CONTROLE MICROBIANO DE INSETOS-PRAGA: VÍRUS ENTOMOPATOGÊNICO

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1 CONTROLE MICROBIANO DE INSETOS-PRAGA: VÍRUS ENTOMOPATOGÊNICO Carlos Eduardo Costa Paiva. Engenheiro Agrônomo. Mestre em Fitotecnia. Departamento de Produção Vegetal. Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal do Espírito Santo. Fernando Hercos Valicente. Engenheiro Agrônomo. Doutor em Entomologia. Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo - EMBRAPA. fernando.valicente@embrapa.br Hugo José Gonçalves dos Santos Junior. Engenheiro Agrônomo. Doutor em Entomologia Agrícola. Professor Adjunto III. Departamento de Produção Vegetal. Centro de Ciências Agrárias. Universidade Federal do Espírito Santo. hugo.goncalves@ufes.br 1. INTRODUÇÃO A crescente demanda por alimento, devido ao crescimento da população mundial que alcança cerca de sete bilhões de habitantes, torna necessário o aumento da produtividade das espécies cultivadas e de importância agrícola, o qual pode ser alcançado com a redução de perdas por fatores como clima, solo, antrópicos e biológicos. Considerando apenas os fatores biológicos, o ataque de pragas é uma ameaça à produção mundial de alimentos e, os insetos, destacam-se pelos danos ocasionados e consequentemente pelos prejuízos, afetando diretamente a produção. Contudo, apesar do uso intenso de medidas de manejo, dentre as quais o uso de inseticidas sintéticos, estima-se que as perdas provocadas por herbivoria chegam a 13% nos EUA, atingindo cerca de 15%, ou mais, em todo o mundo (SCHOONHOVEN et al., 2005). Os insetos representam o maior grupo de organismos da Terra e, destacam-se entre as diversas pragas que atacam as culturas de importância agrícola. Estimativas recentes mostram que o número de espécies de insetos no mundo pode variar de 4 a 10 milhões, havendo mais de 400 mil espécies de insetos fitófagos, dentre os quais cerca de espécies atacam as culturas agrícolas pelo mundo, mas apenas cerca de 5% deste total são consideradas pragas (SCHOONHOVEN et al., 2005). Contudo, como aspecto positivo da grande diversidade biológica nos diversos ecossistemas, podese destacar um grupo de insetos que atuam na regulação populacional de pragas, mantendo assim populações de insetos-praga abaixo dos níveis de dano-econômico, ou seja, no nível de não-ação, os quais são classificados como entomófagos e, incluem predadores e parasitoides (COSTA et al., 2009). Além dos entomófagos, outro grupo de inimigos naturais merece destaque, os entomopatógenos, os quais agregam alguns microrganismos, destacando-se os fungos, as bactérias e os vírus entomopatogênicos, além de outros organismos como nematoides e microsporídeos que são utilizados e encontrados em diversos ecossistemas (VEGA & KAYA, 2012). Por sua vez, o manejo integrado de pragas baseia-se em métodos integrados de controle para reduzir populações de insetos e, que o controle químico seja utilizado somente após a constatação do nível de dano econômico da praga, com o mínimo possível de impacto ambiental e de redução da

2 população de insetos não-alvo, em especial, inimigos naturais, para evitar a ressurgência de insetospraga, a qual pode ser causada pela atividade humana e por métodos de manejo que afetam o equilíbrio ecológico. Mediante o contexto, pesquisas com inseticidas biológicos para o controle de pragas tem aumentado em diferentes culturas. Como exemplo, na cultura do milho, destacam-se as pesquisas com a bactéria Bacillus thuringiensis e o vírus da poliedrose nuclear de Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae), Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus (SfMNPV), também conhecido simplesmente como Baculovirus spodoptera. 