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1 CIÊNCIA EQUATORIAL ISSN Artigo Original Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 INCIDÊNCIA DE Staphylococcus aureus RESISTENTE A OXACILINA NO HOSPITAL MATERNIDADE/MACAPÁ E AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE AO EXTRATO DE Licania macrophylla BENT. Ellen Saioco Ribeiro Hay Mussi 1 ; Fernando Antônio de Medeiros 2 ; André Mendonça dos Santos 3 ; Roberto Rangel Chaves Silva 4 ; Alessandra Azevedo Nascimento de Medeiros 5 RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar a incidência de Staphylococcus aureus resistente a oxacilina no Hospital da Mulher Mãe Luzia (HMML) Macapá, bem como a susceptibilidade destes microorganismos ao extrato de Licania macrophylla Bent uma planta conhecida popularmente por anauerá ou anuera e usada na medicina tradicional como antidiarréico e amebicida. Para tanto foram coletadas amostras de orofaringe de 57 profissionais da saúde do HMML e isoladas cepas de Staphylococcus, coagulase-positivas as quais foram submetidas a antibiograma com: Oxacilina 1µg; Vancomicina 30µg; Eritromicina 15µg; Gentamicina 10µg; Ampicilina e 300 g do extrato etanólico de Licania macrphylla (ELM). Das 57 amostras, 18 foram positivas para Staphylococcus coagulase positivo, sendo apenas duas delas resistentes a oxacilina 1µg. Estas cepas quando submetidas ao ELM mostraram um pequeno halo de inibição que variou entre dez e treze milímetros. Diante destes resultados podemos concluir que entre as cepas de Staphylococcus aureus isoladas 11,11% apresenta resistência a oxacilina 1µg e que na concentração utilizada do ELM, este não demonstra um grande potencial de efetividade contra as cepas testadas. Palavras-chave: Licania macrophylla, ambiente nasocomial, Staphylococcus aureus resistente a oxacilina. INCIDENCE OF Staphylococcus aureus RESISTANT TO OXACILLIN AT HOSPITAL/MACAPÁ AND EVALUATION OF SUSCEPTIBILITY TO EXTRACT OF Licania macrophylla BENT. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the incidence of Staphylococcus aureus resistant to oxacillin at Mãe Luzia woman s hospital in Macapá as well as the susceptibility of these microorganisms to the extract of Licania macrophylla Benth, species known popularly as anauerá or anuera " and used in traditional medicine as antidiarrheal and amebic. For both samples were collected from the oropharynx of 57 health care professionals HMML and isolated strains of Staphylococcus coagulase-positive which were submitted to the antibiotic: oxacillin 1μg, 30μg vancomycin, erythromycin 15ug; 10μg gentamicin, ampicillin and 300 g of ethanolic extract from Licania macrphylla (ELM). Of the 57 samples, 18 were positive for coagulase positive, only two of them being resistant to oxacillin 1μg. These strains when subjected to the ELM showed a small halo of inhibition ranging between ten and thirteen millimeters. From the strains of Staphylococcus aureus isolated during this study, 11.1% showed resistance to oxacillin (1µg). The concentration 300µg of the extract of Licania macrophylla did not show a great potential effectiveness against the strains tested. Keywords: Licania macrophylla, nosocomial environment, Staphylococcus aureus oxacillin resistant.

