INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EGAS MONIZ

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1 INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EGAS MONIZ LICENCIATURA EM CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO AVALIAÇÃO DA RADIAÇÃO GAMA COMO TRATAMENTO ALTERNATIVO DE PRESERVAÇÃO DE MANTEIGAS -IDENTIFICAÇÃO DE PCC'S, ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS, FÍSICO-QUÍMICAS, SENSORIAIS E EXTENSÃO DO TEMPO DE PRATELEIRA Trabalho submetido por Maria Inês Leitão de Carvalho Santos para a obtenção do grau de Licenciado em Ciências da Nutrição Setembro de 2015

2 INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS DA SAÚDE EGAS MONIZ LICENCIATURA EM CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO AVALIAÇÃO DA RADIAÇÃO GAMA COMO TRATAMENTO ALTERNATIVO DE PRESERVAÇÃO DE MANTEIGAS -IDENTIFICAÇÃO DE PCC'S, ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS, FÍSICO-QUÍMICAS, SENSORIAIS E EXTENSÃO DO TEMPO DE PRATELEIRA Trabalho submetido por Maria Inês Leitão de Carvalho Santos para a obtenção do grau de Licenciado em Ciências da Nutrição Trabalho orientado por Professor Doutor António Raposo Engenheira Paula Matos Setembro de 2015

3 Resumo Resumo A irradiação de alimentos é uma das poucas tecnologias que permite o aumento da segurança alimentar, preservando as qualidades nutricionais dos alimentos. Esta permite evitar deteriorações de origem alimentar e eliminar microorganismos patogénicos, sem afectar significativamente a qualidade sensorial e nutricionais dos alimentos. Para os estudos de inactivação microbiana, a nata fermentada e nata sem fermento foram irradiadas a várias doses sub-letais (1 kgy até 5 kgy) numa fonte de Co-60 e foram analisadas através de métodos microbiológicos convencionais. Foram produzidos três tipos de manteigas: manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada a 3 kgy, manteiga cuja nata fermentada foi irradiada e manteiga cuja nata não foi irradiada. A partir destas manteigas foram efectuadas análises microbiológicas, sensoriais e físicoquímicas (determinação do teor de água e medição dos valores de ph) a diferentes tempos (0 dias, 15 dias e 30 dias) de forma a estimar o tempo de prateleira do produto. A curva de inactivação microbiana, determinada para a nata fermentada irradiada e nata não fermentada irradiada, mostrou uma diminuição do número de bactérias mesófilas totais e de fungos filamentosos, principalmente nas doses de 3 kgy e 5 kgy. No entanto, o processo de irradiação não mostrou ser eficiente na redução da carga microbiana das manteigas cuja nata foi sujeita ao processo de irradiação. Este resultado poderá dever-se a uma contaminação posterior ao processo de irradiação. A determinação do teor de água das amostras irradiadas e não irradiadas mostrou um aumento de 10% de água na manteiga produzida a partir de nata irradiada. Este aumento pode ser um factor importante para o desenvolvimento microbiano e consequentemente para a deterioração do produto final. Os resultados obtidos mostraram que a irradiação a doses baixas não causou alterações sensoriais na manteiga. Contudo, sendo os produtos lácteos produtos sensíveis à radiação gama, são necessários estudos mais aprofundados para determinar qual a melhor estratégia a adoptar na sua irradiação. Palavras-chave: radiação ionizante; irradiação de alimentos; radiação gama; manteiga de ovelha; teor de água; carga microbiológica; análise sensorial; PCC s 2

4 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas Abstract Food irradiation is one of the few technologies that address both food quality and safety due to its ability to control spoilage and foodborne pathogenic microorganisms without significantly affecting sensory or nutritional attributes of the food. For microbiological inactivation studies, fermented cream and no fermented cream was irradiated at several sub-lethal doses (1 kgy up to 5 kgy) in a Co-60 source an analyzed for conventional microbiology methods. Three types of butter were produced: butter whose no fermented cream was irradiated at 3kGy, butter whose fermented cream was irradiated at 3kGy and butter whose cream w as not irradiated. From these butters were carried out microbiological, sensorial and physico-chemical analyzes (determination of water content and measurement of ph) at different times (0 days, 15 days and 30 days ) in order to estimate the product's shelf-life. The microbiological inactivation curve, determined for fermented cream and no fermented cream, showed a decrease of total mesophilic bacteria and filamentous fungi, mainly at an absorbed dose of 3 kgy and 5 kgy. However, the irradiation process shown no efficiency in reducing the microbial load of butter whose cream was subjected to an irradiation process. This result may be due to a subsequent contamination to the irradiation process. The analysis of water content of irradiated and non-irradiated samples revealed an increase of 10% of water on butter produced from irradiated cream. This rise could be an important factor for the microbiota development and spoilage of the final product during time. The obtained results shown that gamma irradiation, at low doses had no adverse effects on the sensory quality attributes of butter. However dairy products still are a sensible product to expose to gamma radiation, and more studies are needed to determine the best strategy to adopt. Key-words: ionizing radiation; food irradiation; gamma radiation; sheep butter; water content; microbiological load; sensory analyses; PCC s. 3

