CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE SFMNPV DO MATO GROSSO DO SUL

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1 CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE SFMNPV DO MATO GROSSO DO SUL Flávia Barrosa Soares (IC) e José Luiz Caldas Wolff (Orientador) Apoio: PIBIC Mackenzie/MackPesquisa Resumo A Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é uma das principais pragas das culturas de milho e sogro. O controle biológico deste inseto pode ser feito através da produção de biopesticidas a base do baculovírus SfMNPV (Spodoptera frugiperda múltiplo nucleopoliedrovírus). A aplicação destes vírus pode reduzir os danos causados às lavouras sem provocar impactos ambientais. Entretanto, existe um fator limitante para a produção deste biopesticida: a liquefação do tegumento da lagarta infectada logo após a morte, dificultando e prejudicando sua produção. Recentemente, um isolado de SfMNPV que não degrada o tegumento foi identificado em lagartas provenientes do Paraná. Este isolado, chamado de SfMNVP-6nd, apresenta uma mutação no gene da quitinase, enzima responsável pela liquefação. Coincidentemente, lagartas de S. frugiperda coletadas no estado do Mato Grosso do Sul também apresentavam sinal de virose por baculovírus sem a ocorrência de degradação do tegumento. Essas lagartas foram enviadas para analise moleculare em nosso laboratório. Duas regiões do baculovírus SfMNPV do MS foram analisadas: a região hr5, que possui alta variabilidade sendo considerada um marcador molecular, e a região do gene da quitinase. O seqüenciamento dessas regiões mostrou que os dois Isolados têm a mesma mutação no gene da quitinase e que a região hr5 apresenta diferenças quando comparada a hr5 de outros isolados de SfMNPV. Estes resultados sugerem que os isolados não degradantes do Paraná e do Mato Grosso tem a mesma origem e que, portanto, o vírus com a mutação no gene da quitinase difundiu-se por uma vasta região do território brasileiro. Palavras-chaves: baculovírus, mutação, quitinase Abstract The larvae of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is one of the main pests of maize in Brazil. The biological control of this insect can be done through the application of a biopesticide formulation with the baculovirus SfMNPV. The application of this virus can reduce the damage caused to crops without causing environmental impacts. However, there is a limiting factor for the production of SfMNPV: the liquefaction of the integument of infected larvae after death complicates the handling and affects their production. Recently, an isolate SfMNPV that does not liquefy the larval integument was identified. This isolate was obtained from larvae collected in the State of Parana and was called SfMNVP-6nd. Molecular characterization demonstrated that this virus has a mutation in the chitinase gene. This viral enzyme is responsible for liquefaction of the larval integument. Larvae of S. frugiperda collected in the State of Mato Grosso do Sul (MS) also showed signs of viral infection were sent to our laboratory. These larvae also did not display the degradation of the integument. Molecular characterization of the hr5 and the chitinase regions were done. The sequence of the hr5 showed that the isolate from MS was different from other SfMNPV isolates. The sequencing of the chitinase gene revealed that this isolate had exactly the same mutation observed in the chitinase of SfMNPV-6nd. These results suggest that the non-degrading isolates from Paraná and from MS have the same origin and that this mutated virus have spread over a vast region of the Brazilian territory. Key-words: baculovirus, mutation, chitinase 1

