aldrich, M9140) foi solubilizado em tampão fosfato-salino (PBS) com concentração final de 5 mg/ml. O fotossensibilizador foi previamente diluído para uma concentração de 500 µg/ml para o uso em células. A caracterização e quantificação do A.M. foram realizadas por meio da espectroscopia UV-visível. Terapia Fotodinâmica A TFD foi realizada em duas placas de 24 poços com 1x10 5 células/ml por poço, contendo meio de cultura completo. Após a adesão celular, o meio de cultura foi substituído e as células foram incubadas em uma estufa a 37 C, em três diferentes concentrações, sendo elas 0,4 µg/ml, 1,2 µg/ml e 2,0 µg/ml, por 2 horas, o tempo de incubação foi determinado de acordo com a literatura (YU, et al.,2014). Então, as células foram lavadas com PBS 1x e adicionou-se meio de cultura completo. Uma placa foi mantida no escuro (grupo controle) a 37 ºC e a outra irradiada (grupo tratado) com LEDs 660 nm (Irrad Led Biopdi), 25 mw, com a fluência de 25 J/cm 2. Este procedimento foi realizado no Laboratório de Terapia Fotodinâmica no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (UNIVAP). A viabilidade celular, nas duas condições experimentais, foi avaliada após 18 horas. Viabilidade celular A viabilidade celular foi avaliada por meio do método de exclusão utilizando o corante azul de tripan. Primeiramente, o meio de cultura foi removido e 200 µl do azul de tripan a 0,4% foram adicionados em cada poço. Após 5 min de incubação, os poços foram lavados duas vezes utilizando 500 µl de PBS 1x. A análise foi feita por meio de 10 imagens de cada poço, coletadas por um microscópio invertido NIB-100 (Bel Equipamentos Analíticos) acoplado a um computador com o programa Future WinJoe. A contagem celular foi feita no programa imagej versão 1.48 e os resultados plotados no programa OriginPro v.8.5. Resultados A espectroscopia UV-Visível caracterizou as bandas referentes ao azul de metileno, conforme mostrado na figura Azul de Metileno 605 nm nm Absorbância (a.u.) nm 663 nm Comprimento de onda (nm) Figura 1: Espectro UV-Visível do fotossensibilizador azul de metileno a 0,5 mg/ml. 2

3 A figura 2 mostra micrografias representativas dos grupos experimentais para o cálculo da viabilidade celular, onde as células vivas não apresentam coloração como visualizadas no grupo controle (Figura 2a), no entanto as células tratadas com TFD apresentam uma porcentagem de morte celular com coloração azul (Figura 2b, c e d). Figura 2: Micrografia do método de exclusão coradas azul de tripan dos grupos tratados com a TFD. a) Grupo controle. b) Grupo tratado com 0,4 µg/ml. c) Grupo tratado com 1,2 µg/ml. d) Grupo tratado com 2,0 µg/ml. A Figura 3 mostra os resultados dos cálculos da viabilidade celular em função da concentração do FS, onde se pode notar que as células do grupo controle apresentam boa viabilidade celular para todas as concentrações de A.M, como mostrado na micrografia representativa da Figura 2a. Entretanto as células do grupo tratado exibiram um alto índice de morte celular. 3