5 Introdução Introdução A irradiação de alimentos é uma das tecnologias mais estudadas como possível solução para o aumento da segurança microbiológica e do tempo de prateleira dos alimentos. Várias entidades internacionais como a FAO (Food and Agricultural Organization), IAEA (International Atomic Energy Agency), WHO (World Health Organization) e o Comité Cientifico da Alimentação da Comissão Europeia defendem que os alimentos irradiados são seguros e nutricionalmente adequados (Farkas & Farkas, 2011). A irradiação de alimentos é um processo físico que consiste na exposição dos alimentos a uma quantidade de radiação específica e controlada. O tipo de energia de radiação que é utilizada é denominada radiação ionizante (ACSH, 2007; Food and Agriculture Organization, 1999). A radiação ionizante consiste numa onda electromagnética ou numa partícula (fotão, protão, electrão, etc) que transporta energia suficiente para remover um electrão de um átomo ou molécula processo denominado por ionização (Little, 2003; IST, 2006). A radiação ionizante pode ter a capacidade de modificar física, química e biologicamente as propriedades dos materiais que estão ser irradiados uma vez que é dotada de energia suficiente para modificar as moléculas (International Atomic Agency). A B Figura 1- Efeito da radiação na inactivação microbiana. Fonte: chem/nuclear/pics/fruit.gif Figura 2- Morangos não irradiados (A) e morangos irradiados (B) Fonte: im/irra1.html Durante o processo de irradiação os alimentos não entram em contacto directo com a fonte radioactiva e devido às suas características físicas, não é possível tornarem-se radioactivos, independentemente da dose de energia absorvida e do período de tempo ao qual são expostos (ACSH, 2007). A unidade do Sistema Internacional que mede a 4

6 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas energia absorvida por dose de radiação ionizante é o Gray (Gy) que equivale a 1 J de energia por Kg de produto (International Atomic Agency). O processo de irradiação é cada vez mais reconhecido como um método seguro e eficaz para garantir a segurança microbiológica e a preservação de alimentos por longos períodos de tempo, sem ser necessário recorrer-se à utilização de conservantes (Farkas, 2006; Wood, 2000; Rady & Badr, 2003). Assim sendo, é um processo utilizado para manter a qualidade de muitos géneros alimentícios, incluindo produtos lácteos. Inclusivamente, alguns estudos referem que o tratamento com doses de radiação gama até 10 kgy pode prolongar o tempo de prateleira da manteiga (Rady & Badr, 2003). Manteiga A designação de manteiga tradicional é utilizada quando o produto é obtido directamente a partir do leite ou da nata. A manteiga é considerada uma matéria gorda láctea e apresenta-se sob forma de emulsão sólida e maleável, principalmente do tipo emulsão aquosa de gordura. Possui um teor de matéria gorda láctea mínimo de 80% e máximo de 90%, um teor máximo de água de 16% e de matérias lácteas secas e não gordas de 2%. Relativamente à manteiga com sal, esta deverá ter um teor máximo de sal de 2% em peso (Regulamento nº 1234/2007). Quando a manteiga não provem da espécie bovina, deverá ser especificada a sua origem. Deste modo, a manteiga de ovelha e cabra terão que ser assim designadas e rotuladas. Dependendo do tipo de manteiga que se trata (ovelha, cabra ou vaca) a sua constituição nutricional é variável, sendo a manteiga de cabra a que apresenta uma maior percentagem de gordura na sua constituição (INSA, 2010). Legislação De acordo com a legislação actualmente em vigor em Portugal, os géneros alimentícios só podem ser tratados por radiação ionizante caso esta seja: justificada e necessária do ponto de vista tecnológico; inofensiva para a saúde e praticada de acordo com as condições propostas; benéfica para o consumidor e que não seja utilizada para substituir normas sanitárias e de higiene nem boas práticas de fabrico ou de cultivo. Por 5

7 Introdução outro lado, a irradiação de alimentos deverá ter como objectivos: a redução do risco de doenças de origem alimentar, pela destruição de organismos patogénicos; a redução da alteração dos géneros alimentícios, retardando processos de deterioração e destruindo os organismos responsáveis por essa deterioração; a redução da perda de géneros alimentícios pelo amadurecimento e a desinfestação dos alimentos por organismos que lhes sejam prejudiciais (Decreto-Lei N.º 337/2001). Relativamente às fontes de radiação ionizante, os alimentos podem ser tratados por raios gama, emitidos por radionuclídeos Co-60 ou Cs-137; raios X, produzidos por aparelhos que funcionem com uma energia nominal igual ou inferior a 5 MeV e por electrões produzidos por aparelhos que funcionem com uma energia nominal igual ou inferior a 10 MeV (Decreto-Lei N.º 337/2001). Em Portugal, os únicos alimentos que podem ser tratados por radiação ionizante para fins comerciais são as ervas aromáticas secas, as especiarias e os condimentos vegetais (Decreto-Lei N.º 337/2001). Radiação Gama Existem vários tipos de radiações ionizantes mas a fonte de radiação que é normalmente utilizada no tratamento dos alimentos é a radiação gama emitida pelo radionuclídeo de Co-60 (ACSH, 2007). Os raios gama são ondas electromagnéticas produzidas pelo decaimento radioactivo, cuja energia é superior a 10 KeV. Não têm carga eléctrica nem massa, a sua velocidade média é igual à da luz ( km/s) e possuem alto poder de penetração, tendo capacidade de provocar danos irreparáveis no organismo (Little, 2003; IST, 2006; Matos, 2003; Antunes, 2012). Figura 3- Decaimento do 60Co. Fonte: ation+for+cobalt-60 Figura 4- Poder de penetração das diferentes radiações ionizantes. Fonte: 6

