Estudo de Inactivação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos

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1 Estudo de Inactivação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos Ciência Viva no Laboratório Ocupação Cientifica de Jovens nas Férias 23 de Junho a 4 de Julho 2014 Inês Boavida Cawley e Mónica Bastos Pingo 1

2 Introdução: Este relatório irá falar sobre a conservação dos morangos, mais concretamente sobre como a radiação Gama pode inibir o crescimento dos microrganismos contidos nos morangos, sem que estes percam o seu valor nutricional. Também iremos observar e caracterizar os diferentes microrganismos presentes nos morangos, dependente da dose da radiação. A radiação gama foi descoberta por Paul Ulrich Villard em Esta radiação é altamente energética e penetrante; consegue atravessar as embalagens dos morangos, assim os morangos podem ser irradiados após passarem por toda a linha de produção. A absorção da radiação provoca dois efeitos; os efeitos directos, interacção directa da radiação com o ADN da célula, e os efeitos indirectos, formação de radicais livres resultantes da radiólise da água. A irradiação dos alimentos já é utilizada em vários países, porém em Portugal só é permitida a irradiação de ervas aromáticas, sendo que neste momento apenas estão a ser irradiadas embalagens de Louro em pó. A irradiação dos alimentos tem inúmeras vantagens, das quais se destacam: Aumento da validade ou vida do alimento; Decréscimo do apodrecimento dos alimentos; Poder de penetração elevado, o que permite irradiar alimentos de vários tamanhos e formas; Tecnologia limpa, então não há resíduos. É também importante salientar que os alimentos não se tornam radioactivos. Objectivos: Realizar a validação do técnico, para ter a certeza que não há contaminação; Estudar a inactivação por radiação gama da população microbiana em morangos embalados e o prolongamento do tempo de prateleira; Para isso os morangos serão irradiados numa fonte experimental (Precisa22), de Cobalto-60 (Co-60), com as doses de 0,5 kgy, 1,5 kgy e 3,0 kgy. 2

3 Materiais e Métodos: Materiais: - Pipetas estéreis 1, 10 e 25 ml - Pipetador - Membranas estéreis (Ø poro 0,45 µm) - Pinças estéreis - Kitasato ml de água Milli-Q esterilizada por aluno ml de soro fisiológico, 0,9% cloreto de sódio ml de soro fisiológico 0,9% com 0,1% de Tween 80 por aluno - Tubos de vidro estéreis 3 por aluno Total = 6 tubos - Placas de Petri Tryptic Soy Agar (TSA) 3L 27 por aluno + 9 controlo fluxo laminar (validação e inactivação) + 12 controlo de soluções (SF, SF+TW) Total = 75 placas - Placas de Petri Malt Extract Agar (MEA) 2L 24 por aluno (t=0) Total = 48 placas - Espalhadores estéreis - Sacos de homogeneização estéreis - Dosímetros Amber Prespex 6 - Morangos 2 kg - Rampa de filtração - Bomba de vácuo - Bico de Bunsen - Balança - Placa de aquecimento com agitação - Homogeneizador de alimentos (stomacher) - Autoclaves (Horizontal e vertical) - Agitador (vórtex) - Estufa de calor seco - Estufa a 30 C (bactérias mesófilas) e estufa a 28 C (fungos filamentosos) - Milli-Q - Fonte experimental de Cobalto-60 (Precisa22) - Tesoura - Pinça - Espectrofotómetro - Micrómetro 3