2. CONTROLE BIOLÓGICO COM VÍRUS ENTOMOPATOGÊNICO O controle biológico com vírus entomopatogênicos como estratégia no manejo integrado de pragas, pode ser uma solução duradoura e efetiva protegendo o meio ambiente sem impacto sobre insetos benéficos e vertebrados, incluindo o homem. O reconhecimento de que os baculovírus são ambientalmente seguros aumentou o potencial dos mesmos como alternativa aos inseticidas químicos (BARRETO et al., 2005). A literatura científica sobre a segurança dos vírus entomopatogênicos ao homem e outros animais vertebrados é bastante extensa. Diversas espécies de vertebrados, incluindo o homem, já foram expostas a várias espécies de baculovírus, em testes toxicológicos que demonstraram a segurança ambiental dos inseticidas microbianos à base de vírus (LAPOINTE et al., 2012). Como exemplo da eficiência dos vírus entomopatogênicos, Baculovirus spodoptera é um vírus de poliedrose eficiente para controlar a Lagarta-do-cartucho, S. frugiperda (VALICENTE & COSTA, 1995; BARRETO et al., 2005) e, por sua alta especificidade e ocorrência natural, como outros baculovírus, são ótimos candidatos para programas de manejo integrado de pragas (TANADA & KAYA, 1993; MOSCARDI, 1999). Pertencentes à família Baculoviridae, os baculovírus contêm DNA circular de fita dupla como material genético e são caracterizados pelos nucleocapsídeos de vírus infeccioso que se encontram dentro de uma matriz protéica ajudando-o a sobreviver fora de seu hospedeiro (KING; POSSEE, 1992). A família dos baculovírus era dividida em dois gêneros: os Nucleopolyhedrovirus (NPVs) e os Granulovirus (GVs). Essa divisão se baseava no tamanho das partículas virais e natureza da proteína do corpo de oclusão (KING & POSSEE, 1992). Os nucleopoliedrovírus apresentam forma poliédrica e podem ser do tipo múltiplo (MNPV) ou simples (SNPV), de acordo com o número de capsídeos por virion, enquanto os granulovírus (GV) contêm, em geral, partículas únicas, oclusas em corpos protéicos de forma ovóide (CASTRO et al., 1999). Os baculovírus são nomeados de acordo com o gênero do vírus, suas características morfológicas e o nome em latim do hospedeiro do qual foi isolado pela primeira vez. Contudo, esse sistema pode gerar confusão, pois muitas espécies de baculovírus possuem mais de uma espécie hospedeira. Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), por exemplo, embora isolado

3 primeiro de Autographa californica, pode infectar pelo menos 40 outras espécies dentro da ordem Lepidoptera (GRÖNER, 1986). Dessa forma, uma alteração foi proposta na classificação dos gêneros NPV e GV, existentes na família Baculoviridae, baseada na especificidade do hospedeiro (JEHLE et al., 2006). Assim, estes autores sugeriram, através de evidências filogenéticas, a divisão da família Baculoviridae em quatro gêneros: Alphabaculovirus: inclui todos os NPVs de lepidópteros formadores dos fenótipos virais BV (do inglês budded virus) e ODV (do inglês occlusion-derived virus); Betabaculovirus: compreende os GVs de lepidópteros que também formam partículas virais durante a infecção; Gammabaculovirus: específico de himenópteros engloba os NPVs que não possuem genes correspondentes às proteínas específicas da partícula BV; Deltabaculovirus: inclui os baculovírus de dípteros que não apresentam em seu genoma um gene homólogo ao que codifica a expressão da poliedrina, característico dos demais NPVs. Portanto, após análise do Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (International Committee of Virus Taxonomy - ICTV) a proposta foi aceita e, nos dias de hoje existem quatro gêneros dentro da família Baculoviridae. No entanto, os nomes científicos dos vírus não foram alterados. Por exemplo, o vírus Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus passou a integrar o gênero Alphabaculovirus. 