2 VII Jornada de Iniciação Científica INTRODUÇÃO A lagarta-do-cartucho (Spodoptera furgiperda Lepidoptera: Noctuidae), também conhecida como lagarta militar, é uma praga que agride várias culturas, como a do arroz, do sogro e uma das mais importantes, a do milho. Pesquisas atuais demonstram que essa praga está atacando também a cultura de algodão (BARROS et al., 2005). O baculovírus é um grupo de vírus que infecta insetos das Ordens Lepidoptera, Himenoptera e Díptera durante a fase larval (JEHLLE, 2006). Os baculovírus podem ser divididos em: nucleopoliedrovírus (NPV), que formam corpos de inclusão análogos a poliedros virais e em granulovírus (GV), que possuem seus corpos de inclusão de forma ovicilindrica (LIMA, 2008). O Baculovírus de S. frugiperda (múltiplo nucleopoliedrovírus SfMNPV) possui alta especificidade e capacidade de controlar populações dessas lagartas. Dados experimentais atestam que a aplicação do SfMNPV em culturas pode ser uma técnica viável para o controle de Spodoptera frugiperda (VALICENTE e CRUZ, 1991; ARMENTA et al., 2003). No entanto, algumas dificuldades estão sendo encontradas para desenvolver um biopesticida a base de SfMNPV. Uma destas dificuldades se deve ao fato das larvas infectadas apresentarem um processo de intensa degradação do tegumento, formando um tipo de pasta composta por tecidos de larva, poliedros virais e dieta. Essa pasta reduz a produção de poliedros de SfMNPV devido a dificuldade com o manuseio das larvas infectadas durante o processo de produção do biopesticida. No entanto, um isolado viral que não degrada o tegumento foi obtido a partir de lagartas coletadas no Paraná, na cidade de Cascavel (VIEIRA et al., 2008). A análise molecular deste isolado, chamado de SfMNPV- 6nd (nd: não degradante) comprovou que este de fato é um variante do SfMNPV e identificou uma mutação no gene da quitinase (VIEIRA, 2008). Estudos da atividade biológica mostraram que a virulência do isolado SfMNPV-6nd é semelhante a do isolado SfMNPV-19,considerado altamente virulento (BARRETO et al., 2005).Os baculovírus possuem regiões conhecidas como hrs que são segmentos de seqüências repetitivas. Essas regiões podem funcionar como ativadores de transcrição gênica ou como origem de replicação viral. (HARRISON et al., 2010). Estudos do SfMNPV-19 (WOLFF et al., 2008) em comparação com o SfMNPV-3AP2 (HARRISON et al., 2008) demonstrou que a região hr5 (homologous repeat 5) do Isolado-19 possui uma pequena deleção e indicou que esta região é propícia a mutações (WOLFF et al., 2008). A análise subseqüente desta região em vários isolados de SfMNPV confirmou tratar-se de uma região menos conservada sendo mais susceptível a mutações (HARRISON et al., 2010). Devido à grande variabilidade, a região 2

3 hr5 pode ser usada como um marcador genético, permitindo a identificação de diferentes isolados geográficos ou de populações do SfMNPV (HARRISON et al., 2010). Recentemente, lagartas de S. frugiperda com sinais de infecção por baculovírus, mas com o tegumento íntegro foram coletadas no Mato Grosso do Sul e enviadas para nosso laboratório (WOLFF, 2011 comunicação pessoal). Estas lagartas apresentavam coloração rósea e o tegumento íntegro. O objetivo deste projeto foi realizar a análise molecular deste isolado obtido no Mato Grosso do Sul e verificar se eles têm a mesma origem dos isolados não degradantes obtidos no Paraná. Para isto, duas regiões do genoma foram analisadas. Uma delas foi o gene da quitinase e a outra região corresponde à seqüência hr5. Através dos resultados obtidos pelo seqüenciamento podemos inferir que o gene hr5 pôde ser confirmado como um marcador genético e que a mesma mutação do gene da quitinase do SfMNPV-6nd apresentou-se no SfMNPV-MS e que portanto esta linhagem viral difundiu-se por uma vasta região do território brasileiro. REFERENCIAL TEÓRICO Os baculovírus constituem o maior grupo de vírus que infectam invertebrados, e que são usados no controle biológicos de pragas (WELZEL apud MARTIGONI, 1984; PAYNE, 1986; MOSCARDI & SOSA-GÓMEZ, 1992, 1993; MOSCARDI,1998; CASTRO et alli, 1999). Estes vírus são altamente específicos, não afetam outros organismos (WELZEL apud GRÖNER, 1986) e são seguros a manipulação humana (VIEIRA, 2008). Os baculovírus pertencem a família Baculoviridae que atualmente foi dividida em quatro gêneros: os Alphabaculovírus, Betabaculovírus, GammaBaculovírus e Deltabaculovírus (JEHLE et al., 2006). Sendo que o gênero Alphabaculovírus inclui os nucleopoliedrovírus específico de Lepidóptera (JEHLE et al., 2006).Estes nucleopoliedrovírus são capazes de formar corpos de inclusão, chamados de poliedros nos NPVs e grânulos nos GVs. Os NPVs possuem natureza protéica oferecendo proteção aos vírions (WELZEL, 2008). Estes NPVs são subdivididos em dois tipos morfológicos: os nucleocapsídeos simples (SNPV) que contém um nucleocapsídeo por vírion ou os nucleocapsídeos múltiplos (MNPV) que possui desde poucos a muitos capsídeos por vírion. Os NPVs possuem corpos de oclusão de forma poliédrica, sendo conhecidos como poliedros e a principal proteína constituinte é a poliedrina. Estes vírus possuem um DNA de fita dupla e circular. O ciclo infectivo por baculovírus começa através da ingestão de alimentos contaminados por poliedros virais. Quando os poliedros virais chegam ao intestino médio dos hospedeiros, são submetidos ao ph altamente alcalino, esses poliedros dissolvem-se liberando as partículas virais. Estas partículas virais liberadas penetram nas células epiteliais colunares do intestino 3