4 100 Viabilidade Celular (%) Irradiado Não Irradiado 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 Concentração ( g/ml) Figura 3: Citotoxicidade da TFD utlizando o azul de metileno para o tratamento da linhagem celular MDA-MB-468. Discussão A TFD é uma técnica promissora, sendo estudada em tratamentos de diversos tipos de câncer afetando órgãos como, a bexiga, esôfago, pulmão entre outros. No entanto sua eficiência está limitada a características específicas do tecido, parâmetros da TFD como a dose de luz, tipo e concentração do fotossensibilizador, entre outros (PERUSSI et al., 2007, LIM et al, 2013). Com isso, novas estratégias terapêuticas estão sendo estudadas para a regressão tumoral, minimizando o acometimento de tecido normal. Neste contexto, o azul de metileno, pertencente à classe dos corantes fenotiazinicos, apresenta características favoráveis para aplicações na TFD, destacando a rápida cinética de incorporação celular e atividade anti-tumoral (LIM et al., 2013, C. KIRSZBERG et al., 2005 OLIVEIRA, 2006). Constatado por meio da viabilidade celular obtida pelo método de exclusão Azul de Tripan. Observou-se que a viabilidade das células não irradiadas não foi alterada após a TFD, característica também observada nos estudos de Khanal, no qual foi utilizando uma concentração elevada de FS e não apresentou uma citotoxidade considerável. Esta característica torna este FS viável para a TFD no tratamento contra o câncer, pois apresenta o mínimo de toxidade possível a célula (KHANAL et al., 2014). A espectroscopia UV-visível confirmou as bandas de absorção do A.M., com as bandas B descritas nas regiões de 250nm e 290nm, bem como as bandas Q em 605nm e 663nm (Figura 1), em concordância com os estudos de MELGOZA et al., Os resultados da TFD para linhagem celular MDA-MB-468 foi bastante promissora, com uma média 95% de células viáveis para o controle e 13% para o grupo tratado. Estes resultados corroboram com os achados de Khanal e colaboradores (2014), que também mostraram uma viabilidade celular semelhante de 77% para a linhagem celular MCF-7, utilizando 0,6 µm de azul de metileno (KHANAL et al., 2014) Conclusão Os resultados obtidos sugerem que o azul de metileno apresenta grande potencial para o uso na terapia fotodinâmica na linhagem celular MDA-MB-468, pois apresentou baixa citotoxicidade se administrado no escuro. Quando irradiado mostrou redução da taxa de viabilidade celular. No entanto, 4

5 mais estudos são necessários para a determinação da concentração adequada para a aplicação deste fármaco. Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer a Dra. Juliana Ferreira Strixino, coordenadora do Laboratório de Terapia Fotodinâmica (FAPESP 2010/ ) da Universidade do Vale do Paraíba, pela utilização do equipamento Biopdi e as agências de fomento FAPESP (Project 2013/ ), CNPq (470534/ e /2015-5), FINEP (Conv ) pelo auxílio financeiro do projeto. Referências INCA, Instituro Naciona de Câncer, Estimativa 2016: incidência de câncer no Brasil Disponível em: < >. Acesso em: 25/02/2015. KHANAL, A.; BUI, M. P.; SEO, S. S. Microgel-encapsulated methylene blue for the treatment of breast cancer cells by photodynamic therapy. J Breast Cancer, v. 17, n. 1, p , Mar KIRSZBERG, C.; RUMJANEK, V. M.; CAPELLA, M. A. M. Methylene blue is more toxic to erythroleukemic cells than to normal peripheral blood mononuclear cells: a possible use in chemotherapy. Cancer chemotherapy and pharmacology, v. 56, n. 6, p , LIM, Eun Jin et al. Methylene blue-mediated photodynamic therapy enhances apoptosis in lung cancer cells. Oncology reports, v. 30, n. 2, p , MELGOZA, D.; HERNÁNDEZ-RAMÍREZ, A.; PERALTA-HERNÁNDEZ, J. M. Comparative efficiencies of the decolourisation of Methylene Blue using Fenton s and photo-fenton's reactions. Photochemical & Photobiological Sciences, v. 8, n. 5, p , NIE, S. et al. Nanotechnology applications in cancer. Annu Rev Biomed Eng, v. 9, p , OLIVEIRA, Carla Santos de. Propriedades fotoquímicas dos fotossensibilizadores cristais violeta e azul de metileno em sistemas microheterogêneos e em células cancerosas em cultura Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo. PARHI, P.; MOHANTY, C.; SAHOO, S. K. Nanotechnology-based combinational drug delivery: an emerging approach for cancer therapy. Drug Discov Today, v. 17, n , p , Sep PERUSSI, Janice Rodrigues. Inativação fotodinâmica de microrganismos. Química Nova, v. 30, n. 4, p. 988, 2007 YU, Jiashing et al. Development of Therapeutic Au Methylene Blue Nanoparticles for Targeted Photodynamic Therapy of Cervical Cancer Cells.ACS applied materials & interfaces, v. 7, n. 1, p ,