Marcadores Fenotípicos Presentes em Células Mononucleraes do Sangue Periférico de um Indivíduo considerado Contato Intradomiciliar: Estudo de Caso

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1 5 Submitted: Corrected version: Accepted in: Marcadores Fenotípicos Presentes em Células Mononucleraes do Sangue Periférico de um Indivíduo considerado Contato Intradomiciliar: Estudo de Caso Lorena Bruna Pereira de Oliveira 1, Pedro Henrique Ferreira Marçal 1*, Lúcia Alves de Oliveira Fraga Universidade Vale do Rio Doce Univale; Universidade Federal de Juiz de Fora. 2 - Universidade Federal de Juiz de Fora UFJF. *Autor Correspondente: phfmarcal@gmail.com Resumo: A hanseníase é uma doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium leprae. A imunofenotipagem é utilizada para auxiliar no diagnóstico e compreensão dos mecanismos imunológicos de inúmeras doenças, inclusive da hanseníase. Atualmente, representa uma das maiores aplicações da citometria de fluxo. Este trabalho teve como objetivo identificar marcadores fenotípicos na superfície de linfócitos de sangue total de um indivíduo contato intradomiciliar, bem como pacientes de hanseníase. No estudo foram observados os seguintes percentuais de população de linfócitos do sangue periférico do indivíduo contato intradomiciliar: CD3+CD4+ (30,25%), CD3+CD8+ (27,86%), CD14+ (12,21%), CD19+ (16,7%) e CD56+ (2,05%). Foram também avaliados os percentuais de populações de linfócitos do sangue periférico de pacientes com as formas clínicas paucibacilar e multibacilar, bem como de indivíduos sadios considerados controles negativos. Não foram realizadas análises estatísticas das variáveis utilizadas neste trabalho, uma vez que o número de participantes foi reduzido por se tratar de um estudo de caso. A avaliação de parâmetros imunológicos neste estudo auxiliará na compreensão dos mecanismos imunes associados à maior ou menor susceptibilidade à infecção pelo M. leprae em projetos futuros. Palavras-Chave: imunofenotipagem, hanseníase e contato intradomiciliar. Abstract (Phenotypic of cells from a household contact: a case study) Leprosy is a contagious infectious disease caused by Mycobacterium leprae. Immunophenotyping is currently one of the major applications of flow cytometry, and it isused to aid the diagnosis and understanding of the immunological mechanisms of many diseases, among them leprosy. This work aimed to identify phenotypic markers on the surface of lymphocytes from whole blood of an household contact individual and leprosy patients. In the study noted the following percentages of the population of peripheral blood lymphocytes of the household contact individual: CD3 + CD4 + (30,25%), CD3 + CD8 + (27,86%), CD14 + (12,21%), CD19 + (16, 7%) and CD56+ (2,05%). We also evaluated the percentages of lymphocyte populations from peripheral blood of patients with paucibacillary and multibacillary clinical forms, as well as healthy individuals as negative control. No statistical analysis was conducted of the variables used in this work, since the number of participants was reduced because it is a case study. Evaluation of immunological parameters in this study will assist in understanding the immune mechanisms associated with higher or lower susceptibility to infection with M. leprae in future projects. Keywords: immunophenotyping, leprosy and household contact.