3. POTENCIALIDADES DO BACULOVÍRUS A família Baculoviridae é a mais numerosa e estudada de todos os grupos de vírus entomopatogênicos. Além disso, são uma parte integrante dos ecossistemas e atuam nas populações naturais dos insetos-praga como um fator de mortalidade que contribui para regular a sua densidade populacional. A transmissão é baseada em duas formas, a forma oclusa do vírus (ODV) e a não oclusa (BV), sendo a primeira responsável pela transmissão de inseto para inseto, enquanto a segunda pela infecção sistêmica, ou seja, pela transmissão de uma célula a outra célula em um mesmo indivíduo (GRANADOS & WILLIAMS, 1986; BLISSARD, 1996; CABALLERO et al., 2009). O ciclo de infecção do baculovírus é iniciado com a ingestão (Figura 1), pela fase larval de um inseto susceptível, de corpos de oclusão (OB, do inglês occlusion bodies) do vírus presentes na superfície das folhas. Os OBs ingeridos se solubilizam no mesêntero do inseto susceptível, liberando os vírions derivados da forma oclusa do vírus (ODV) (1) que, posteriormente, atravessam a membrana peritrófica (MP) através dos poros naturais. Em seguida, a membrana do vírion se funde com a membrana das células epiteliais (2) e os nucleocapsídeos (NC) desprovidos de membrana atravessam o citoplasma (3) dirigindo-se ao núcleo onde ocorre a primeira replicação do DNA viral (4), outros porém atravessam o citoplasma (5) e chegam a membrana basal, sem passar pelo núcleo. Em seguida, os nucleocapsídeos atravessam a membrana celular formando os vírions brotados (BVs) (6) e passam

4 para a cavidade hemocélica através das traqueólas. Na hemocele, os BVs iniciam o processo infeccioso secundário, infectando as células dos órgãos e tecidos por endocitose (7). Os nucleocapsídeos formam novamente BVs favorecendo a dispersão da infecção (8). Em uma fase mais avançada do processo infeccioso vírions e OBs (9) formados acumulam-se na célula e finalmente ocorre a sua liberação no meio devido a ruptura das respectivas células (CABALLERO et al., 2009). Figura 1. Representação esquemática do processo infeccioso do baculovírus. (Fonte: Adaptado de CABALLERO et al., 2009). Os sintomas característicos do processo infeccioso por NPV (Vírus da Poliedrose Nuclear) em lagartas susceptíveis incluem: perda de apetite, geotropismo negativo, clareamento da epiderme devido ao acúmulo de vírus nos núcleos das células epiteliais e no tecido adiposo (RIBEIRO et al., 1998). Assim, os sintomas característicos aparecem depois do terceiro ou quarto dia, sendo que os primeiros sinais observados são manchas no tegumento, o qual adquire uma tonalidade amarelada e aparência oleosa, em seguida, a lagarta reduz sua mobilidade, para de se alimentar e sobe até a parte mais alta da planta, ficando pendurada pelas pernas abdominais e, depois, devido a desintegração dos tecidos internos o tegumento adquire uma coloração escura e ocorre o seu rompimento e consequentemente a liberação dos inóculos virais no ambiente, caracterizando as lagartas mortas como agentes de dispersão do NPV à insetos susceptíveis presentes no ambiente (ZELEDÓN & SOLIS, 2001). Entretanto, podem ocorrer pequenas variações nos sintomas descritos dependendo da espécie infectada, como no caso específico da infecção causada por Baculovirus spodoptera em que as lagartas apresentam uma coloração rosada, em vez da coloração amarelada mencionada acima. Os sintomas são aparentes, o que facilita a diferenciação entre uma lagarta sadia (Figura 2.A) e uma

5 infectada (Figura 2.B). Segundo Federici (1997, 1999) também pode ser observada diminuição do crescimento das lagartas infectadas, isso devido à diminuição na alimentação. Dessa forma, lagartas infectadas ou mortas servem de inóculo para a transmissão horizontal do vírus, por meio da chuva, movimento de outros artrópodes nas plantas, bem como pela predação e parasitismo em insetos infectados (MOSCARDI, 1999). Foto: Arthur Torres Foto: Edmar de Souza Tuelher 2. A 2. B Figura 2. Lagartas de Spodoptera frugiperda. A) Lagarta sadia; B) Lagarta com sintoma típico de infecção por Baculovirus spodoptera. (Fonte (2.B): VALICENTE et al., 2010a) Podemos destacar a susceptibilidade de S. frugiperda, a