8 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas O tratamento por radiação gama é um processo que não deixa resíduos nos materiais irradiados e que permite o seu manuseamento e utilização logo após o processo de irradiação. Por ser um tipo de radiação altamente penetrante, a irradiação de produtos na sua embalagem final torna-se possível, evitando riscos de contaminação cruzada. É um processo não térmico, ou seja com ausência de aquecimento ou aquecimento fraco, levando a alterações sensoriais pouco significativas. Permite a preservação dos alimentos frescos num só tratamento, sem ser necessário recorrer ao uso de conservantes. É considerado um processo controlado automaticamente e os seus gastos em energia são baixos (CHIPKOMPENDIUM). Alterações Nutricionais O processo de irradiação não leva ao aumento da temperatura dos alimentos que estão a ser submetidos à radiação, levando apenas a pequenas perdas nutricionais. Quando comparada com outros processos de preservação ou métodos culinários verifica-se que as alterações nutricionais provocadas pela radiação gama são muito semelhantes (ACSH, 2007; Farkas, 2006; Food and Agriculture Organization, 1999; Wood, 2000). Os macronutrientes, aminoácidos essenciais, minerais, elementos vestigiais e a maior parte das vitaminas, não sofrem alterações significativas com o processo de irradiação, permitindo assim a conservação das propriedades nutricionais dos alimentos. As vitaminas apresentam diferentes sensibilidades ao processo de irradiação, que vão depender da sua solubilidade em água e gordura (hidrossolúveis e lipossolúveis), da complexidade do sistema do alimento em que estão inseridas e da atmosfera a que a o processo de irradiação ocorre. Segundo a literatura as vitaminas B1, C, A e E são as mais sensíveis à irradiação. A sua perda pode ser minimizada pela irradiação dos alimentos congelados ou armazenados numa atmosfera controlada, como por exemplo azoto (Food and Agriculture Organization, 1999; Wood, 2000). Na irradiação dos lípidos, o efeito directo dos electrões incidentes conduz a radicais catiónicos ou a moléculas excitadas. No entanto, a natureza dos compostos produzidos a partir de gorduras mediante um tratamento por calor é similar aos que se obtêm por irradiação. Existem certas diferenças qualitativas e quantitativas, mas de um geral têm-se identificado mais produtos de decomposição a partir das gorduras oxidadas 7

9 Introdução termicamente do que a partir das gorduras irradiadas (Dielh, 1990). Algumas alterações na composição lipídica podem ocorrer após irradiação durante o armazenamento, devido a reacções auto-oxidativas, levando à formação, na maior parte dos casos, de hidrocarbonetos, aldeídos e cetonas, alguns dos quais responsáveis pelo ranço e pelo seu característico e odor (Who, 1999) As alterações nutricionais provocadas pelo processo de irradiação dependem de vários factores como a dose a que os alimentos são expostos, a natureza dos alimentos em causa, a embalagem onde se encontram armazenados e a temperatura existente no decorrer do processo de irradiação (Wood, 2000). Alterações Sensoriais O processo de irradiação pode causar alterações químicas nos alimentos que, por sua vez, podem levar a alterações na sua qualidade sensorial. É essencial ter em consideração que a irradiação implica condições próprias e doses específicas para diferentes alimentos, só assim é possível a obtenção de bons resultados. Doses demasiado elevadas poderão afectar a qualidade sensorial dos alimentos, mas doses demasiado baixas poderão não conduzir ao objectivo pretendido (ACSH, 2007). Alterações Químicas A água é o constituinte principal de muitos alimentos, encontrando-se, frequentemente, ligada a outros componentes (Belitz, Grosch & Schieberle, 2008; Mathouthi, 2001). Como um meio, participa em diversas reacções químicas e é um reagente directo de muitos processos hidrolíticos. A sua interacção física com proteínas, polissacarídeos, lípidos e sal, faz como que contribua de forma significativa para a textura dos alimentos sendo a sua determinação uma das análises mais realizadas nos laboratórios de indústria alimentar (Belitz, 2008; Mathouthi, 2001; Isengard, 1995). A determinação do teor e água tem uma grande importância na estabilidade microbiológica, tempo de prateleira e propriedades sensoriais dos alimentos e deve 8

10 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas basear-se na determinação analítica do conteúdo de água; actividade termodinâmica da água e no estudo da sua estrutura molecular (Mathouthi, 2001; Isengard, 1995). O método mais comum para a determinação do teor de água é o método de secagem em estufa, sendo a técnica analítica de referência para vários alimentos, em diferentes países (Mathouthi, 2001; Isengard, 1995). Este método baseia-se na determinação da massa perdida pela amostra depois da secagem. No entanto, podem ser encontrados diferentes tipos de erros neste método de secagem como por exemplo: remoção incompleta da água; perda de gases voláteis; formação de uma crosta na superfície da amostra, que poderá reter água; decomposição do produto e reacção de Maillard, os quais levam à produção de água (Mathouthi, 2001). A remoção da água dos alimentos retarda diversas reacções e inibe o crescimento de microrganismos, aumentando o tempo de prateleira de diversos alimentos (Belitz, 2008). Os alimentos são constituídos maioritariamente por água e ao serem sujeitos ao processo de irradiação, a maior parte da energia é absorvida pelas moléculas de água. Assim sendo, a radiólise da água é de particular importância para compreender os efeitos da radiação nos alimentos. Entende-se por radiólise as transformações químicas que ocorrem quando um substrato absorve energia ionizante. Os produtos formados são designados por produtos radiolíticos. A formação dos produtos da radiólise aumenta geralmente de forma linear com o aumento da dose de irradiação. A temperatura do processo durante a irradiação pode ser um factor importante uma vez que num alimento congelado os radicais reactivos da radiólise não estão livres para interagir uns com os outros ou com outros componentes do alimento. Deste modo, a congelação pode proteger os componentes do alimento face aos efeitos da radiação ionizante (Diehl, 1990). 9

11 Objectivos Objectivos Objectivos gerais O presente estudo teve como objectivo avaliar a eficácia da tecnologia de irradiação, como um tratamento de descontaminação microbiana em manteigas de ovelha e, desta forma, aumentar o tempo de prateleira do produto, sem se verificar rejeição do mesmo por parte dos consumidores. Objectivos Específicos 1. Elaborar o fluxograma de fabrico das manteigas e identificar os Pontos Críticos de Controlo (PCC s); 2. Identificar, no fluxograma de fabrico das manteigas, a fase do processo em que a radiação gama poderá ser aplicada; 3. Avaliar a carga microbiana das manteigas; 4. Determinar o teor de água das manteigas; 5. Estudar do efeito do tratamento por da radiação gama no ph das amostras em estudo; 6. Avaliar as manteigas do ponto de vista sensorial; 7. Avaliar o efeito da radiação gama no tempo de prateleira das manteigas. 10