2 6 Introdução A hanseníase é uma doença infecciosa crônica que afeta principalmente a pele e nervos periféricos 11. A rota de transmissão da hanseníase ainda não está definitivamente comprovada, mas acredita-se que seja através das vias respiratórias, embora não seja descartada a possibilidade de infecção via soluções de continuidade na pele. Os tecidos primeiramente infectados pelo Mycobacterium leprae são sítios superficiais da pele e nervo devido à sua preferência por baixas temperaturas. Porém, órgãos internos podem ser afetados quando a enfermidade não é controlada 6. Os indivíduos infectados podem progredir para a cura espontânea ou evoluírem para um amplo espectro patológico que é determinado pelos múltiplos elementos da resposta imune celular e humoral 6. As características imunológicas das formas espectrais da hanseníase incluem: tuberculóide (T), indeterminada (I), dimorfa (D) e virchowiana (V). A manifestação inicial da doença é denominada como uma forma clínica indeterminada (I), onde a resposta do hospedeiro é insuficientemente diferenciada para permitir a classificação. Os indivíduos com a forma tuberculóide/paucibacilar (PB) apresentam baixos títulos de anticorpos para o Mycobacterium leprae e forte resposta imune celular específica (RIC) do tipo Th1 caracterizada por produção de interferon gama (IFN-γ). Esta forma caracteriza-se por ser localizada, poucos bacilos e lesões limitadas com até cinco lesões no corpo. Indivíduos com a forma virchowiana/multibacilar (MB) se encontram no pólo de extrema suscetibilidade ao M. leprae, no qual a proliferação disseminada do bacilo resulta em lesões de pele, difusamente distribuídas, associadas a uma potente resposta imune humoral com produção de níveis elevados de anticorpos anti-m. Leprae. A manifestação clínica dimorfa, como o próprio nome sugere apresenta resposta imune indeterminada com relação à imunidade celular e humoral. De um lado, a resposta celular apresenta um papel protetor enquanto a resposta humoral parece permitir a proliferação bacteriana, sendo um fator de susceptibilidade bem esclarecido 10. Entretanto, são poucos os estudos que investigam o perfil fenotípico de populações e subpopulações celulares, pela técnica de imunofenotipagem, na hanseníase 14. Com relação à transmissão dessa doença, a investigação adequada dos indivíduos considerados contatos contribui para a interrupção dessa cadeia, pois trata precocemente os casos diagnosticados, evitando a disseminação do bacilo e a instalação de incapacidades, pois estas podem limitar a produtividade do indivíduo e gerar a marginalização social 10. Dessa forma, a alta incidência da doença, observada entre os indivíduos considerados contatos intradomiciliares, indica que a vigilância dos contatos é uma medida importante em um contexto de alta endemicidade 13. A literatura também aponta que a presença da hanseníase em menores de quinze anos é utilizada habitualmente como um indicador do nível de transmissão ativa da doença 7. Diante desse quadro, medidas de prevenção e controle, além do tratamento eficaz dos casos, são absolutamente necessárias 13. Para fins operacionais, deve-se considerar como contato intradomiciliar toda e qualquer pessoa que resida ou tenha residido nos últimos cinco anos com o paciente 14. A técnica de imunofenotipagem, através da citometria de fluxo foi escolhida para a realização deste estudo, devido o interesse em avaliar as células mononucleares circulantes do sangue periférico do indivíduo considerado contato intradomiciliar juntamente com os pacientes. A imunofenotipagem é atualmente uma das maiores aplicações da citometria de fluxo e consiste na identificação de populações de células distintas através dos diferentes antígenos e/ou moléculas de superfície, marcadas com anticorpos conjugados com fluorocromos específicos. Esta técnica possibilita a análise das células mononucleares do sangue periférico em pacientes com hanseníase e nos indivíduos considerados contatos intradomiciliares 20. Existem valores de referência para cada marcador molecular de interesse. Esses valores são estabelecidos com base na percentagem apresentada por indivíduos saudáveis. A técnica da imunofenotipagem permite quantificar redução ou aumento no número desses marcadores,

3 7 indicando assim uma situação de anormalidade 17,16. Na pesquisa imunológica de doenças causadas por bactérias de crescimento lento, como a hanseníase, o uso de métodos que envolvem citometria de fluxo aumenta de forma extraordinária a velocidade da obtenção de resultados sem perda de sensibilidade 17. O citômetro de fluxo possui um computador acoplado, o qual recebe os sinais (dispersões frontal, lateral e intensidade de fluorescência emitida pelo fluorocormo) que posteriormente serão convertidos em dados digitais para serem representados através de gráficos monoparamétricos que analisa somente um parâmetro (histogramas) e biparamétricos que analisa mais de um parâmetro 19. As células da amostra em suspensão são marcadas com anticorpos monoclonais fluorescentes específicos para detecção