INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA MEDIADA POR ERITROSINA E DIODO EMISSOR DE LUZ EM CULTURAS PLANCTÔNICAS DE STREPTOCOCCUS MUTANS

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1 INATIVAÇÃO FOTODINÂMICA MEDIADA POR ERITROSINA E DIODO EMISSOR DE LUZ EM CULTURAS PLANCTÔNICAS DE STREPTOCOCCUS MUTANS Chibebe Jr. J 1, Costa ACBP 1, Pereira CA 1, Machado AKS 1, Beltrame Jr M 2, Junqueira JC 1, Jorge AOC 1 1 Universidade Estadual Paulista (UNESP)/ Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, Av. Eng. Francisco José Longo, 777 Jd. São Dimas São José dos Campos, SP Brasil chibebejr@hotmail.com 2 Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP)/ Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), Av. Shishima Hifumi, Urbanova São José dos Campos, SP Brasil beltrame@univap.br Resumo- O trabalho objetivou avaliar o potencial fotodinâmico do corante eritrosina (2 µm) irradiado pelo Diodo Emissor de Luz (LED) ( nm), com potência de 200 mw, sobre culturas planctônicas de Streptococcus. mutans. Foram utilizadas 9 cepas clínicas isoladas da cavidade bucal e uma cepa padrão (ATCC 35699). Suspensões de microrganismos contendo 10 6 células/ml foram submetidas a diferentes condições experimentais: a) irradiação com LED na presença do fotossensibilizador eritrosina (F+L+); b) irradiação somente com LED (F-L+); c) tratamento somente com o fotossensibilizador eritrosina (F+L-); e d) grupo controle, sem utilização de LED e fotossensibilizador (F-L-). Após a realização dos ensaios, as amostras foram semeadas em ágar BHI para contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL). Foi feita análise de Variância e Teste de Tukey (p 0,05) dos dados. O grupo Terapia Fotodinâmica (F+L+) apresentou número de UFC/mL inferior ao grupo controle (LED-F-), com diferença estatisticamente significante entre os grupos. Ocorreu redução de 5.16 log 10 para o grupo F+L+. Os resultados demonstraram que o corante eritrosina sob efeito do LED foram efetivos na redução de S mutans. Palavras-chave: Streptococcus mutans, Terapia Fotodinâmica, eritrosina e Diodo Emissor de Luz (LED). Área do Conhecimento: Introdução A doença cárie apresenta como principais agentes etiológicos Streptococcus mutans e S. sobrinus. Estes agentes são responsáveis pela formação do biofilme dentário, uma estrutura formada sobre superfícies duras a partir do metabolismo da sacarose que confere propriedades de adesão e agregação microbiana provocando as lesões de cárie devido a desmineralização do esmalte dentário ( ALMEIDA et al., 2002; GE et al., 2008). O controle da doença cárie é realizada, principalmente pela remoção mecânica associada ou não ao uso de antimicrobianos e antissépticos. Sendo assim, alternativas, como a Terapia Fotodinâmica (TFD), têm sido requeridas com o objetivo de aumentar as opções de controle e tratamento de doenças bucais (ZANIN et al., 2005); (MEISEL; KOCHER, 2005). A TFD consiste em administrar um corante fotossensível não tóxico por via tópica ou sistêmica seguida de irradiação com luz visível em comprimento de onda adequado na presença de oxigênio (PERUSSI, 2007). O corante fotossensível eritrosina é um composto cíclico que apresenta absorção de luz na região do visível ( nm) com conseqüente reação fotoquímica. Sua principal aplicação em odontologia é a evidenciação de biofilme dentário (WOOD et al., 2006). A associação de um corante fotossensível e uma fonte de luz com aplicabilidade em odontologia despertam grande interesse para a inativação de microrganismos bucais. Deste modo, o presente trabalho objetivou avaliar o potencial fotodinâmico do corante eritrosina irradiado pelo Diodo Emissor de Luz (LED) na inativação de culturas planctônicas de S. mutans. Metodologia O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos/ Universidade Estadual Paulista (UNESP) O corante eritrosina (Figura 1) foi usado para a sensibilização dos isolados de S. mutans. A solução do fotossensibilizador foi preparada na concentração de 2 µm por dissolução do corante em solução salina tampão fosfato (PBS, ph 7,4) e 1