12 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas Materiais e Métodos 1. Caracterização do produto/ Amostra As amostras analisadas foram recolhidas dos Pontos Críticos de Controlo (PCC s) identificados no fluxograma de produção das manteigas (Figura 5), nomeadamente: leite cru, leite pasteurizado, nata sem fermento, nata fermentada, água (água da torneira e água da torneira armazenada em baldes), grão antes da prensagem, grão após prensagem, manteiga nos moldes, manteiga depois do corte e manteiga embalada. Todas as amostras foram recolhidas na empresa Nacional de Lacticínios Tété e transportadas, em condições refrigeradas adequadas, para o Laboratório de Ensaios Tecnológicos em Áreas Limpas (LETAL) para serem analisadas. Figura 5 Fluxograma de produção das manteigas da empresa Tété, elaborado no decorrer do trabalho. 11

13 Materiais e Métodos 2. Análises Microbiológicas 2.1 Determinação da Carga Microbiana das amostras As amostras de leite cru e leite pasteurizado (100 ml) foram colocadas num saco de stomacher estéril juntamente com 100 ml água peptonada. A solução foi homogeneizada no equipamento Stomacher, durante 10 minutos. As amostras de nata (25 g) foram colocadas num saco de stomacher estéril com 225 ml de água peptonada e homogeneizadas durante 10 minutos. As amostras de grão e manteiga (25g) foram colocadas num saco estéril com 225 ml de água peptonada e homogeneizadas em banho-maria (30ºC) com agitação, durante 15 minutos. As amostras de água (100 ml) foram filtradas através de uma membrana de nitrocelulose de 0,45 μm, e as membranas foram colocadas nos meios de cultura sólidos Tryptic Soy Agar (TSA) para a população bacteriana mesófila e Malt Extract Agar para a população fúngica (MEA). Para as restantes amostras foi efectuado o espalhamento de alíquotas e/ou diluições decimais seriadas em soro fisiológico nos meios de cultura sólidos TSA e MEA. Cada inoculação foi efectuada em triplicado para cada amostra e para cada meio de cultura. As placas de TSA e MEA foram incubadas, durante 7 dias, a 30ºC e 27º C, respectivamente. Posteriormente foi efectuada a contagem de colónias, o cálculo das Unidades Formadoras de Colónias (UFC) e a caracterização fenotípica dos isolados bacterianos e fúngicos. Todos os procedimentos efectuados no decorrer das análises microbiológicas foram realizados em condições de assepsia. 2.2 Estudo de inactivação da carga microbiana das amostras de nata Foram pesadas 25 g de nata fermentada e nata sem fermento, colocadas em sacos de stomacher estéreis e irradiados a diferentes doses de radiação gama, 1 kgy, 3kGy e 5 kgy, a um débito de dose de 1,47 kgy/h. Para a monitorização da dose absorvida foram colocados dosímetros de rotina Amber (lote x, para doses de 1-30kGy) juntamente com as amostras. O controlo, nata não irradiada (0 kgy), foi sujeito às mesmas condições das restantes amostras. A irradiação das amostras foi efectuada na fonte experimental de Co-60 Precisa 22 (Graviner, Lda, UK). Os tempos de exposição das amostras foram 35 minutos, 1h 44 12

14 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas minutos e 2h 53 minutos. Posteriormente foram colocados 225 ml de água peptonada em cada um dos sacos estéreis e as soluções foram homogeneizadas no equipamento Stomacher, durante 10 minutos. Foi efectuado o espalhamento de alíquotas e/ou diluições decimais seriadas das amostras em soro fisiológico nos meios de cultura sólidos TSA (população mesófila bacteriana) e MEA (população fúngica). Cada inoculação foi efectuada em triplicado para cada amostra e para cada meio. As placas de TSA e MEA foram incubadas, durante 7 dias, a 30ºC e 27º C, respectivamente. Posteriormente foi efectuada a contagem de colónias, o cálculo das Unidades Formadoras de Colónias (UFC) e a caracterização fenotípica dos isolados bacterianos e fúngicos. 2.3 Avaliação da extensão do tempo de prateleira das manteigas Foram recolhidos 5 L de nata fermentada (N2) e 5 L de nata sem fermento (N1). Após serem sujeitas ao processo de irradiação (3 kgy), as amostras de nata foram utilizadas como matéria-prima para a produção de manteiga: manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada (M3N1) e manteiga cuja nata fermentada foi irradiada (M3N2). Foi também produzida manteiga sem nenhum dos seus constituintes ter sido exposto à radiação (M3). Após concluído o seu processo de fabrico, as manteigas foram recolhidas e armazenadas nas condições de refrigeração adequadas (4ºC), até se proceder à sua análise. Foram recolhidas 15 embalagens de manteiga, de aproximadamente 25 g, de cada um dos tipos acima referidos (M3, M3N1 e M3N2), para se realizarem vários tipos de análises: microbiológicas, físico-químicas e sensoriais. Estas análises foram efetuadas a diferentes tempos de armazenamento refrigerado a 4ºC, no momento da recolha das manteigas (0 dias - T0) e ao fim de 15 (T15), 30 (T30), 60 (T60) e 90 (T90) dias. A irradiação das amostras de nata foi efectuada na Unidade Tecnológica de Radioesterilização (UTR) e no equipamento Precisa 22 (Graviner, Lda, UK). O tempo de irradiação na UTR foi de 2 h, com uma actividade de 2775 TBq ( 75 Kci) e com um débito de dose de 1,75 kgy/h. No equipamento Precisa 22 a irradiação das amostras contou com um período de 3 h sendo a sua actividade de 140 TBq ( 3,8 Kci) e o débito de dose de 0,31 kgy/h,. As natas foram irradiadas directamente nos recipientes de 13