qual só é susceptível à infecção pelo vírus na fase larval, sendo que a susceptibilidade diminui com o desenvolvimento da lagarta, ou seja, quanto maior o instar, menos susceptível ao baculovírus. Em condições naturais, a forma mais comum de infecção é pela via oral, ocorrendo durante a alimentação das lagartas em partes da planta contaminada com o vírus, no entanto a contaminação da lagarta pode ocorrer através dos ovos, dos espiráculos (orifícios de respiração do corpo) ou através de insetos parasitoides contendo o vírus. Uma vez ingerido, o vírus irá se multiplicar, espalhando-se por todo o corpo do inseto e provocando sua morte 6 a 8 dias após a ingestão. Em média, uma lagarta infectada por SfMNPV ingere apenas 7% do alimento que normalmente seria ingerido por uma lagarta sadia (VALICENTE & CRUZ, 1991). Ainda segundo estes autores, alguns fatores influenciam desde o tempo de aparecimento dos primeiros sintomas da doença, até a morte do inseto infectado, tais como a espécie do hospedeiro, o instar em que ocorreu a infecção, a quantidade de vírus ingerida, a virulência e as condições climáticas durante o período de infecção. Além destes, a temperatura, a irradiação solar, a umidade, o hábito da praga, os equipamentos e a tecnologia para a sua aplicação, são fatores que influenciam a estabilidade e a eficiência do baculovírus. Assim sendo, quando o vírus é aplicado no campo os fatores acima mencionados estão intimamente relacionados com a velocidade de ação do vírus (VALICENTE & CRUZ, 1991).

6 Moscardi (1999) descreve uma sequência de etapas que caracterizam o processo de infecção por baculovírus, de um modo geral, desde a ingestão do vírus até a sua morte: com o progresso da infecção o inseto torna-se debilitado, o que compromete sua capacidade motora e de alimentação, sendo que as lagartas infectadas apresentam a característica de se deslocarem para as partes superiores da planta hospedeira onde morrem depois de determinado tempo. Além disso, o inseto apresenta o corpo de aspecto opaco (branco-leitoso) em relação à lagarta sadia. Após alguns dias, dependendo da espécie hospedeira e do vírus, ocorre o rompimento do corpo do inseto liberando grande quantidade de vírus no ambiente. 4. USO DE BACULOVÍRUS PARA CONTROLE DE PRAGAS NO BRASIL O maior programa mundial de uso de vírus de insetos foi iniciado na década de 1980 pelos trabalhos do Dr. Flávio Moscardi, da Embrapa Soja, localizada em Londrina/PR, utilizando Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) para o controle da Lagarta-da-soja, Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Erebidae). Estima-se que no final da década de 1990, mais de 2 milhões de hectares de soja foram tratados com esse bioinseticida no Brasil e que, para cada 1 milhão de hectares tratados com o vírus cerca de 1,6 milhões de litros de inseticidas sintéticos convencionais deixaram de ser aplicados anualmente (RIBEIRO et al., 1998; MOSCARDI, 1999). Além do exemplo citado, um vírus de granulose tem sido testado no controle do lepidóptero Erinnyis ello (Lepidoptera: Sphingidae), conhecido como Mandarová-da-mandioca, além de outros vírus com potencial de uso, os quais foram isolados de pragas de importantes culturas como a cana-deaçúcar, algodão, trigo, arroz, frutíferas, hortaliças, pastagens e florestais (RIBEIRO et al., 1998). Outro caso específico do uso de vírus entomopatogênico estão relacionados aos trabalhos iniciados em 1982 na Embrapa Milho e Sorgo com o baculovírus para o controle de S. frugiperda (VALICENTE & TUELHER, 2009). Valicente (1989) realizou um levantamento dos principais inimigos naturais de S. frugiperda em diversas regiões produtoras de milho do estado de Minas Gerais, dentre as quais o Sul de Minas, o Vale do Rio Doce e o Alto Paranaíba. Entre 1984 e 1989, foram coletadas mais de lagartas, tendo sido encontrados diversos parasitoides das ordens Diptera e Hymenoptera, além