2 esterilizada por filtração em membranas com poros de diâmetro de 0,22 µm (São Paulo, Brasil). Após a filtração, a solução do fotossensibilizador foi mantida no escuro. Figura 1- Estrutura da eritrosina. A fonte de luz usada foi o LED com comprimento de onda de nm (MMOptics, São Carlos, Brasil), potência de 200 mw e área iluminada de 0,38 cm 2. Fluência de 95 J/cm 2 (Energia de 36 J e tempo de 180 s) e taxa de fluência de 526 mw/cm 2 foi usada. Foram utilizadas 10 cepas de S. mutans, sendo 9 isolados da cavidade bucal de indivíduos saudáveis e uma cepa padrão (ATCC 35688) mantidas em nosso laboratório. Culturas de 48 horas a 37ºC semeadas em ágar Brain Heart Infusion (BHI) (Difco, Detroit, USA) foram transferidas para caldo BHI (Difco, Detroit, USA) e incubadas por 18 horas a 37 ºC em microaerofilia. Os microrganismos cultivados foram centrifugados a 2000 rpm por 10 min e o sobrenadante descartado. Este procedimento foi repetido e o sedimento foi ressuspendido em 10 ml de PBS. A partir desta suspensão, as suspensões padrão de cada cepa foram preparadas na concentração de 10 6 células/ml, ajustadas em espectrofotômetro (Micronal B582, São Paulo, Brasil) com comprimento de onda de 530 nm e densidade ótica de 0,284 Para cada cepa, foram realizados 60 ensaios, totalizando 720 ensaios. Estes ensaios foram divididos nas seguintes condições experimentais (n= 10): a) sensibilização com eritrosina e irradiação com LED (F+L+); b) somente sensibilizado eritrosina (F+L-); c) somente irradiado com LED (F-L+); d) grupo controle, sem utilização de LED e fotossensibilizador (F-L-). De acordo com o protocolo estabelecido, foi adicionado em cada orifício de placas de microtitulação de 96 poços de fundo plano, esterilizadas e com tampa (Costar Corning, New York, USA) 0,1 ml da supensão padrão de S. mutans. Posteriormente, 0,1 ml do fotossensibilizador foi adicionado para os grupos F+L+ e F+L- e 0,1 ml de solução PBS foi adicionado para os grupos F-L+ e F-L-. As placas foram agitadas por 5 min (tempo de pré-difusão) por um agitador orbital (Solab, Piracicaba, Brazil). A seguir, os poços contendo os grupos F+L+ e F- L+ foram irradiados de acordo com o protocolo descrito. A irradiação foi realizada em condições assépticas, em câmara de fluxo laminar com a luz apagada, onde foi utilizado um anteparo negro fosco com orifício de diâmetro coincidente ao da entrada do poço evitando-se assim o espalhamento de luz. Após a irradiação, foram realizadas diluições seriadas dos ensaios e alíquotas de 0,1 ml de cada diluição foram semeadas em duplicata em placas de ágar BHI e incubadas por 48 horas a 37 ºC em microaerofilia. Decorrido o período de incubação, o número de Unidades Formadoras de Colônias por mililitro (UFC/mL) foi contado. Os resultados foram transformados em logaritimo (log 10 ) e submetidos a análise de Variância (ANOVA) e Teste de Tukey ao nível de significância de p Resultados O grupo TFD (F+L+) apresentou redução do número de UFC/mL (log 10 ) em relação aos demais grupos. Os grupos com somente eritrosina (F+L-) e somente irradiado (F-L+) apresentaram resultado semelhante ao grupo controle (F-L-) (Figura 2) F-L- F-L+ F+L- F+L+ Grupos Figura 2- Valores das médias e desvios padrões dos grupos para todas as cepas testadas. Foi observada diferença estatística significante, ao nível de p 0.05, para o grupo TFD comparando-se com os grupos somente eritrosina ou irradiado e o grupo controle, entre estes últimos não foi observada diferença significativa (Tabela 1). 2