de moléculas de superfície e são introduzidas numa câmara de fluxo vibratória. O fluxo de células atravessa a câmara na presença de uma solução tampão (Sheath fluid), sendo que 500 a células ou quaisquer outras partículas passam em fila simples por segundo. O fluxo é iluminado por laser de argônio (azul), que tem uma energia de luz incidente de 488nm. Cada célula é avaliada com relação ao tamanho (dispersor de luz anterior), granulosidade (dispersor de 90 ) e intensidade de fluorescência (anticorpos marcados com fluorocromo) 20. De acordo com Orfão e Buitrago (1995), a interação das células ou das partículas com o feixe luminoso origina sinais que vão ser alcançados por detectores adequados. A informação obtida por meio do sensor eletrônico pode agrupar-se em dois tipos fundamentais: a que é originada pela dispersão da luz e a que está relacionada com a emissão de luz por fluorocromos presentes na célula ou na partícula, ao serem excitados pela fonte luminosa. A dispersão da luz é um processo físico em que uma célula interage com a luz incidente e muda a direção da mesma. As características celulares que contribuem para a dispersão da luz são o tamanho celular, a membrana celular, o núcleo e o material granular do interior da célula. A luz não se dispersa de igual forma em todas as direções. A luz que dispersa para frente, forward scatter (FSC), é uma medida do tamanho relativo da célula, enquanto a luz que é dispersa em ângulo reto, side scatter (SSC), depende da complexidade interna da célula. Essas duas dispersões permitem a classificação dos leucócitos em linfócitos, monócitos e granulócitos 15. A fluorescência é indicada como a emissão de energia luminosa pelos compostos fluorescentes que se encontram ligados aos anticorpos monoclonais. Estes compostos absorvem energia, fazendo com que os elétrons passem a um nível energético superior. No momento em que esse elétron regressa ao seu estado de repouso, emite um fóton e libera energia. Os sinais vão depois ser convertidos em dados digitais, sob o controle de um programa de computador. Toda esta tecnologia aumenta a sensibilidade e a especificidade da identificação de moléculas de superfície celular que atuam como marcadores fenotípicos que podem ser associados às funções celulares 17. A imunofenotipagem é utilizada para auxiliar no diagnóstico e compreensão dos mecanismos imunológicos de inúmeras doenças, dentre elas a hanseníase 17,16, doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium leprae 3. A imunofenotipagem foi utilizada neste estudo para avaliar marcadores de superfície de leucócitos de um indivíduo considerado contato intradomiciliar, no sentido de verificar o grau de risco de infecção em grupos familiares apresentando casos de hanseníase. Metodologia Indivíduos Estudados Nesse estudo foram avaliados nove indivíduos, dois controles negativos, um contato intradomiciliar, seis indivíduos casos de hanseníase sendo um com recidiva. Os cinco indivíduos casos de hanseníase são acompanhados clinicamente pelo corpo técnico do Centro de Referência em Doenças Endêmicas e Programas Especiais (CREDEN-PES). O diagnóstico e a classificação dos indivíduos com hanseníase foram baseados em critérios clínicos, sendo

4 8 utilizada a classificação operacional da Organização Mundial de Saúde. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Universidade Vale do Rio Doce e todos os participantes assinaram termo de consentimento livre e esclarecido. Neste trabalho o contato intradomiciliar foi a participante L.P, uma criança de sete anos, neta da também participante J.M.F.C de 56 anos, que é um caso paucibacilar com a forma clínica tuberculóide. A paciente J.M.F.C compareceu a uma unidade de saúde de forma espontânea, queixando-se: de uma mancha no braço direito próximo ao cotovelo, relatou também que o local não coçava e não curava há aproximadamente seis meses. A mesma desconhecia a doença hanseníase ou alguém próximo a ela que teve a enfermidade. Ela e a neta residem no mesmo local. A paciente em questão foi diagnosticada no dia 15/02/2011 e foi feito também no mesmo dia o esquema terapêutico de poliquimioterapia paucibacilar de seis meses. Os familiares da paciente também foram submetidos à exame dermato-neurológico por clínicos experientes, para confirmar se haviam sintomas de hanseníase. Imunofenotipagem Os ensaios de imunofenotipagem de células do sangue periférico foram realizados adicionando-se 2μl do anticorpo monoclonal marcado com o fluorocromo específico para o receptor celular de interesse (CD3 FITC, CD4 PE, CD8 PE, CD14 PERcP, CD19 FITC, CD56 PE) em 100μl de sangue periférico total, incubado por 30 minutos. Em seguida, as amostras foram submetidas à etapa de lise dos eritrócitos utilizando 2ml de solução de lise comercial (Facs Lysing Solution Becton Dickinson) e submetidas à centrifugação (400g, 10 minutos a 18 C), para descarte do sobrenadante. As amostras foram lavadas 2 vezes com 2 ml de tampão salina fosfato (PBS) 0,015M ph 7,4 e posteriormente, fixadas com 300μl de solução fixadora (10g/l