4 VII Jornada de Iniciação Científica médio liberando os nucleocapsídeos no citoplasma, que são levados para o núcleo onde ocorre replicação viral e formação de novos nucleocapsídeo. Os vírions produzidos são liberados na hemolinfa e infectam outros tecidos do hospedeiro (VIEIRA apud VOLKMAN & KEDDIE, 1990). A agricultura de milho no Brasil é uma das mais rentáveis, a produção chega a milhões de toneladas por ano (WOLFF, J. L. e VALICENTE F.H 2009). Esta produção pode ser reduzida devido a uma das principais pragas que ataca as culturas de milho, as lagartas de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) (SANTOS, 2002). Em seu estágio larval inicial a S. frugiperda, também conhecida como lagarta-militar, alimenta-se raspando as superfícies das folhas. Em estágios mais avançados estas lagartas perfuram as folhas lesionado o cartucho do milho (VIERA apud VALICENTE & CRUZ 1991). Os inseticidas químicos são pouco eficazes contra S.frugiperda essas lagartas podem se tornar resistentes a estes inseticidas. Além de prejudicar o meio ambiente com resíduos químicos tóxicos (BARROS et al., 2005) Uma possível solução para o controle desta praga pode ser feita através da utilização de bioinseticidas a base de baculovírus. Esses biopesticidas apresentam benefícios, pois são altamente seletivos, mantêm o equilíbrio do ecossistema, não geram resíduos químicos deletérios ao ambiente e matam estas lagartas com eficiência (VIEIRA, 2008). Entretanto a produção dos biopesticidas a base de baculovírus para controlar a S. frugiperda em larga escala possui diversas limitações. Uma delas é a rápida degradação do tegumento logo após a morte da lagarta, dificultando o manuseio, reduzindo a quantidade da matériaprima e elevando custos do produto final. O problema pode ser solucionado, pois um isolado de SfMNPV que não degrada o tegumento foi encontrado em lagartas doentes provenientes da região de Cascavel no Paraná (VALICENTE et al., 2008). Este isolado viral foi chamado de SfMNPV-6nd (não degradante) O processo que envolve a degradação do tegumento tem relação direta com o gene da quitinase, que são encontrados em diversas espécies de baculovírus (HAWTIN, 1997). Estudos demonstram que a presença deste gene é uma característica do SfMNPV (WOLFF et al., 2008; HARRISON et al., 2008). Quando os genes que codificam a quitinase são expressados, ocorre a degradação do tegumento (VIEIRA, 2008). Estudos realizados com o SfMNPV-6 nd demonstra que a provável causa da ausência da degradação nos SfMNPV-6 nd é uma mutação no gene da quitinase (VIEIRA, 2008). No genoma dos baculovírus foram encontradas segmentos de seqüências repetitivas que são chamadas de homologous repeat ou hr. Estes segmentos atuam como ativadores de 4