15 Materiais e Métodos recolha, à temperatura ambiente, sendo rodados em 180º quando atingido meio tempo de irradiação. Estas manteigas, à excepção da manteiga não irradiada foram fabricadas exclusivamente para fins de investigação, no âmbito deste estudo. Para a análise microbiológica foram pesados 6,5g de cada um dos tipos de manteiga e colocados num saco estéril com 58 ml de água peptonada. Foi efectuado o espalhamento de alíquotas e/ou diluições decimais seriadas das amostras em soro fisiológico nos meios de cultura sólidos TSA (população mesófila bacteriana) e MEA (população fúngica). Cada inoculação foi efectuada em triplicado para cada amostra e para cada meio de cultura. As placas de TSA e MEA foram incubadas, durante 7 dias, a 30ºC e 27º C, respectivamente. Posteriormente foi efectuada a contagem de colónias, o cálculo das Unidades Formadoras de Colónias (UFC) e a caracterização fenotípica dos isolados bacterianos e fúngicos. 3. Análises Físico-Químicas 3.1 Medição do ph das amostras de nata antes e após o processo de irradiação As medições dos valores de ph foram efectuadas num potenciómetro (Radiometer, modelo PHM210) após a sua calibração com as soluções tampão adequadas à gama de ph das amostras. Foram determinados os valores das seguintes amostras: leite cru, leite pasteurizado, nata sem fermento (antes e após irradiação), nata fermentada (antes e após irradiação) e água. 3.2 Determinação do teor de água da manteiga Avaliação da extensão do tempo de prateleira das manteigas A determinação do teor de água da manteiga seguiu o procedimento descrito no Regulamento nº880/98, que estabelece o método de referência para a determinação do teor de água. O processo utilizado foi o método de secagem em estufa, à temperatura de 102ºC, na presença de pedra-pomes. Começou por se secar a pedra-pomes, já lavada, 14

16 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas num cadinho, durante 1 h. Posteriormente foi colocada uma porção da amostra no recipiente e colocou-se na estufa a 102ºC durante 3h. Repetiu-se a secagem durante períodos suplementares de 1h, até a massa se tornar constante (variação de massa não superior a 1 mg). Foram efectuadas 2 réplicas para cada amostra de manteiga (Regulamento N.º 880/98). A determinação do teor de água da manteiga foi repetida diferentes tempos de armazenamento refrigerado: T0; T15; T30; T60 e T Análise Sensorial A análise sensorial dos três tipos de manteigas foi realizada no Campus Tecnológico e Nuclear (CTN) por um painel de provadores não treinado. De forma a estimar a aceitabilidade de cada produto, foi realizado um questionário baseado no regulamento 273/2008 que no, anexo IV artigo 4, estabelece diversas regras para o Exame Organoléptico da Manteiga. No questionário foram avaliados o aspecto, sabor, aroma, consistência textura e o teor de sal. A escala de classificação utilizada no questionário e algumas das características avaliadas foram retirados directamente do regulamento n.º 1234/2007. A análise sensorial foi repetida a diferentes tempos de armazenamento refrigerado: T0; T15; T30; T60 e T90 e o número de provadores que fizeram parte do painel variou de acordo com as repetições efectuadas. Todas as amostras sujeitas ao painel de provadores foram devidamente codificadas de forma a não ser possível a sua identificação. A classificação utilizada no questionário baseou-se na seguinte escala: 1- Muito fraco (defeitos acentuados) 2- Fraco (defeitos evidentes) 3- Razoável (defeitos ligeiros) 4- Bom (sem defeitos evidentes) 5- Muito Bom (Tipo ideal) 15

17 Resultados e Discussão RESULTADOS e DISCUSSÃO 1. Análise Microbiológicas 1.1 Determinação da carga microbiana de bactérias mesófilas totais e fungos filamentosos das amostras recolhidas nos PCC s identificados como Pontos Crítico de Controlo (PCC s) são pontos, procedimentos, operações ou etapas nas quais o controlo deve ser aplicado, sendo essencial para prevenir, reduzir a níveis aceitáveis ou eliminar um risco relacionado com a inocuidade dos alimentos. Assim, após a sua identificação foi estimada a carga microbiana média das amostras recolhidas nos PCC s (Figura 6). 10,00 10,00 Log UFC/mL 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 A L.C. L.P H2O T H2O Amostras Log UFC/g 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 B N1 N2 G1 G2 M1 M2 M3 Amostras Log UFC/mL 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 C L.C. L.P H2O T H2O Amostras Log UFC/g 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 D N1 N2 G1 G2 M1 M2 M3 Amostras Legenda: L.C.- Leite Cru L.P.- Leite Pasteurizado H 2 O T- Água da Torneira H 2 O- Água do Balde N1- Nata sem fermento N2- Nata fermentada G1- Grão antes da prensagem G2- Grão após prensagem M1- Manteiga nos moldes M2- Manteiga depois do corte M3 manteiga embalada Figura 6 - População fúngica (A e B) e bacteriana (C e D) das amostras recolhidas nos PCC s identificados. 16

18 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas De acordo com os resultados obtidos, verifica-se que a amostra de nata sem fermento é a que apresenta uma maior concentração de fungos filamentosos (Figura 6 B) e as amostras de nata fermentada e grão após prensagem são as amostras que apresentaram uma maior contaminação de bactérias mesófilas totais (Figura 6 D). Por outro lado, após a análise dos resultados obtidos, verifica-se que o número estimado de bactérias mesófilas totais na amostra de água recolhida directamente da torneira (Figura 6 C) e na amostra de água proveniente da torneira, que posteriormente é armazenada num balde, (Figura 6 C) é bastante discrepante. Enquanto a primeira não apresenta contaminação possível de ser detectada pelo método utilizado, a segunda apresenta uma concentração de bactérias mesófilas totais superior a UFC/ml. Por este motivo, podemos referir que, para além dos PCC's identificados no fluxograma de produção das manteigas, a higienização dos equipamentos e recipientes poderá ser também um ponto crítico a controlar Identificação da população de fungos filamentosos nas amostras identificadas como PCC s Após a análise microscópica da população de fúngica presente nas amostras foram identificados os seguintes fungos: Geotrichium sp, Geotrichium Candido; Ulocladium sp; Clodosporium sp e Phoma sp (Tabela 1). Tabela 1- Fungos filamentosos detectados das amostras recolhidas nos PCC s e respecticva frequência relativa. Amostra Fungos Filamentos Frequência Relativa Leite Cru Geotrichium sp. 100% Nata fermentada Geotrichium candium 100% Grão antes da prensagem Geotrichium candium 100% Grão após prensagem Geotrichium sp. 67% Geotrichium candium 33% Ulocladium sp. 33% Manteiga no molde Cladosporium sp. 33% Phoma sp 33% Manteiga depois do corte Geotrichium sp 50% Ulocladium sp. 50% Manteiga embalada Geotrichium sp. 100% 17