disso, dentre as lagartas coletadas diversas haviam morrido com sintoma típico de vírus e, em levantamento semelhante realizado no estado do Paraná, Valicente & Barreto (1999), detectaram um alto índice de lagartas de S. frugiperda parasitadas e mortas por vírus. Assim, a partir dos resultados buscou-se o desenvolvimento de pesquisas visando a formulação desses agentes biológicos (VALICENTE et al., 2010a) e consequentemente uma forma de otimizar a produção de um bioinseticida à base de Baculovirus spodoptera para o controle da Lagarta-docartucho (VALICENTE et al., 2010b). No entanto, ainda são necessários estudos para que seja disponibilizado um produto comercial a base de Baculovirus spodoptera. Atualmente o banco de baculovírus do Centro Nacional de Pesquisas com Milho e Sorgo (CNPMS) da Embrapa, localizado em Sete Lagoas, Minas Gerais, conta com 22 isolados amostrados em diversas

7 regiões do Brasil. Estes isolados foram estudados, caracterizados e sua eficiência avaliada em relação à Lagarta-do-cartucho (BARRETO et al., 2005). Dentre os isolados mais estudados e eficientes, o isolado 19 já teve seu genoma totalmente sequenciado (WOLFF et al., 2008). Mediante o exposto, nota-se o esforço de diversos pesquisadores, no sentido de tornar corriqueiro o uso de produtos comerciais à base de baculovírus uma realidade para os produtores rurais, entretanto, dentre os fatores limitantes à utilização desses patógenos estão a sua rápida inativação no campo, principalmente promovida por ação da luz ultravioleta (UV) (VILLAMIZAR et al., 2009), bem como a temperatura, que afeta tanto a multiplicação do patógeno quanto o desenvolvimento do hospedeiro (JOHNSON et al., 1982; VAN BEEK et al., 2000; SUBRAMANIAN et al., 2006; SPORLEDER et al., 2008), o canibalismo (VALICENTE et al., 2013), o isolado viral utilizado (BARRETO et al., 2005) e o estádio de desenvolvimento do hospedeiro (idade em que o hospedeiro é infectado) (ESCRIBANO et al., 1999, RIOS-VELASCO et al., 2002). Nesse sentido, estudos sobre os fatores de multiplicação do baculovírus no hospedeiro, suas formas de formulação, período de armazenamento, métodos de aplicação, compatibilidade com outros métodos de controle e efeito sobre organismos não alvo se fazem necessários até a comercialização do produto final. 5. PRODUÇÃO DE BACULOVÍRUS A produção de baculovírus pode ser realizada in vivo, que é a forma mais empregada, e in vitro, onde se concentram diversos estudos em termos da biologia do baculovírus e de seu processo de infecção. No sistema de produção in vivo, para a multiplicação viral, insetos hospedeiros são criados em laboratório e alimentados com dieta artificial, num processo que geralmente resulta em um produto final de custo elevado, muitas vezes não competitivo com o custo dos produtos químicos disponíveis (MOSCARDI, 1999; MOSCARDI & SOUZA, 2002). Por isso, a importância de se estudar os fatores que afetam a multiplicação do vírus no interior do hospedeiro, tais como a temperatura e a idade ideal de inoculação do vírus, bem como, a possibilidade de utilização de hospedeiros alternativos (nos casos em que o hospedeiro preferencial do vírus apresenta comportamento canibal) ou da possibilidade de utilização de um isolado que não provoca o rompimento imediato da lagarta após sua morte (Figura 3.A), em relação a um isolado que provoque o rompimento imediato do tegumento do inseto (Figura 3.B), o que reduz as perdas de poliedros virais durante a coleta das lagartas que precede a formulação do bioinseticida, como no caso do Baculovirus spodoptera em que a descoberta de um isolado altamente virulento e que não provoca o rompimento imediato do tegumento larval aumentou a eficiência do processo de produção reduzindo as perdas no processo de fabricação e facilitando o manuseio das larvas mortas pelo vírus (VALICENTE et al., 2008; VIEIRA et al., 2012; VALICENTE et al., 2013).