de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67 g/l de cloreto de sódio, ph 7,2). Após um período de 15 minutos a 4 C, a análise dos parâmetros fenotípicos das células presentes e marcadas em cada tubo foi determinada com o auxílio de um citômetro de fluxo (Beckman Cuter XL-MCL) 2. Obtenção de Dados no Citometro de Fluxo As amostras foram analisadas em citômetro de fluxo Beckman Coulter EPICS XL- MCL. A aquisição dos dados e o estudo dos resultados foram realizados utilizando-se o software do equipamento denominado EXPO 32. Foram adquiridos eventos para o estudo após a marcação in vitro. A identificação das populações celulares de interesse foi feita através de um sistema de computador acoplado ao citômetro. As figuras 1 e 2 mostram de forma esquemática a seqüência de procedimentos necessários para o estudo dos dados dos fenótipos celulares in vitro. O primeiro passo consiste na identificação da população de leucócitos em estudo, realçando os linfócitos. A figura 1A apresenta um gráfico do tipo pontual (dot plot) onde pode-se avaliar o tamanho celular (FSC) versus a granulosidade (SSC). Após a seleção da região de interesse, a mesma é analisada utilizando-se a intensidade de fluorescência apresentada pelas células presentes na região selecionada, utilizando-se gráficos de fluorescência 1 (FL1- fluorescência verde obtida pela marcação com isotiocianato de fluoresceína FITC) versus fluorescência 2 (fluorescência laranja obtida pela marcação com ficoeritrina PE). A Figura 1B representa um perfil celular obtido em um gráfico de fluorescência 1 (CD3- FITC) versus fluorescência 2 (CD4-PE).

5 9 Fig. 1: Análise de leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Após a seleção da população de linfócitos, o segundo passo consiste na identificação da população de monócitos. A figura 2, mostra a análise de monócitos, que foi realizada com relação à granulosidade (SSC) versus a fluorescência 2 (CD14 PERCP). Fig. 2: Análise de monócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Resultados Os dados referentes à identificação dos casos novos e do contato intradomiciliar que fizeram parte desse estudo foram fornecidos pelo SINAN (Sistema Nacional de Agravos de Notificação) e prontuários clínicos cedidos pelo CREDEN-PES. A tabela 1 indica a classificação operacional e o tempo de tratamento dos indivíduos participantes deste estudo.

6 10 Tabela 1 - Classificação Operacional da Hanseníase descrita no prontuário do CREDEN-PES IB*= índice baciloscópico Pode-se observar que todos os pacientes selecionados para o estudo foram recentemente tratados (1 a 3 meses). Além disso, é importante notar que o índice baciloscópico variou entre os participantes (0 a 2,5), sendo coerente com a literatura que relata índice baciloscópico zero para os pacientes da forma tuberculóide/paucibacilar. O índice baciloscópico (IB) é a estimativa do número de bacilos no esfregaço que segue a escala logarítmica de Ridley 9. Os gráficos a seguir mostram as percentagens de células positivas para populações de linfócitos no sangue periférico dos indivíduos participantes deste estudo. De acordo com os dados do gráfico 1, foi observado uma diminuição no percentual de linfócitos positivos (CD3+CD4+), do sangue periférico do indivíduo considerado contato intradomiciliar (PB) em relação aos casos que apresentaram a forma clínica paucibaciliar, ao caso com a forma recidiva, bem como um dos indivíduos sadios (controle negativo 1). Podese observar que o percentual de linfócitos CD3+CD4+ do indivíduo contato intradomiciliar (30,25%) foi próximo a do indivíduo multibacilar 1 (26,59%). Entretanto, nota-se que o paciente multibacilar 1 apresentou o mesmo valor do indivíduo sadio (controle negativo 2). O gráfico 2, mostra que o indivíduo contato intradomiciliar (PB1) apresentou uma percentagem de linfócitos T CD3+CD8+ (27,86%) semelhante ao indivíduo controle negativo 1 (28,99%). Foi possível notar que todas as outras avaliações foram inferiores aos casos relatados. O gráfico 3, apresenta uma razão entre as percentagens de células positivas para CD3+CD4+: CD3+CD8+ de acordo com os resultados obtidos dos gráficos 1 e 2. Nesse tipo de análise pode-se notar que as células do contato (PB1) está bem semelhante com as dos controles negativos 1 e 2. O percentual de monócito CD14+ do indivíduo contato intradomiciliar (PB1) representado no gráfico 4, foi de 12,21%, ficando próximos dos valores apresentados pelo controle negativo (1) 13,76%. As demais percentagens foram inferiores a 10%. Com relação à percentagem de linfócitos B (CD19+), apresentada no gráfico 5, observa-se um aumento dessas células no sangue periférico do indivíduo contato intradomiciliar (PB). No gráfico 6, nota-se que o paciente multibacilar 2 apresentou uma maior percentagem de linfócitos CD56+ (22,38%), enquanto que o indivíduo paucibacilar 1 apresentou um valor intermediário (15,83%). Entretanto, o indivíduo contato intradomiciliar (PB), bem como os pacientes paucibacilar 2, paucibacilar 3 e o indivíduo controle negativo 1 apresentaram menor percentagem de células CD56+.