19 Resultados e Discussão Geotrichium é um género que inclui fungos filamentosos encontrados em produtos lácteos sendo, algumas das suas espécies, utilizadas como cultura adjunta na maturação de queijo (Gente et al., 2002). As espécies pertencentes ao género Ulocladium são possíveis agentes de deterioração de alimentos estando, contudo, raramente ligadas a infecções fúngicas. Relativamente às espécies do género Cladosporium são normalmente consideradas como contaminantes saprófitas. O género Phoma. inclui espécies que podem ser responsáveis por infecções fúngicas. Por fim, a espécie Geotrichium candium é um fungo que é geralmente encontrado na flora normal dos humanos só se tornando causador de doenças em hospedeiros com o sistema imunitário comprometido. (Larone, 2002). 1.2 Estudo da inactivação da carga microbiana das amostras de nata Tendo em conta os resultados obtidos na determinação da carga microbiana das amostras (Tabela 2) e de acordo com a legislação actualmente em vigor, optou-se por escolher as amostras de nata fermentada e a nata sem fermento para serem tratadas por irradiação. A aferição da dose absorvida pelas amostras foi executada recorrendo à utilização de dosímetros de rotina, que envolvem medições de espessura e de absorvância (603 nm). Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 2. Tabela 2 Determinação da dose absorvida pelas amostras. Amostra Dose pretendida (kgy) Tempo de Irradiação previsto (hh:mm) Dose absorvida (kgy) Nata sem fermento (N1) Nata fermentada (N2) : :35 0,98 01:44 2,71 02:53 4,18 00: :35 0,85 01:44 2,25 02:53 3,98 18

20 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas De modo a analisar a cinética de inactivação microbiana por radiação gama nas amostras de nata, foram construídas curvas de sobrevivência microbiana (Log UFC em função da dose de radiação gama absorvida pelo produto). 12,00 10,00 Log UFC/g 8,00 6,00 4,00 Nata fermentada Nata não fermentada 2,00 0, Dose (kgy) Figura 7 Curva de sobrevivência microbiana em nata fermentada e não fermentada após irradiação. As barras de erro representam o intervalo de confiança a 95% sobre a média (n=6; α=0,05). Segundo os resultados obtidos (Figura 7), verificou-se na nata fermentada após irradiação a 5 kgy uma redução de aproximadamente 6 log, ou seja de 10 9 bactérias para 10 3 bactérias. Na nata não fermentada após irradiação a 5 kgy foi detectada uma redução da população bacteriana de aproximadamente 3 log, ou seja de 10 5 bactérias para 10 2 bactérias. Relativamente às amostras irradiadas a 3 kgy, verificou-se na nata fermentada uma redução da população bacteriana de 10 4, relativamente à população bacteriana inicial e na nata sem fermento uma redução de 10 2, comparativamente à população bacteriana inicial. De acordo com os resultados obtidos, pode-se referir que o processo de irradiação indicou ser eficiente na diminuição da carga microbiana das amostras de nata Identificação da população de fungos filamentosos nas amostras de nata Os únicos fungos filamentosos presentes na amostra de nata não irradiada correspondem à espécie Geotrichium candium e foram eliminados com o processo de 19

21 Resultados e Discussão irradiação. Assim sendo, não foi possível a determinação da população fúngica sobrevivente. 1.3 Avaliação da Extensão do tempo de prateleira das manteigas De acordo com os resultados obtidos no estudo da inactivação da carga microbiana das amostras de nata e tendo em conta as possíveis alterações que o processo de irradiação pode causar em termos sensoriais nas manteigas, optou-se por selecionar a dose de 3 kgy para a irradiação das amostras de nata, para posterior produção de manteiga. No entanto, após a irradiação das amostras verificou-se que a dose de radiação absorvida pelas duas amostras de nata foi bastante discrepante, de aproximadamente 1 kgy na amostra de nata fermentada para 3 kgy na amostra de nata sem fermento (Tabela 3). Tabela 3 Determinação da dose absorvida pelas amostras de nata. Amostra Dose pretendida (kgy) Tempo de Irradiação previsto (hh:mm) Dose Absorvida (kgy) Manteiga com nata fermentada irradiada 3 3:00 0,93 Manteiga com nata sem fermento irradiada 3 2:00 3,50 A carga microbiana média estimada para as amostras de manteiga não irradiada (M3), manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada (M3N1) e manteiga cuja nata fermentada foi irradiada (M3N2) antes (T0) após armazenamento refrigerado a 4º durante 15 (T15) e 30 (T30) dias, encontram-se apresentados nos gráficos presentes na Figura 8. Log UFC/g 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 M3 0 kgy M3 N1 3 kgy M3 N2 3 kgy A Amostra População bacteriana mesófila População fúngica 20