8 Fotos: Fernando Hercos Valicente 3. A 3. B Figura 3. Lagartas de Spodoptera frugiperda mortas por Baculovirus spodoptera. A) Lagartas mortas com o isolado (I6) que não provoca o rompimento imediato do tegumento; B) Lagartas mortas com o isolado que provoca o rompimento imediato do tegumento. (Fonte: VALICENTE et al., 2010b) 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS Com o aumento dos questionamentos da sociedade sobre os problemas do uso inadequado dos inseticidas químicos, como aqueles relacionados à segurança do aplicador, do ambiente e da saúde humana, maior tem sido a cobrança para redução no uso desses produtos e com isso, os inseticidas biológicos têm sido mais usados em diferentes culturas. Assim, considerando o vasto número de espécies de vírus entomopatogênicos existentes, o desenvolvimento de bioinseticidas não tem sido compatível com todo o potencial que apresenta. A maioria dos vírus comercializados são produzidos por pequenas e médias empresas ou pelos próprios usuários. Entre os fatores limitantes a sua comercialização estão sua alta especificidade em relação ao hospedeiro, baixa velocidade de ação, baixa persistência no campo e alto custo de produção (RODRIGUEZ et al., 2012). Atualmente mais de 50 produtos a base de baculovírus são utilizados em todo o mundo como inseticidas microbianos (LAPOINTE et al., 2012). Para atender a essa demanda do mercado, que só tem aumentado, e aproveitar as potencialidades de utilização dos vírus entomopatogênicos, mais pesquisas devem ser realizadas para aprimorar os métodos de obtenção dos produtos à base de vírus, bem como pesquisas que visem aumentar a eficiência de tais produtos, seja pelos métodos de formulação, pelo uso de diferentes materiais inertes, ou pela adição de adjuvantes e protetores contra radiação ultravioleta. Seja pela seleção de genótipos de isolados mais virulentos, ou pelo aprimoramento das técnicas de multiplicação do vírus em laboratório. Entretanto, para que o uso de produtos à base de vírus entomopatogênicos se torne rotineiro para o produtor rural, apenas o apelo ambiental pelo uso de tais produtos na maioria das vezes não é o suficiente para consolidar um bioinseticida no mercado, pois para que isso ocorra o produto deve ser de fácil preparo e aplicação, pelo menos tão eficiente quanto os produtos sintéticos

9 comerciais disponíveis no mercado e, também, devem ser comercializados a preços competitivos com o dos demais inseticidas. Portanto, a busca por um produto com essas características demanda um enorme esforço, seja no âmbito da pesquisa, bem como nos processos relacionados à introdução de um bioinseticida no mercado, tendo em vista a competição com as multinacionais da indústria química e, também uma maior conscientização das autoridades governamentais, seja para o apoio às pesquisas com inimigos naturais e também políticas voltadas ao uso desses agentes, favorecendo assim o uso nos mais diversos sistemas produtivos, favorecendo assim a produção e o consumo de alimentos livres de resíduos químicos. 7. REFERÊNCIAS BARRETO, M. R.; GUIMARÃES, C. T.; TEIXEIRA, F. F.; PAIVA, E.; VALICENTE, F. H. Effect of Baculovirus spodoptera isolates in Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) larvae and their characterization by RAPD. Neotropical Entomology, Londrina, v. 34, n. 1, p , BLISSARD, G. W. Baculovirus insect cell interactions. Cytotechnology, Dordrecht, v. 20, p , CABALLERO, P.; MURILLO, R.; MUÑOZ, D.; WILLIAMS, T. El nucleopoliedrovirus de Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) como bioplaguicida: análisis de avances recientes en España. Revista Colombiana de Entomologia, Bogotá, v. 35, n. 2, p , CASTRO, M. E. B.; SOUZA, M. L.; BILIMORIA, S. L. Host-specific transcription of nucleopolyhedrovirus gene homologues in productive and abortive Anticarsia gemmatalis MNPV infections. Archives of Virology, Wien, v. 144, n. 6, p , COSTA, E. L. N.; LUCHO, A. P. R.; FRITZ, L. L.; FIUZA, L. M. Artrópodes e Bactérias Entomopatogênicos. Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento, Brasília, ano XI, n. 38, p. 4-13, ESCRIBANO, A.; WILLIAMS, T.; GOULSON, D.; CAVE, R. D.; CHAPMAN, J. W.; CABALLERO, P. Selection of a nucleopolyhedrovirus for control of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): Structural, genetic, and biological comparasion of four isolates from the Americas. Journal of Economic Entomology, College Park, v. 92, n. 5, p , 1999.

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