3 Em relação ao grupo controle, foi obtida média de redução de 5,16 UFC/mL (log 10 ) para o grupo F+L+ (Tabela 2). Tabela 1- Valores da UFC/mL (log 10 ) para as cepas de S. mutans estudadas. Cepas F-L- F-L+ F+L- F+L+ 1 7,31 A 7,30 A 7,31 A 0,00 B 2 7,30 A 7,30 A 7,32 A 2,10 B 3 7,16 A 7,15 A 7,15 A 1,10 B 4 7,29 A 7,30 A 7,31 A 0,62 B 5 6,90 A 6,90 A 7,22 A 0,66 B 6 7,22 A 7,24 A 7,25 A 4,46 B 7 7,31 A 7,28 A 7,30 A 3,86 B 8 7,31 A 7,22 A 6,97 A 2,70 B 9 7,34 A 7,29 A 7,18 A 5,11 B ATCC ,04 A 6,95 A 7,00 A 0,00 B A, B e C: representam diferença estatisticamente significante entre os grupos F-L-, F-L+, F+L- e F+L+. Tabela 2- Valores de redução de S. mutans em UFC/mL (log 10 ) para o grupo F+L+ em relação ao grupo controle (F-L-). Cepas Redução em log de F+L+ 1 7,31 2 5,24 3 6,07 4 6,67 5 6,24 6 2,76 7 3,45 8 4,61 9 2,23 ATCC ,04 Média±DP 5,16±1,83 DP: Desvio Padrão Discussão Os resultados demonstraram efeito antimicrobiano do corante eritrosina associado ao LED sobre todas as cepas de S. mutans testadas. A eritrosina é utilizada na prática odontológica para evidenciação de biofilme dentário na concentração de 9-25 mm, ou seja vezes mais concentrada do que a solução de eritrosina utilizada no presente trabalho (2 µm) (MARSH et al, 1989). A eritrosina apresenta vantagens em relação aos outros fotossensibilizadores por não apresentar toxicidade ao hospedeiro e possuir aprovação para uso em Odontologia (ALLAKER; DOUGLAS, 2009); (WOOD et al., 2006). O LED tem sido citado como uma fonte de luz alternativa em relação ao laser, pois apresenta baixo custo em comparação ao complexo sistema de laser, além de constituir uma simples tecnologia (ZANIN et al., 2005); (GIUSTI et al., 2008). Além disso, estudos com TFD envolvendo LED demonstraram que esta fonte de luz tem baixa atividade microbicida (ZANIN et al., 2005); (GIUSTI et al., 2008); (BEVILACQUA et al., 2007). Wood et al. (2006) avaliaram o potencial fotodinâmico dos corantes eritrosina, azul de metileno e fotofrin irradiados por lâmpada de filamento de tungstênio de 400W em biofilme de S. mutans formado in vitro. Os autores observaram redução em log10 de 2.2±0.2 UFC para biofilmes de 24 horas e 3.0±0.3 UFC para biofilmes de 288 horas para o corante eritrosina na concentração de 22 µm, o qual foi o mais efetivo entre os corantes testados destacando seu potencial como fotossensibilizador no controle e tratamento de biofilmes bucais. Em trabalho semelhante, Metcalf et al. (2006) demonstraram que o fracionamento da luz branca na irradiação de biofilmes de S. mutans tratados com 22 µm de solução de eritrosina resultou em 1.7 log10 a mais que a irradiação por luz contínua na morte desses microrganismos. Segundo os autores isto pode ter ocorrido devido ao reabastecimento, durante os períodos escuros, de alvos moleculares, como oxigênio, para a excitação do fotossensibilizador. Neste trabalho foi observada média de redução de 5,16 log 10 para o grupo tratado com eritrosina e irradiado com LED. Este resultado demonstrou que o conjunto eritrosina e LED apresentaram excelente potencial na TFD de células planctônicas de S. mutans que, assim como já demonstrado por trabalhos aqui citados, poderá constituir nova opção de tratamento para a redução de bactérias cariogênicas. Zanin et al. (2005) avaliaram a susceptibilidade de biofilmes de S. mutans formados in vitro a TFD. Após o período de pré-irradiation de 5, 15 e 30 minutos com azul de toluidina, os biofilmes foram irradiados por LED ( nm) e laser HeNe (632.8 nm) com redução da viabilidade celular variando de 3,12 a 4.29 log 10 e 2,10 a 3,1 log 10, respectivamente. Entretanto a fonte de luz LED associada ao azul de toluidina foi mais efetiva do que o tratamento com o laser HeNe, deste modo este resultado demonstrou o potencial do LED na TFD para o tratamento de doenças bucais, umas vez que a sua segurança é comprovada em tecidos bucais. A TFD representa um tratamento alternativo ou complementar para o tratamento de doenças bucais, como a cárie, em condições em que a terapia antimicrobiana não é eficaz ou recomendada e a remoção mecânica não é obtida. 3

4 Conclusão Os resultados obtidos revelaram o potencial fotodinâmico do corante eritrosina associado ao LED na inativação de todas as cepas de S. mutans testadas. - ZANIN, I. C. J. et al. Susceptibility of Streptococcus mutans biofilms to photodynamic therapy: an in vitro study. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. v.56, p , Referências - ALLAKER, R. P., DOUGLAS C. W. I. Novel antimicrobial therapies for dental plaque-related diseases. International Journal of Antimicrobial Agents. v.33, p.8-13, ALMEIDA, P. F. et al,. Microbiota estreptocócica associada com a formação inicial da placa dental. Revista de Ciências Médicas e Biológicas. v.1, n.1, p.33-41, BEVILACQUA, I. M. et al The impact of photodynamic therapy on the viability of Streptococcus mutans in a planktonic culture. Photomedicine and Laser Surgery. v.25, n.6, p , GE, Y. et al. Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis colonization correlated with caries experience in children. Caries Research.v.42, p , GIUSTI, J. S. M. et al. Antimicrobial photodynamic action on dentin using a lightemitting diode light source. Photomedicine and Laser Surgery. v.26, n.4, p , MARSH, P. D. et al. Antibacterial activity of some plaque-disclosing agents and dyes. Caries Research. v.23, p , MEISEL, P.; Kocher, T. Photodynamic therapy for periodontal deseases: state of the art. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. v.79, p , METCALF D. et al. Enhancement of erythrosinemediated photodynamic therapy of Streptococcus mutans biofilms by light fractionation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. v.58, p , PERUSSI, J. R. Inativação fotodinâmica de microrganismos. Química Nova. v.30, n.4, p , WOOD S. et al. Erythrosine is a potential photosensitizer for the photodynamic therapy of oral plaque biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. v.57, p ,

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