2 INTRODUÇÃO Staphylococcus aureus é, sem duvida, o patógeno humano mais importante do gênero Staphylococcus. As manifestações clínicas das doenças causadas por S. aureus variam desde intoxicações alimentares ou infecções cutâneas de pouca importância até infecções hospitalares graves, principalmente da corrente sangüínea (BROOKS, 2000). Este microrganismo pode fazer parte de microbiota normal sendo a nasofaringe o principal local colonizado. Cerca de 15% dos adultos sadios são portadores nasofaríngeos de S. aureus, com maior incidência em pacientes hospitalizados, equipe médica e neonatos (MURRAY et al.,2000; SILVA et al., 2003). S. aureus sempre esteve presente na história da infecção nosocomial e foi capaz de desenvolver rapidamente resistência aos antibióticos. Nos anos 40, logo depois do surgimento das penicilinas, já apareceram estafilococos capazes de produzir penicilinase (FILE, 2000). Na década de 60, S. aureus tornaram-se rapidamente resistentes à meticilina e à oxacilina, antibióticos semisintéticos resistentes à penicilinase (FILE, 2000). A resistência aos antimicrobianos é um fenômeno genético, relacionado á existência de genes contidos no microrganismo que codificam diferentes mecanismos bioquímicos capazes de impedir a ação de drogas. (TAVARES, 2000). Diversas espécies bacterianas podem apresentar resistência antimicrobiana muito variável entre países, regiões e a origem hospitalar ou comunitária das estirpes. Algumas, porém, demonstram resistência amplamente difundida em todo mundo, como é o caso do Staphylococcus aureus (TAVARES, 2000). O número de cepas isoladas de S. aureus meticilina-oxacilina resistentes (MRSA/ORSA) vem aumentando e hoje este microrganismo é um dos principais causadores de infecções hospitalares, tornando-se um problema mundial (CHAMBERS, 1988). Septicemias por MRSA estão associadas com significantes índices de morbidades e mortalidades, requerendo métodos rápidos de identificação e sensibilidade aos antibióticos (TAN et al, 2001; MELZER et al, 2003) A necessidade de encontrar novas substâncias com propriedades antimicrobianas e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas representam um desafio no tratamento de infecções bacterianas e controle das infecções hospitalares. A implementação de políticas publicas de saúde como a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), visa garantir à população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo a utilização sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). Neste contexto, as plantas medicinais têm representado uma alternativa terapêutica e fonte de compostos bioativos, tendo-se incentivado e intensificado os esforços na buscas de propriedades antibacterianas de extratos e constituintes de espécies vegetais. A espécie Licania macrophylla Benth. (Chrysobalanaceae), é conhecida popularmente por anauerá ou anuera, sendo encontrada principalmente as margens da várzea das regiões do baixo-amazonas. As comunidades amazônicas utilizam esta planta no tratamento de parasitoses amebianas e distúrbios diarréicos. (RODRIGUES, 1989). Quimicamente, o gênero Licania tem como característica a presença significativa de metabólitos secundários do tipo flavanóides e triterpenos, extraídos de várias partes das plantas. Em triagem fitoquímica a Licania macrophylla demonstrou positividade para presença de compostos como flavanóides, chalconas e auronas, quinonas, esteróides livres e taninos (FERREIRA et al, 2005). Estudos realizados em nosso laboratório demonstram que o extrato etanólico das cascas do caule de Licania macrophylla e constituintes apresentam atividade antimicrobiana contra algumas cepas bacterianas testadas, em particular contra Staphylococcus aureus ATCC A atividade antimicrobiana de Licania macrophylla pode ser pelo menos em parte, responsável pelo efeito antidiarréico referido pela medicina popular local uma vez que a Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 Página 20