4 Fizemos 3 placas de TSA e 3 de MEA por dose para que os nossos resultados sejam melhores e mais preciso, e também e caso de contaminação haver outras placas. Procedimento Experimental: Validação do técnico de microbiologia a. Marcar as placas de TSA (Amostra, réplica, data, técnico) b. Ligar a câmara de fluxo laminar c. Limpar a câmara com álcool a 70 d. Montar o sistema da rampa de filtração e. Colocar o bico de Bunsen dentro do fluxo laminar f. Abrir as 3 placas de controlo do fluxo laminar (esquerda, centro e direita registando a hora de início do trabalho) g. Esterilizar as pinças à chama h. Colocar o funil de filtração (já tem uma membrana) i. Passar o bocal do frasco de água esterilizada à chama j. Pipetar 50 ml de água esterilizada sobre a membrana k. Abrir a válvula para iniciar a filtração l. Abrir e reabrir a válvula para ter a certeza que toda a água passou. m. Retirar o funil de filtração n. Colocar a membrana no centro placa TSA com a pinça (réplica 1) o. Esterilizar as pinças à chama p. Repetir os passos j a o mais 2 vezes (réplicas 2 e 3), mas esta vez colocar uma nova membrana no funil. q. Fechar as placas de controlo do fluxo laminar (registando a hora de final do trabalho) r. Desmontar o sistema de filtração s. Limpar a câmara t. Desligar a câmara de fluxo laminar u. Incubar as placas de TSA a 30 C durante 7 dias v. Lavar e arrumar o material utilizado e o laboratório Irradiação a. Ligar e limpar a câmara de fluxo laminar b. Identificar os sacos de stomacher (dose, aluno, data, ensaio) c. Esterilizar pinças d. Pesar na câmara de fluxo laminar, com auxílio da pinça, para um saco de stomacher estéril (1 saco por dose e por aluno): i. Estudos de inactivação 25 g de morangos (4 sacos por aluno) e. Registar o peso real dos morangos f. Esterilizar as pinças g. Identificar os dosímetros por dose (Dose, cima/baixo, data) 4

5 h. Colar os dosímetros nos sacos, na zona onde estão os morangos i. Irradiar os morangos, as 3 doses em simultâneo, na Precisa22, no nível 2 j. Baseado no débito de dose médio de 1.6kGy/h, irradiamos a dose 0.5kGy para aproximadamente 19 minutos, a dose 1.5kGy 50 minutos e a dose 3.0kGy 1 hora e 53 minutos. k. Aguardar 1 h após a irradiação (estabilização do dosímetro) e efectuar a leitura da absorvância (603 e 651 nm) e da espessura dos dosímetros (cm) no espectrofotómetro l. Registar os valores obtidos. Determinação da contaminação microbiana a. Ligar e limpar a câmara de fluxo laminar b. Identificar os tubos de ensaio (diluição, aluno, data) e placas de meio (dose, diluição, volume, aluno, data, réplica) c. Adicionar 100 ml de SF + TW80 a cada saco d. Fechar os sacos e. Macerar manual e cuidadosamente os morangos f. Colocar os sacos no stomacher durante 15 minutos a homogeneizar g. Deixar repousar cerca de 1 minuto h. Abrir as placas de controlo da câmara TSA (esquerda, centro e direita registar a hora de inicio) i. Colocar 9 ml de SF em cada um dos tubos de ensaio (passar o bocal à chama depois de abrir o tubo e antes de o fechar) j. Efectuar as diluições necessárias adicionando 1 ml da solução inicial (10-1 ) e 1 ml da diluição anterior (10-2 ) aos tubos de ensaio k. Inocular e espalhar (espalhadores) os volumes indicados nos esquemas abaixo apresentados para cada dose em estudo e por cada tipo de meio (TSA e MEA) l. Fechar as placas de controlo do fluxo laminar (registar hora de fim) m. Limpar a câmara n. Desligar a câmara de fluxo laminar o. Incubar as placas de TSA a 30 C e MEA a 28 C durante 7 dias p. Lavar e arrumar o material utilizado e o laboratório Leitura e Análise dos Resultados Leitura dos dosímetros Os dosímetros que foram irradiados com os morangos, foram postos um a um dentro um espectrofotómetro para saber a absorvância do dosímetro. Foi posto dos dois lados para ter um resultado mais preciso. Depois utilizando um micrómetro, 5