7 11 Gráficos: 1: Percentagem de células positivas para populações de linfócitos TCD3+CD4+; 2: Percentagem de células positivas para populações de linfócitos TCD3+CD8+; 3: Razão entre as percentagem de células positivas para populações de linfócitos T CD3+CD4+:CD3+CD8+. Verde escuro: Paubacilar 1; Verde claro: Paubacilar 2; Azul escuro: Multibacilar 1; Azul Claro: Multibacilar 2; Laranja: Recidiva; Vermelho: Contato (PB1); Roxo escuro: Controle negativo 1; Roxo claro: Controle negativo 2. Gráficos: 4: Percentagem de células positivas para populações de Monócito CD14+; 5: Percentagem de células positivas para populações de linfócitos B CD19+; 6: Percentagem de células positivas para subpopulações de Linfócitos T CD56+; Verde escuro: Paubacilar 1; Verde claro: Paubacilar 2; Azul escuro: Multibacilar 1; Azul Claro: Multibacilar 2; Laranja: Recidiva; Vermelho: Contato (PB1); Roxo escuro: Controle negativo 1; Roxo claro: Controle negativo 2.

8 12 Discussão Pode-se dizer que o indivíduo contato intradomiciliar (PB1) apresentou uma distribuição de linfócitos, ora dentro de um perfil de paciente multibacilar, ora dentro de um perfil de indivíduo saudável. Considerando que o individuo contato intradomiciliar (PB1) não apresentava nenhuma sintomatologia da doença, é possível encontrar valores de marcadores imunológicos de superfície celular próximas aos valores dos indivíduos sadios. Através dos resultados pode-se verificar uma diferença na taxa de CD3+CD4+:CD3+CD8+ entre os indivíduos participantes do estudo. O paciente paucibacilar 1 apresentou uma taxa CD4:CD8 de 2,71%, o paciente paucibacilar 2 apresentou 4,82%, interessantemente o paciente multibacilar 1 apresentou 3,22%, o paciente recidiva apresentou 3,52%, diferentemente o contato intradomicilar (PB1) apresentou uma razão de 1,09%, e os controles negativos 1 e 2 apresentaram 1,48% e 2,08% respectivamente. Categorizando uma taxa de CD4:CD8 maior que 2,5% para os indivíduos infectados e uma taxa de CD4:CD8 menor que 2,5% para os indivíduos não infectados. Essa taxa de CD4:CD8 maior que 2,5% indica uma infecção por microorganismos de via intracelular obrigatório. Por outro lado, pode-se observar um aumento na percentagem de células de linfócitos B (CD19+) no individuo considerado contato intradomiciliar em relação a todos os outros participantes do estudo. Foi interessante notar que as percentagens de linfócitos CD56+ foram baixas, ao contrário do que ocorreu com o linfócitos B. Além disso,os indivíduos paucibacilar 2, paucibacilar 3 e o indivíduo sadio apresentavam baixas percentagens de linfócitos CD56+. Nesse caso, somente o indivíduo multibacilar 2 apresentou um aumento de CD56+ (22,38%) e valores intermediários foram observados entre os indivíduos da forma paucibacilar 1 e da forma multibacilar 1. Considerando, que o presente estudo, foi planejado para caracterizar um caso de indivíduo contato intradomiciliar em relação aos pacientes das formas paucibacilar, multibacilar e indivíduos sadios, não se pode realizar uma análise estatística dos dados. Entretanto, sabe-se da importância em caracterizar esse grupo de indivíduos contatos intradomiciliar para garantir um melhor controle da hanseníase. Sabe-se que a maioria dos estudos imunológicos em hanseníase são realizados utilizando-se tecidos de pele ou de nervos e se baseiam em análises imuno-istoquímicas para a determinação do infiltrado celular e da expressão de moléculas envolvidas no processo de eliminação do agente infeccioso. 