5 transcrição gênica ou como origem de replicação viral. Entretanto, como são regiões altamente polimórficas, podem ser utilizados para diferenciar filogeneticamente variantes da uma mesma espécie de baculovírus (HARRISON et al., 2010). Análises feitas através de comparação do SfMNPV-19 (WOLFF et al., 2008) em relação ao isolado SfMNPV-3AP2 (HARRISON et al., 2008) revelou que a região hr5 (homologous repeat 5) é pouco semelhante entre estes dois vírus. As análises subseqüente com outros isolados confirmaram que a região hr5 é de fato altamente susceptível a mutações podendo, portanto ser considerada um hot spot (HARRISON et al., 2010). As hrs são constituídas por seqüência repetitivas palindrômicas, ou seja, seqüências em que a leitura de ambas as fitas é a mesma na direção 5 para 3. São regiões muito comuns em baculovírus, sendo encontradas em praticamente todos os genomas seqüenciados até o momento (WOLFF et al., 2008). E devido a essas características, essa região pode ser considerada um marcador genético para os baculovírus. MATERIAL E MÉTODOS Larvas doentes foram coletadas no Mato Grosso do Sul, e enviadas para o laboratório, onde se realizou a análise e confirmou-se a infecção pelo baculovírus. Extração de poliedros virais Um número reduzido de larvas (cinco indivíduos) infectadas pelo vírus SfMNPV, foram maceradas com SDS a 1%.Logo após, esse macerado foi coado obtendo-se somente um caldo, livre de resíduos teciduais. Resultando como produto final, um extrato contendo poliedros virais. O número destes poliedros foi estimado utilizando-se câmera de Newbauer. Este material foi utilizado para multiplicação do SfMNPV em lagartas. Multiplicação viral Para a multiplicação viral, lagartas de tamanho uniforme e entre o segundo e o terceiro ínstar foram infectadas. Foram utilizadas folhas de mamona fresca lavadas em solução de hipoclorito a 1%. Espalhou-se o caldo com poliedros virais por toda folha e estas foram colocadas nas placas com as lagartas separadas. As lagartas alimentaram-se destas folhas durante vinte e quatro horas. Após este período, as folhas foram removidas sendo substituídas por dieta artificial que ajudando a mantê-las alimentadas até o momento da morte. Contagem dos Poliedros Virais Após a morte dos indivíduos, o procedimento de obtenção do caldo foi repetido. Para confirmar a infecção viral, foi realizada uma contagem dos poliedros virais do Isolado do Mato Grosso do Sul. Para simples comparação foi realizado também uma contagem dos 5

6 VII Jornada de Iniciação Científica poliedros virais do isolados do Paraná o SfMNPV-6 nd e do SfMNPV-19, com a finalidade de sabermos se a quantidade de poliedros virais obtidos na infecção foi próxima a quantidade dos poliedros virais encontrados no SfMNPV-6 nd ou do SfMNPV -19. Purificação dos Poliedros Virais e Extração do DNA O DNA foi extraído de um extrato bruto de poliedros virais, o volume inicial desse extrato era de aproximadamente 2 ml. O material passou por um pré-tratamento com protease K durante 2 horas em banho seco a 54 C. Após esse tratamento foi adicionado 100µl de Carbonato de Sódio (0.2 M) para cada 1 ml de extrato, deixando-o a temperatura de 54 C durante toda a noite (overnight) para dissolver os poliedros virais e liberar o material genético. Em seguida, o material foi centrifugado a RPM por 10 minutos e o sobrenadante foi descartado. Posteriormente, foi adicionado 100µL de Tris HCl (1.0M, ph 7.0) para neutralizar a solução, deixando por 2 horas no agitador homogeneizando essa solução. Por fim, foi adicionado protease K, 25µL/mL de solução com poliedros virais e deixado a 54 C por 2 horas. O material foi dividido igualmente com um volume total de aproximadamente 750 µl e em seguida adicionado o mesmo volume de fenol (um volume final equivalente a 1,5 ml), sendo homogeneizado por inversão durante 5 minutos. Logo o material foi centrifugado a RPM, o sobrenadante descartado e a interface tratada com o volume equivalente de clorofórmio, seguido de homogeneização, centrifugação e retirada do sobrenadante. O material obtido durante a extração é colocado em tubo centricon (tubo de coluna), que retém DNA através de uma membrana interna, concentrando o DNA purificado. Reação da Cadeia Polimerase Para cada reação foi utilizado um par de primers (tabela 1) e reagentes (tabela 2). Tabela 1: Primers usados para amplificação e seqüenciamento do Isolado do Mato Grosso do Sul. Posição baseada no genoma do isolado SfMNPV-19 (WOLFF et al.,2008). Para cada amostra uma temperatura de anelamento e de extensão foi adaptada. Em comum para ambas as regiões foram: aquecimento das amostras a 94 C por 4 minutos, seguido de 6