3 espécie estudada não foi capaz de influenciar o transito intestinal estimulado em camundongos ou inibir a diarréia induzida experimentalmente. Uma das principais espécies bacterianas causadora de infecção hospitalar é o Staphylococcus aureus resistente a oxacilina. Visando contribuir para o estabelecimento de medidas de controle destas infecções nasocomiais e diante da necessidade de descoberta de novas drogas eficazes como antimicrobianos o objetivo do presente estudo foi verificar a incidência de Staphylococcus aureus resistente a oxacilina em profissionais de saúde do Hospital Maternidade/Macapá e testarmos a susceptibilidade destas cepas bacterianas isoladas frente ao extrato de Licania macrophylla. MATERIAL E MÉTODOS Coleta do Material Botânico A espécie Licania macrophylla Benth. (Chrysobalanaceae) no município de Porto Grande/Amapá/Brasil, e uma exsicata depositada no Herbário Amapaense HAMAB do IEPA sob n Posteriormente, as cascas foram secas em estufas de ar circulante a 45 C e trituradas em moinho mecânico para preparação do extrato. Preparação do Extrato Etanólico das Cascas do Caule de Licania macrophylla (ELM) As cascas do caule (2,3 kg) secas e trituradas da planta foram extraidas por maceração em etanol a temperatura ambiente, durante 10 dias. A solução extrativa obtida foi concentrada em evaporador rotativo sob temperatura controlada (45ºC), resultando no Extrato Etanólico das Cascas do Caule de Licania macrophylla (ELM). Coleta das amostras bacterianas e semeadura Amostras de secreção de orofaringe foram coletadas de 57 profissionais da saúde do Hospital Maternidade Mãe Luzia (HMML) e isoladas para estudo prioritariamente cepas de Staphylococcus coagulase-positivas. A coleta foi procedida com auxílio de swab e abaixadores de língua, em seguida o material biológico foi inoculado, por técnica de esgotamento, em placas de Petri contendo Agar sangue de carneiro incubado a 37 0 C, por horas, posteriormente as cepas foram isoladas novamente em Agar sangue e Agar inclinado para realização das provas. Identificação de Staphylococcus coagulase-positivo As cepas isoladas foram inoculadas em Agar Manitol Salgado (7%) e incubadas a 37 0 C, por horas. O Agar salgado seleciona o crescimento de estafilococos e permite a observação da fermentação do Mannitol através da mudança na coloração do meio (MAZA et al., 1999). Posteriormente, foi executada a prova da catalase para confirmação da característica do gênero. Este teste é realizado pela adição de peróxido de hidrogênio H (3%) a colônia do microrganismo sobre uma lâmina de vidro. O aparecimento de bolhas indica uma reação positiva, significando que a catalase hidrolisa H em oxigênio e água. Os estafilococos são catalase positivos (MAZA et al., 1999). Posteriormente, foi procedida a prova da coagulase, que avalia a habilidade do microrganismo de coagular o plasma pela produção desta enzima. Em um tubo de ensaio colocará 0,5 ml de plasma humano e uma alíquota de suspensão do microrganismo em salina (NaCl a 0,85%) correspondente à escala 0,5 de Mac Farland, e incubará a 37 0 C por 24 horas. As cepas capazes de formar coágulo foram consideradas coagulase-positiva e, portanto, selecionadas. Antibiograma O método utilizado para o teste de sensibilidade aos antimicrobianos foi o método de difusão em ágar. Três a cinco colônias com morfologia similar foram selecionadas a partir de uma cultura recente em Mannitol Salt Ágar e foram suspensas em solução de NaCl 0,85%, obtendo-se turbidez de 0,5 na escala de Mc Farland, correspondendo a aproximadamente 1,5 x 108 unidades formadoras de colônias (UFC). A partir desta suspensão, realizou-se semeadura com swab em placa de Petri Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 Página 21

4 contendo meio Agar Mueller-Hinton, procurando assegurar distribuição homogênea do inóculo (MAZA et al., 1999). Depois disso, discos de papel contendo Oxacilina 1µg; Vancomicina 30µg; Eritromicina 15µg; Gentamicina 10µg e Ampicilina 10µg, foram depositados sobre a superfície do ágar e pressionados para melhor aderência ao meio e as placas incubadas a 37 0 C por 24 horas. A leitura da sensibilidade aos antibióticos foi realizada medindo-se a zona de inibição de crescimento em mm. Os resultados foram interpretados segundo as Normas do National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), que considera Staphylococcus coagulase-positivo sensível à oxacilina quando o diâmetro do halo for > 13mm e resistente quando < 12mm. Sensível à vancomicina quando o diâmetro for > 12 mm e resistente quando < 12. Para eritromicina considera-se sensível quando o diâmetro do halo for > 23 e resistente quando < 13. Sensível à gentamicina quando o diâmetro for > 15 mm e resistente quando < 12. Sensível à vancomicina. Para ampicilina