6 medimos a espessura do dosímetro. Com os resultados da absorvância e da espessura, conseguimos encontrar a dose real absorvida durante a irradiação. Amostra 603 nm 651 nm Média (603 nm) Espessura (cm) Dose Real (kgy) 0.5_kGy_F 0,1214 0, _kGy_F-2 0,1194 0,0862 0,087 0,289 0,73 0.5_kGy_T 0,1312 0, _kGy_T-2 0,1297 0,0926 0,093 0,301 0,76 1.5_kGy_F 0,1814 0, _kGy_F-2 0,1695 0,1159 0,1195 0,292 1,13 1.5_kGy_T 0,2341 0, _kGy_T-2 0,2226 0,1493 0,1528 0,299 1,49 3.0_kGy_F 0,4375 0, _kGy_F-2 0,4084 0,2612 0,2705 0,287 3,1 3.0_kGy_T 0,303 0, _kGy_T-2 0,2819 0,1846 0,1909 0,281 2,11 Neste caso apenas nos interessam os valores de 603 nm, pois com os valores compreendidos entre 0 kgy e 10 kgy (exclusive) apenas se utiliza a absorvância a 603 nm. Quantificação das unidades formadoras de colónias (ufc) Quando avaliamos os nossos resultados, conseguimos ver que contamos menos fungos e bactérias nas placas que não foram irradiadas ou que foram irradiadas a uma dose menor (0.5kGy), mas estes resultados não são correctos, porque foram diluídas. Na realidade, há um número menor de fungos e bactérias na dose 3.0kGy. Igualmente, o número de colonias não é correcto, porque na dose 0.5kGy IC só contamos as colonias nas placas de 10-1 e nas doses 1.5kGy IC, 3.0kGy IC e MP, só contamos as colonias nas placas 0.1mL. Em todos os nossos controlos, não contamos nenhum microrganismo, então a contaminação da maioria das placas não foi o produto duma contaminação no equipamento, mas mais por causa dos morangos. Os morangos irradiados, principalmente esses irradiados na dose 3.0kGy, mostraram uma diferença em textura e sabor; eram mais moles e doces que os morangos não irradiados. A irradiação dos morangos quebra as ligações dos açúcares, e então os açúcares estão mais disponíveis e é mais fácil para os sensores da língua captarem estes açúcares; resultado: morangos doces e moles. Tratamento dos Resultados: Após terminarmos as contagens de colónias fizemos o Logaritmo de unidades formadoras de colónias por grama (UFC/g). 6

7 Log UFC/g morango Estudo de Inactivação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos 2014 Dose real (kgy) Log (UFC/g) Desvio Padrão Intervalo de Confiança Decréscimo relativo (%) 0 4,53 0,62 0,25 0 0,75 3,88 0,70 0, ,31 3,74 0,87 0, ,61 2,83 0,86 0,34 96 No fim verificamos que a irradiação dos morangos foi positiva, uma vez que a 3,0 kgy foram eliminados cerca de 96% dos microrganismos. Curva de Inactivação 6,00 5,00 y = -0,6315x + 4,4836 R² = 0,9824 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Dose (kgy) Assim que terminamos a leitura dos resultados calculámos o D10 para saber qual a dose que devemos aplicar para que 90% dos microrganismos sejam inactivados. log N= logn0-(1/d10)d D 10 = 1,58 kgy Classificação Morfológica dos microrganismos: A caracterização dos microrganismos foi feita a partir da sua morfologia (cor, textura, opacidade, forma, margem e elevação) e através da observação ao microscópio. Foram depois, também, feitos testes de coloração Gram e a verificação da existência das enzimas catálase e oxidase. 7

8 Dose absorvida (kgy) Estudo de Inactivação Microbiana por Radiação Gama em Morangos Frescos ,61 kgy 1,31 kgy 0,75 kgy 0 kgy O gráfico mon 0% 20% 40% 60% 80% 100% Frequência relativa (%) Cocos, gram +, catalase + Cocos, gram +, catalase - Cocos, gram -, catalase + Cocos, gram -, catalase - Bacilos, gram +, endósporos + Bacilos, gram +, endósporos -, catalase + Bacilos, gram +, endósporos -, catalase - Bacilos, gram -, oxidase + Bacilos, gram -, oxidase - Fungos filamentosos O gráfico mostra-nos que havia principalmente colonias de fungos filamentosos e de leveduras. Conclusão: Leveduras gráfico 1 distribuição dos microrganismos A experiência correu bem, não contando as placas de dose 1.5kGy e a placa de 0kGy que foi contaminada pela bata da Inês. Tivemos resultados positivos e eram parecidos com as nossas expectativas; que ia haver uma menor quantidade de microrganismos nos morangos que foram irradiados na dose de 3.0kGy que nas restantes doses. Em facto, houve decréscimo relativo de 96%. Os morangos irradiados não eram radioactivos, ou venenosos (se não nos não íamos estar vivas agora). Os morangos irradiados corresponderam as nossas expectativas de não afectar a saúde pública, ate pode beneficiar (tem maior capacidade antioxidante), e inactivar a flora microbiana, podendo fazer parte da dieta de indivíduos com o sistema imunitário fragilizado. Bibliografia: Wikipedia e a espectacular Telma de Silva 8

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