7 30 ciclos de 94 C por 45 segundos (desnaturação). Para a região hr5 foi necessária uma temperatura de anelamento de 63 C durante 1 minuto, depois a 72 C por 1 minuto, referente à síntese. E uma extensão final de 30 ciclos foi realizada a 72 C por 5 minutos. Diferentemente para a região da quitinase, a temperatura de anelamento usada foi de 50 C durante 30 segundos, depois por 1 minuto e 10 segundos ocorreu a síntese com uma temperatura de 72 C. Após os 30 ciclos, a extensão foi realizada a 72 C por 4 minutos. Tabela 2: Protocolo com os Reagentes usados para a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). No final de todos os PCRs, os produtos obtidos foram analisados em géis de agarose a 0,8%. Para carregar o gel de agarose o DNA amplificado foi corado com Blue Green (LCG) numa proporção de 10 µl de DNA para 1µL de corante. Após a corrida eletroforética, o gel foi colocado em um Scanner de fluorescência, que por meio de iluminação ultravioleta iluminou o gel que contém o Blue Green, emitindo uma fluorescência que é capturada pelo obturador de imagem. Purificação Após encontrar essas regiões, efetuaram-se mais duas reações de PCR com um volume total de 60µl, sendo realizada para cada região com seu devido protocolo, como foi descrito anteriormente. Os produtos amplificados da região de interesse foram purificados com o Kit Gel Band Purification (GE Healthcare). O material amplificado foi transferido para um tubo de 1,5mL. Em seguida, foram adicionados 500 µl do tampão de captura (Capture Buffer) misturando rapidamente e colocando no tubo especial do Kit de purificação, que contém uma membrana de sílica que retém somente o DNA. Após alguns segundos o material foi levado à centrifugação por 30 segundos a RPM. Foi descartado o líquido do tubo coletor, acrescentou-se em seguida 500µL do tampão de lavagem (Washer Buffer) e repetindo o procedimento, dessa vez descartando o tubo coletor e colocando o tubo com sílica em um tubo de 1,5mL. Adicionou-se 50µL da água previamente aquecida ao tubo com 7

8 VII Jornada de Iniciação Científica sílica. Centrifugou-se o material por 3 minuto a RPM. Ao fim desse procedimento, obteve-se o DNA purificado com um volume total de aproximadamente 50µL. Esse procedimento foi repetido separadamente para cada região evitando prováveis contaminações. Seqüênciamento O protocolo utilizado foi o mesmo para as duas regiões, diferenciando-se somente na temperatura de anelamento. A reação do seqüenciamento foi desenvolvida nas seguintes condições: 94 C por 1 minuto (desnaturação); ciclos de 94 C por 15 segundos; a 72 C por 4 minutos ocorreu a síntese. Depois dos 35 ciclos, a extensão foi efetivada a 72 C por 2 minutos. As diferentes temperaturas são demonstradas na tabela 3. Os reagentes usados no seqüenciamento e seus respectivos volumes encontram-se na tabela 4. Os primers utilizados são os mesmos das reações de PCR. Tabela 3: As diferentes temperaturas para as regiões da quitinase e hr5. Tabela 4: Reagentes utilizados para o seqüenciamento das regiões hr5 e quitinase. As amostras da reação do seqüenciamento foram transferidas para microtubos de 1,5mL e foi adicionado a cada tubo 80 µl de isopropanol 75% (gelado), sendo homogeneizados no vórtex e deixados em repouso na geladeira por 15 minutos. Os microtubos foram centrifugados durante 25 minutos a RPM. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com 200 µl de etanol 70% (gelado) e homogeneizado novamente. As amostras foram levadas para a centrífuga durante 10 minutos a RPM e por fim o 8

9 sobrenadante foi descartado, logo após o material foi levado a banho seco por 2 minutos a 96 C. O DNA precipitado foi ressuspendido em formamida e submetido a seqüenciamento no equipamento ABI 377 (Applied Biosystems) do Laboratório do Prof. Paolo Marinho Zanotto, ICB, USP. Análise das Seqüências O processamento das seqüências e a montagem dos contigis foram feitos usando o programa CodonCodes Aligner (CodonCodes corporation). Os contigs obtidos foram analisados usando o programa Blast disponível no site do NCBI ( RESULTADOS E DISCUSSÃO Multiplicação do vírus e purificação dos poliedros Multiplicou-se em lagartas S. frugiperda o isolado SfMNPV-MS. Após a morte da lagarta confirmou-se a ausência de degradação do tegumento (Figura 1). Durante o desenvolvimento da lagarta notou-se primeiramente uma cor mais próxima ao marrom, entretanto com a elevação da infecção viral, e aproximando-se da morte as lagartas adquiriram uma coloração rósea, típica de infecção por baculovírus. E após a morte não ocorreu a degradação do tegumento. Figura1: Spodoptera frugiperda infectada pelo SfMNPV MS. O fenótipo apresentado pela lagarta infectada com o isolado SfMNPV-MS é semelhante ao da lagarta infectada com o isolado SFMNPV-6 nd (Figura 2A). Ou seja, não resulta na degradação do tegumento. Este fenótipo contrasta com o que é observado no isolado SfMNPV-19 (Figura 2B). Neste último, o tegumento da lagarta infectada é degradado de forma intensa. A caracterização molecular do isolado SfMNPV-6nd mostrou que o gene da quitinase possui uma mutação que resulta na produção de um polipetídeo putativo cujo 9