quando o diâmetro for > 17 mm é considerado sensível e resistente quando < 13. A confirmação da resistência à oxacilina foi realizada segundo as normas preconizadas pelo NCCLS, semeando-se Staphylococcus coagulase-positiva em meio Mueller Hinton acrescido de 4% de NaCl com 6 mg/ml de oxacilina e meio MRSA (Probac). O crescimento de microrganismos nestes meios confirma o resultado de resistência a este antimicrobiano. Antibiograma do extrato etanólico de Licania macrophylla O método utilizado para o teste de sensibilidade ao ELM foi o método de difusão em Agar, semelhantemente ao teste realizado para os antibióticos comerciais acima descritos. Porém discos de papel de filtro foram impregnados com ELM (30 g e 300 g) e com o diluente (solução aquosa de DMSO). Estes discos de papel foram depositados sobre a superfície do Agar e pressionados para melhor aderência ao meio e as placas incubadas a 37 0 C por 24 horas. A leitura da sensibilidade aos antibióticos foi realizada medindo-se a zona de inibição de crescimento em mm. RESULTADOS Das 57 amostras coletadas a partir da orofaringe de profissionais de saúde do HMML 18 (31,5%) apresentaram Staphylococcus coagulase positivo (Figura 1) Figura 1. Representação do percentual de portadores de Staphylococcus aureus em relação ao total de indivíduos pesquisados. Após a realização do antibiograma para as cepas de Staphylococcus aureus isoladas da orofaringe de profissionais da saúde do HMML/Macapá pode-se determinar o perfil de sensibilidade destas para os antibióticos testados: Oxacilina 1µg; Vancomicina 30µg; Eritromicina 15µg; Gentamicina 10µg e Ampicilina (Figura 2). Tanto para oxacilina como para gentamicina 88,9% das cepas mostraram-se sensíveis, enquanto que para vancomicina as bactérias tiveram 100% de sensibilidade. Enquanto para amplicilina e eritromicina predominaram as cepas resistentes. Figura 2. Perfil de sensibilidade x resistência das cepas de Staphylococcus aureus isoladas da orofaringe de profissionais da saúde do HMML/Macapá. Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 Página 22

5 As cepas de Staphylococcus coagulase negativos também foram submetidos ao testes de antibiograma para os antibióticos: Oxacilina 1µg; Vancomicina 30µg; Eritromicina 15µg; Gentamicina 10µg e Ampicilina (Figura 3), demonstrando um perfil de sensibilidade semelhante as cepas de Staphylococcus aureus, diferindo apenas em relação a eritromicina que, neste caso, predomina a sensibilidade das cepas a este antibiótico, enquanto que para os Staphylococcus coagulase positivos cerca de 60% das bactérias apresenta resistência a tal droga. Figura 3: Perfil de sensibilidade x resistência das cepas de Staphylococcus coagulase negativos isoladas da orofaringe de profissionais da saúde do HMML/Macapá. Quando as cepas de Staphylococcus aureus isoladas da orofaringe de profissionais da saúde do HMML/Macapá foram submetidas ao ELM (30 g e 300 g) para a concentração de 30 g não houve inibição de crescimento bacteriano em torno do disco impregnado com o extrato. ELM 300 g foi capaz de induzir pequenos halos de inibição que variaram entre dez e treze milímetros, demonstrando a principio uma baixa sensibilidade ao extrato. CONCLUSÕES A propagação da infecção por contato assumiu maior importância nos hospitais, onde grande proporção da equipe e dos pacientes abriga estafilococos resistentes os antibióticos no nariz ou na pele (JAWETZ, MELNICK e ADELBERG, 2009). O estado de portador assintomático pode provocar infecções hospitalares, especialmente se o portador é um profissional da área de saúde (FERREIRA, AVILA, 2001). Nos hospitais, as áreas de maior risco de infecções estafilocócicas graves são os berçários, as unidades de tratamento intensivo, centro cirúrgico e as enfermarias de quimioterapia do câncer. Os indivíduos com lesões ativas por S.aureus e os portadores devem ser excluídos desta área. Os agentes de saúde devem aderir estreitamente às normas do controle de infecção, utilizando luvas e lavando as mãos antes e após o contato com o paciente (JAWETZ, MELNICK e ADELBERG, 2009). Este estudo mostra que 31,5 % dos profissionais da saúde do HMML/Macapá analisados são portadores de Staphylococcus aureus em suas orofaringes o que é condizente com dados da literatura que se referem a aproximadamente um terço das pessoas como sendo portadoras deste microrganismo neste local. Porém