22 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas Log UFC/g B 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 M3 0 kgy M3 N1 3 kgy M3 N2 3 kgy Amostra População microbiana mesófila População fúngica Log UFC/g 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 M3 0 kgy M3 N1 3 kgy M3 N2 3 kgy C Amostra População microbiana mesófila População fúngica Legenda: M3- Manteiga não irradiada M3 N1- Manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada M3 N2- Manteiga cuja nata fermentada foi irradiada Figura 8 - Carga microbiana média da população bacteriana mesófila e fúngica antes (T= 0 dias (A) e após armazenamento refrigerado a 4ºc durante: T=15 dias (B); T30= 30 dias (C). As barras de erro representam o intervalo de confiança a 95% sobre a média (n=18; α=0,05). Como se pode verificar através da análise dos resultados acima apresentados, no T0 (Figura 8 A), não foi possível a determinação das UFC/g relativas à população bacteriana mesófila para as manteigas M3(N1) e M3(N2) devido à ocorrência de contaminações cruzadas. Relativamente à carga bacteriana e fúngica das amostras dos diferentes tipos de manteiga, verificou-se a ausência de alterações significativas entre os diferentes tipos e entre as análises efectuadas a diferentes tempos de armazenamento. O processo de irradiação indicou não ser eficiente na diminuição da carga microbiana das manteigas cuja nata foi sujeita ao processo de irradiação. Isto poderá 21

23 Resultados e Discussão dever-se a uma contaminação posterior ao processo de irradiação, uma vez que a nata foi novamente transportada para a empresa para ser utilizada no fabrico das manteigas, o que inclui, a prensagem manual do grão e o contacto com diferentes utensílios e equipamentos (identificados anteriormente como pontos críticos de controlo para a contaminação microbiana). 2. Análises Físico-químicas 2.1 Medição do ph das amostras antes e após o processo de irradiação De forma a verificar os efeitos do processo de irradiação no ph das amostras de nata, foi medido seu valor antes e após irradiações, a diferentes doses incrementais (Figura 9). ph ,00 2,00 3,00 4,00 5,00 Dose (kgy) Legenda: N1- Nata sem fermento N2- Nata fermentada N1 N2 Figura 9 ph das amostras de nata antes e após o processo de irradiação a doses incrementais de radiação gama. Os resultados obtidos indicaram não existir alterações nos valores de ph das amostras de nata antes e após o processo de irradiação. Encontrando-se os valores de ph para a nata sem fermento entre 6 e 7 e para a nata fermentada entre 4 e 5. 22

24 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas 2.1 Determinação do teor de água da manteiga Avaliação da extensão do tempo de prateleira das manteigas O teor de água determinado para as diferentes amostras de manteiga, antes e após armazenamento refrigerado a diferentes tempos, encontra-se apresentado na Figura ,00 35,00 30,00 30,00 Teor de água (%) 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 A M3 M3N1 M3N2 Amostras Teor de água (%) 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 B M3 M3N1 M3N2 Amostras Teor de água (%) 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 C M3 M3N1 M3N2 Amostras Legenda: M3- Manteiga não irradiada M3 N1- Manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada M3 N2- Manteiga cuja nata fermentada foi irradiada Figura 10 Teor de água das manteigas fabricadas antes T= 0 dias (A) e após armazenamento refrigerado a 4ºC durante:; T=15 dias (B) e T30= 30 dias (C). As barras de erro representam o intervalo de confiança a 95% sobre a média (n=2; α=0,05). De acordo com os resultados apresentados, a manteiga que apresenta uma maior concentração de água na sua composição é a manteiga M3 (N2), com aproximadamente de 27%, seguindo-se da M3 (N1) com aproximadamente 26% e por fim a M3 com 16%. Ou seja, a concentração de água das manteigas cuja nata foi sujeita ao processo de irradiação parece ser superior à concentração de água da manteiga cuja nata não foi irradiada. Comparando os resultados obtidos a diferentes tempos de armazenamento, 23

25 Resultados e Discussão verifica-se que não existem alterações significativas da concentração de água nas manteigas com o aumento de tempo de prateleira. 3. Análise Sensorial Os resultados na análise sensorial efectuada às diferentes amostras de manteiga, antes e após armazenamento refrigerado encontra-se apresentado nos gráficos da Figura 11. Média obtida pelos provadores 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 M3 (N2) M3 (N1) M3 A Caraterísticas organolepticas Média obtida pelos provadores 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 M3 (N2) M3 (N1) M3 B Características organolépticas 24

26 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas Média obtida pelos provadores 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 M3 (N2) M3 C Características organolépticas Legenda: M3- Manteiga não irradiada M3 N1- Manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada M3 N2- Manteiga cuja nata fermentada foi irradiada Figura 11 Análise Sensorial às manteigas fabricadas por um painel não treinado antes T= 0 dias (A) e após armazenamento refrigerado durante:; T=15 dias (B) e T30= 30 dias (C). As barras de erro representam o intervalo de confiança de 95% sobre o valor médio (16<n<22 ; α=0,05). Os resultados obtidos variaram entre os diferentes tipos de manteiga analisados e entre as análises efectuadas a diferentes tempos de armazenamento. A M3 (N1) foi a manteiga que apresentou uma classificação mais baixa no T0 e T15, tendo sido excluída da análise, no tempo de armazenamento de 30 dias por apresentar fungos visíveis a olho nu. No entanto, é interessante verificar que, com o aumento do tempo de prateleira (0 dias para 15 dias) esta subiu de classificação em todos os parâmetros avaliados. Relativamente às manteigas M3 (N2) e M3, podemos constatar que apresentam classificações bastante similares. Relativamente ao T0, a amostra M3 apresentou uma classificação superior, embora não significativa, em várias características, ficando igualmente classificada com a M3 (N2) no sabor e na avaliação geral do produto. No T15 os papéis inverteram-se e a manteiga M3 (N2) subiu de classificação em quase todos os parâmetros avaliados, ficando igualmente classificada com a M3 no teor de sal e no aroma e ficando aquém no sabor e avaliação geral do produto, mas com uma classificação superior em todos os outros parâmetros. No T30 os resultados foram similares aos verificados no T0. 25

27 Resultados e Discussão É importante salientar que, ao compararem-se os resultados obtidos para o T0 e T30, em ambas as manteigas, verificou-se uma descida na classificação das características avaliadas, ao longo do tempo. É necessário ter em conta que a dose de radiação a que a nata sem fermento foi sujeita foi significativamente superior à da nata fermentada, o que poderá justificar a classificação bastante inferior às restantes e o facto de ter sido sujeita a observações que a remetiam a um sabor a ranço. 26