10 VII Jornada de Iniciação Científica tamanho é 1/5 daquele da enzima quitinase. O fenótipo não-degradante é atribuído a esta mutação. Figura 2: Em 2A uma Spodoptera frugiperda infectada pelo isolado SfMNPV-19. Em 2B S. frugiperda infectada pelo SfMNPV-6 nd. Foto cedida gentilmente pelo Professor Doutor José Luiz Caldas Wolff, Extração de DNA viral e Amplificação da região hr5 e do gene da quitinase. Confirmamos a infecção por baculovírus através de observações feitas em microscópio. O DNA foi extraído de um composto obtido através do macerado feito com as lagartas mortas. Após a extração foram realizados os PCRs amplificando as regiões hr5 e do gene da quitinase. A amplificação da hr5 resultou em um fragmento de aproximadamente de 400 pares de bases (Figura 3). A amplificação da região do gene da quitinase resultou em um fragmento de aproximadamente pb. Figura 3: Analise da eletroforese após amplificação. Canaleta 1: DNA padrão 100 pb ( Gene Ruler TM 100pb DNA LADDER). Canaleta 2: amplicon da região hr5 do isolado SfMNPV- MS. 10

11 Figura 4: Eletroforese em gel de agarose do amplicon obtdido do o gene da quitinase do isolado SfMNPV-MS. Canaleta 1: padrão HindIII/Lambda. Canaleta 2 e 3: amplicon do gene da quitinase. Seqüenciamento e Análise O seqüenciamento da região hr5 e do gene da quitinase do isolado SfMNPV-MS foi realizada com sucesso. A seqüência da região hr5 do isolado SfMNPV-MS obtida foi submetida a análise pelo programa BLAST disponível no site do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Os resultados obtidos demonstram que a região hr5 do isolado do SfMNPV-MS é 97% semelhante a região hr5 do SfMNPV-19 até a posição 643 (Figura 5). Após esta posição, não foi detectada semelhança entre as seqüências indicando a ausência deste segmento no genoma do SfMNPV

12 VII Jornada de Iniciação Científica Figura 5: Analise do seqüenciamento no programa BLAST comparando os isolados SfMNPV-19 e SfMNPV-MS. Em relação ao gene da quitinase a seqüência obtida também foi submetida a análise BLAST. Observou-se que esta seqüência é idêntica a do isolado SfMNPV-6nd (Figura 6). Ou seja, este resultado mostrou que o SfMNPV-MS possui uma mutação idêntica aquela observada no gene da quitinase do isolado SfMNPV-6nd (Figura 6). A mutação representada na figura 7 mostra a deleção de uma Adenina entre as Guaninas. Esta deleção resulta na mudança da janela de leitura e na interrupção precoce da tradução. 12

13 Figura 6: Parte da análise BLAST, confirmando a similaridade do gene quitinase entre os isolados SfMNPV-6nd e SfMNPV-MS. Figura 7: Representação do segmento do gene da quitinase. Segmento 7A representação do segmento do gene quitinase sem a mutação. Segmento 7B, representação do segmento do gene da quitinase demonstrando a mutação. A base adenina deletada no gene do isolado SfmNPV-MS e SfMNPV-6nd. Foto cedida gentilmente pelo Professor Doutor José Luiz Caldas Wolff, CONCLUSÃO A caracterização molecular do isolado SfMNPV-MS foi realizada através do seqüenciamento de duas regiões do genoma viral: a região hr5 e a região correspondente ao gene da quitinase. A análise da hr5 do SfMNPV-MS mostrou que esta é diferente da seqüência hr5 do isolado SfMNPV-19, um isolado viral altamente virulento, assim como de outros isolados para os quais a seqüência desta região está disponível no Genebank. Estes vírus, portanto, é de fato representante de um isolado diferente dos isolados previamente caracterizados. 13