cerca de 10% destas bactérias isoladas demonstraram resistência a oxacilina o que nos coloca em alerta já que os Staphylococcus aureus são considerados uns dos principais causadores de infecções hospitalares. O Isolamento de amostras S.aureus resistentes à vancomicina seria preocupante, pois o eventual desenvolvimento de resistência total à vancomicina tornariam muitas das infecções estafilocóccias intratáveis com o atual arsenal de antibióticos disponível (FERREIRA, AVILA, 2001). Nossos resultados mostram que 100% das cepas de S. aureus isoladas apresentam sensibilidade a vancomicina demonstrando ainda um quadro satisfatório de sensibilidade a este antibiótico, porém é necessário um constante alerta pelos profissionais e autoridades sanitárias. O tratamento convencional das infecções estafilocóccias toma novos rumos quando os agentes envolvidos apresentam resistência aos antimicrobianos de escolha para organismos Gram-positivos (FERREIRA, AVILA, 2001). Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 Página 23

6 Neste estudo as cepas de Staphylococcus aureus quando submetidas ao ELM (30 g e 300 g) mostraram um pequeno halo de inibição apenas para ELM 300 g que variou entre dez e treze milímetros, sendo assim este não demonstra um grande potencial de efetividade contra as cepas testadas. Cepas de Staphylococcus coagulase negativos também foram testadas e apresentaram um perfil de sensibilidade bem apropriado. Agradecimentos Os autores agradecem aos funcionários do Hospital da Mulher Mãe Luzia por colaborarem com esta pesquisa e ao apoio financeiro do CNPq. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos. Departamento de Assistência Farmacêutica. Política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos Brasília: Ministério da Saúde, p. (Série B. Textos Básicos de Saúde) BROOKS, G. F; BUTEL, J S.; MORSE, S. A. Microbiologia Médica. 21. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000, p. 158 CHAMBERS, H. F. Methicillin-resistant staphylococci. Clin. Microbiol., Rev., v. 1, 1988, p FERREIRA, A., WALTER; AVILA, SANDRA L. M. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Autoimunes. 2 ed. Rio de Janeiro: Ed. Guanabara Koogan, FERREIRA, E. S.; MEDEIROS, F. A; MEDEIROS, A. A. N. Estudo fitoquímico da casca do caule da espécie Pradosia huberi Ducke. (Sapotaceae), In: 56 o Congresso Nacional de Botânica, Resumos, v. 56, p. 1891, FILE, T. M. Visão geral sobre resistência bacteriana nos anos 90. Ple. Chest., v. 2, n. 1, p. 3-8, JAWETZ, MELNICK e ADELBERG. Microbiologia Médica. 24 ed. Rio de Janeiro: Mc Grau-Hill Interamericana do Brasil Ltda, P MANN, C. M.; MARKHAM, J. L. A new method for determining the minimum inhibitory concentration of essential oils. Journal of Applied Microbiology, v.84, p , MAZZA, L. M. et al. Atlas de Diagnóstico em Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 1999, p.32. MELZER, M. et al. Is methicillin-resistant Staphylococcus aureus more virulent than methicillin-suscetible S. aureus? A comparative cohort study of British patients with nosocomial infection and bacteremia. Clin. infect. Dis, v. 37, n. 11, p , MURRAY, P. et al. Microbiologia médica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2000, p RODRIGUES, M.R. A Flora da Amazônia. Belém-PA, Ed. CEJUP, SILVA, H. A. et al. Infection and colonization, by Staphylococcus aureus in a high risk nursery of a Brazilian teaching hopital. Braz. J. Infect. Dis., v. 7, n. 6, p , TAN, T. Y. et al. Rapid identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from positive blood cultures by real-time fluorescence PCR. J. Clinical Microbiol., v. 39. n.12, p , TAVARES, W. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do estafilococo, do enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. v. 33, n.3, p , Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 Página 24

7 1 Ellen Saioco Ribeiro Hay Mussi Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Amapá, IEPA. 2 Fernando Antônio de Medeiros PPGCS, Universidade Federal do Amapá - UNIFAP 3 André Mendonça dos Santos Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Amapá, IEPA. 4 Roberto Rangel Chaves Silva Laboratório Central de Saúde Pública, Macapá-AP. 5 Alessandra Azevedo Nascimento de Medeiros Ciências de Farmacêuticas, Universidade Federal do Amapá - UNIFAP Ciência Equatorial, Volume 2 - Número 1-1º Semestre 2012 Página 25