14. Anticorpos monoclonais dirigidos contra subpopulações de células T tem também permitido a investigação do fenótipo de células T in situ. Esses estudos indicam diferenças na taxa CD4:CD8 nos pólos do espectro da hanseníase. Os dados mostram que as lesões tuberculóides exibem muito mais células CD4+, com a relação CD4+/CD8+ de 1,9:1; Em contraste, as lesões virchowianas exibem a relação CD4+/CD8+ de 0,6:1. As taxas CD4+/CD8+ nas lesões são independentes daquelas encontradas no sangue dos pacientes, sugerindo alguma migração seletiva para dentro das lesões, proliferando nas mesmas 5. Desta forma, foi necessário que as células circulantes fossem avaliadas para tornar possível a comparação da imunofenotipagem entre células de contato intradomiciliar e dos demais pacientes. Tem sido relatado na literatura que a hanseníase é uma enfermidade considerada de adultos pelo longo período de incubação, mas existem numerosos relatos de casos desta doença em faixas etárias menores de quinze anos. Esse fato ocorre devido à existência de um aumento na cadeia de transmissão do bacilo na comunidade, além de uma deficiência na vigilância e no controle desta doença 12. As crianças correm maior risco quando existe a presença da hanseníase na família ou quando um caso está próximo a elas 18,1. Um controle rigoroso, envolvendo a vigilância epidemiológica, deve ser mantido

9 13 em crianças sob risco de contrair a hanseníase, no sentido de detectar a doença mais precocemente e evitar as conseqüências do diagnóstico tardio e dos estigmas sociais 4. Existem alguns fatores que favorecem a transmissão da hanseníase, como: diagnóstico tardio dos casos novos, baixa cobertura assistencial, abandono do tratamento pelos pacientes, baixa taxa de controle dos contatos, baixo nível de esclarecimento da população sobre a doença, estigma e preconceito que envolve a doença 8. Dessa forma, acredita-se que o controle dos indivíduos contatos de casos de hanseníase deve constituir-se em uma das ações para eliminar a doença. Conclusão Diante do exposto, e com relação a outros estudos, conclui-se que a participação da resposta imune está diretamente envolvida no curso da infecção pelo Mycobacterium leprae. São necessários novos estudos que permitam um acompanhamento continuo desse indivíduo considerado contato intradomicilar, para verificar o desenvolvimento ou não da enfermidade. Cabe destacar que a razão de CD4:CD8 entre os indivíduos infectados foi maior que 2,5% sendo coerente com os exames clínicos realizados e demonstrando que os mesmos estavam infectados por um microrganismos intracelular obrigatório. Os contatos intradomiciliares de pacientes com hanseníase apresentam um risco maior de adoecer e, o exame desse grupo representa a melhor maneira de detectar precocemente a doença. O diagnóstico da hanseníase é baseado nas manifestações clínicas, no entanto, a escassez de sinais iniciais ou sintomas, leva ao atraso no diagnóstico correto e tratamento apropriado. Cabe ressaltar que o diagnóstico precoce leva ao tratamento nos estágios iniciais da doença, o que reduz a transmissão e diminui o número de pacientes com incapacidades. Agradecimentos Nossos agradecimentos à Dr a Euzenir Sarno, Coordenadora do projeto DECIT/2008/CNPq, pelo apoio financeiro, ao corpo técnico do CREDEN-PES e aos pacientes que foram essenciais para a realização deste estudo. Referências 1. Chen XS. Leprosy in children: a retrospective study in China J. Trop. Pediatr. 2000; 46 (4): Emerenciano M. The frequency of aberrant immunophenotypes in acute leukemias. Revista Brasileira de Cancerologia 2004; 50 (3): Ferreira AW, Ávila SLM. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes. Guanabara Koogan 2001; 2: Ferreira IN, Alvarez RRA. Hanseníase em menores de 15 anos no município de Paracatu, MG ( ). Rev. Bras. Epidemiol. 2005; 8(1): Goulart IMB, Penna GO, Cunha G. Imunopatologia da hanseníase: a complexidade dos mecanismos da resposta imune do hospedeiro ao Mycobacterium leprae. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 2000; 35 (4): Jopling WH. Clinical aspects of leprosy. Tubercle 1982; 63 (4): Lana FCF. Hanseníase em menores de 15 anos no Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, Brasil. Rev. Bras. Enferm. 2007; 60 (6):

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