14 VII Jornada de Iniciação Científica As diferenças observadas estão de acordo com resultados obtidos em outros trabalhos que mostram que a hr5 é altamente polimórfica e que por isto pode ser usada como marcador molecular. Por outro lado, a análise do gene da quitinase do isolado SfMNPV-MS mostrou que este possui a mesma mutação encontrada no isolado SfMNPV-6nd. Estes resultados sugerem que após a mutação no gene da quitinase, um SfMNPV mutante não-degradante se espalhou por uma vasta região do território nacional, indicando que a ausência de liquefação não interferiu significantemente na capacidade deste vírus se difundir. REFERÊNCIAS BARRETO, M. R.; GUIMARÃES, C. T.; TEIXEIRA, F. F.; PAIVA, E.; VALICENTE, F.H. Effect of Baculovirus spodoptera isolates in Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) Larvae and their characterization by RAPD. Neotropical Entomology, v34, n1, p BARROS, R.G.; ALBERNAZ, K. C.; TAKATSUKA, F.B.; CZEPAK, C.; FERNANDES, P.M.; TOFOLI, G.R.; Eficiencia de Inseticidas no Controle de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith,1797) (Lepidoptera: Noctidae) na Cultura de Algodoeiro. Pesquisa Agropecuária Tropical, HARRISON, R.L.; PUTTLER, B.; POPHAM, H.J.R.; Genomic sequence analysis of a fastkilling isolate of Spodoptera frugiperda multiplenucleopolyhedrovirus. J.Gen. Virology. p HAWTIN, R. E.; ZARKOWSKA, T.; ARNOLD, K.; THOMAS, C.J.; GOODAY, G. W.; KING, L.A; KUSIO, J. A.; and POSSE,R. D.; Liquefaction of Autographa californica Nucleopolyhedro virus-infected Insects Is Dependent on the Integrity of Virus- Encoded Chitinase and Cathepsin Genes. Virology, Vol. 238, p , JEHLE, J. A.; BLISSARD, G.W.; BONNING, B.C.; CORY, J. S. HERNIOU, E. A.; ROHRMANN, G. F.; THEILMANN, D. A.; THIEM, S. M.; VLAK, J. M.; On the Classification and Nomenclature of Baculoviruses: A proposal for revision. Archives of Virology p LIMA, A. A.; Analise do Efeito Causado pelos Genes Quitinase e Catepsina dos Baculovírus CfDefNPV e AcMNPV inseridos no genoma do Anticarsia gemmantalis multiple nucleopolyhedrovirus. Brasília, Dissertação de Mestrado para Patologia Molecular. Universidade de Brasília. 14

15 ROWLEY, D. L.; FARRAR JR, R. R.; BLACKBURN, M. B.; HARRISON, R.L.; Genetic and biological variation among nucleopolyhedrovirus isolates from the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctidae). Virus Gene. P SANTOS, L. M.; Biologia de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith,1797) (Lepidoptera: Noctidae) em Genótipos de Milho Doce e Comum. Porto Alegre, Dissertação de Mestrado em Fitotecnia. Universidade Federal do rio Grande do Sul. VALICENTE, F.H.; e CRUZ, I.; Controle Biológico da Lagarta-do-cartucho, Spodoptera frugiperda, com o Baculovírus. Circular Técnica 15, EMBRAPA/CNPMS WELZEL, A.; Baculovírus Recombinantes Contendogenes de Proteases Mais Virulentos Contra Spodoptera frugiperda, Brasília, Dissertação de Mestrado para Patologia Molecular. Universidade de Brasília. WOLFF, J.L. e VALICENTE F.H Processo de formulação de biocontrole de insetos da Ordem Lepidoptera e formulação obtida. BR Pat. PI , p VIEIRA, C. M.; Comparação Molecular e Biológica de dois Isolados Geográficos de Spodoptera frugiperda Nucleopoliedrovirus, Mogi das Cruzes, Dissertação de Mestrado-Biotecnologia. Universidade Mogi das Cruzes. WOLFF, L. J.; VALICENTE, F. H; MARTINS, R.; OLIVEIRA, J. V. C.; ZANOTTO, P. M. A.; Analysis of the Genome of Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus (SfMNPV-19) ando f the High Genomic Heterogeneity in Group II nucleopolyhedroviruses. J. Gen. Virology, Contato: flaviabarrosa@uol.com.br e joseluiz.wolff@mackenzie.br 15