28 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas CONCLUSÃO O presente estudo permitiu a validação do fluxograma de fabrico de manteigas e dos respectivos Pontos Crítico de Controlo, tendo sido identificadas outras potenciais fontes de contaminação da manteiga, nomeadamente os equipamentos e utensílios utilizados. Considerando os resultados obtidos no decorrer deste trabalho, podemos concluir que o processo de irradiação indicou ser eficiente na diminuição da carga microbiana das amostras de nata, nomeadamente na eliminação dos fungos presentes inicialmente, e na diminuição significativa da concentração de bactérias mesófilas totais. No entanto, não demonstrou ser eficaz na diminuição da carga microbiana das manteigas produzidas a partir da nata sujeita ao processo de irradiação. Relativamente ao teor de água das manteigas, podemos referir que é um factor muito variável entre amostras de diferentes lotes. Isto poderá dever-se ao sistema de prensagem manual utilizado pela empresa, não sendo feito qualquer tipo de controlo da quantidade de água que irá fazer parte da constituição das manteigas É importante referir ainda que, a concentração de água poderá ser um dos factores determinantes para o crescimento de fungos durante o armazenamento, podendo este ter sido um dos motivos para o aparecimento de um número tão elevado destes microrganismos nas amostras de manteiga cuja nata sem fermento foi irradiada. Através da medição dos valores de ph das amostras de nata antes e após o de processo de irradiação podemos concluir que este não causou alterações nos valores de ph das amostras analisadas. A análise sensorial efectuada pelo painel de provadores não treinado revelou diferenças entre as amostras de manteigas produzidas com nata irradiada a diferentes doses. A manteiga cuja nata foi sujeita a uma dose mais baixa de radiação apresentou resultados muito similares à manteiga com nata não irradiada. No entanto a manteiga cuja nata foi sujeita a uma dose de radiação superior, apresentou uma classificação bastante baixa, tendo sido identificado um ligeiro sabor a ranço. Contudo, sendo os produtos lácteos produtos sensíveis à radiação gama, são necessários estudos mais aprofundados para determinar qual a melhor estratégia a adoptar na sua irradiação, incluindo a dose a que estes devem ser sujeitos. 27

29 Bibliografia BIBLIOGRAFIA American Council on Science and Health (ACSH). (2007). Irradiated Foods. New York: Ruth Kava, Ph.D., R.D. Antunes, A. (2012). Avaliação da lesão genética induzida por exposição a radiação ionizante na população Portuguesa (Tese de Mestrado). Faculdade de Ciências e Tecnologias Universidade Nova, Lisboa. Belitz, H., Grosch, W., Schieberle, P. (2009).Water. In Food Chemistry (pp.1-7). 4ª edição. Berlin, Germania: Springer.Inglaterra. Diehl, J. F. (1990). Safety of irradiated food. Marcel Dekker, Inc., New York. Ministério da Agricultura, do desenvolvimento rural e das Pescas, decreto-lei n.º 337/2001 de 26 de Dezembro (2001). Farkas, J. (2006). Irradiation for better foods. Food Science & Technology, 17, doi: /j.tifs Farkas, J., Farkas, C. (2011). History and future of food irradiation. Food Science & Technology, 22, doi: /j.tifs Division of Nuclear Techniques in Food and Agriculture International Atomic Energy Agency (FAO/IAEA). (1999). Facts about food irradiation. Vienna, Austria: International Consultative Group on Food Irradiation (ICGFI). Porto, A., Oliveira O. (2010). Azeite Óleos e gorduras. In Porto, A., Oliveira O., Tabela da Composição de Alimentos (pp ). Lisboa: Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge. Instituto Superior Técnico (2006). Radioterapia - A utilização da Física moderna na medicina. Acedido a 4 de Abril de 2015 International Atomic Agency. Gama Irradiators for Radiation Processing. 28

30 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas Isengard H. (1995). Rapid Water Determination in foodstuffs. Food Science & Technology, vol.6. Little, MP. (2003). Risks associated with ionizing radiation. British Medical Bulletin, 68: doi: /bmb/ldg03. Mathouthi M. (2001). Water content, water activity, water structure and the stability of foodstuffs. Food Control, 12, Larone, D. (2002). Medically important fungi: A guide identification. Oliveira M. (2011). Impacto da Utilização da Radiação Ionizante por Comparação com a Pasteurização nos Parâmetros Microbiológicos e Reológicos da Fase Aquosa de Emulsões Alimentares (Água/Óleo) (Tese de Licenciatura). Escola Superior Agrária de Santarém, Instituto Politécnico de Santarém, Portugal. Rady, A.H., Badr H.M. (2003). Keeping the quality of cows butter by g-irradiation. Vol. 54. Fasc. 4. Regulamento (CE) N.º 1234/2007 do conselho de 22 de Outubro de 2007 Regulamento (CE) N.º 880/98 da Comissão de 24 de Abril de 1998 Who (1999). High dose irradiation: wholesomeness of food irradiated with doses above 10 kgy. World Health Organization Technical Report Series 890, Geneva. Wood, O., Bruhn, C. (2000). Position of the american dietetic association: Food Irradiation. Journal of The American Dietetic Association. 29

31 Bibliografia 28

32 Avaliação da radiação gama como tratamento alternativo de preservação de manteigas Anexo I: Exame Organoléptico da Manteiga Nome Data: / / Sexo: Idade: Fumador: Classifique cada uma das amostras de acordo com a escala apresentada. 6- Muito fraco (defeitos acentuados) 7- Fraco (defeitos evidentes) 8- Razoável (defeitos ligeiros) 9- Bom (sem defeitos evidentes) 10- Muito Bom (Tipo ideal) Aspecto Textura Firmeza Sabor Aroma Avaliação da presença de sal Produto de maneira geral Comentários/Observações: 30