Isquemia de Membros Inferiores: perspectiva atual da terapia celular e terapia gênica

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1 Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Artigo de Revisão 1 Isquemia de Membros Inferiores: perspectiva atual da terapia celular e terapia gênica Lower Limb Ischemia: current outlook for cell therapy and gene therapy Reis et al. Paulo Eduardo Ocke Reis 1,2, Irlandia Figueira Ocke Reis 2, Daniel Queiroz Neves 3, Priscila Keiko Matsumoto 4, Sang Won Han 4, Radovan Borojevic 5 Resumo O estágio dos sintomas do paciente com doença isquêmica de membros inferiores determina o tipo de tratamento. Apesar das terapias já conhecidas um grupo desses pacientes não é candidato ao tratamento cirúrgico ou continua com dor mesmo após o tratamento, o que afeta a sua qualidade de vida. O entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento vascular possibilita respeitar e compreender os benefícios e limites das terapias moleculares para o tratamento das doenças isquêmicas de membros inferiores. Neste artigo descreve-se a perspectiva atual da terapia celular e da terapia gênica no tratamento da isquemia crítica de membros inferiores. Palavras-chave: Isquemia/fisiopatologia; Doença arterial periférica; Extremidade inferior; Terapia celular; Terapia dos genes Introdução O tratamento atual da isquemia crítica dos membros inferiores consiste ainda numa tentativa universal e agressiva para o seu salvamento. Os fatores de risco identificados para a doença arterial obstrutiva periférica (DAOP) são essencialmente os mesmos que promovem a aterosclerose. O estudo de Framingham demonstrou que a chance de fumantes desenvolverem DAOP é duas vezes maior que de desenvolverem doença arterial coronariana 1,2. Abstract The severity of the symptoms presented by a patient with lower limb ischemia dictates the type of treatment. Despite known therapies, some of these patients are not candidates for surgical intervention or remain in pain even after treatment, adversely affecting their quality of life. Awareness of the molecular mechanisms involved in vascular development paves the way for respecting and understanding the benefits and limits of molecular therapies for treating lower limb ischemic diseases. This paper describes the current status of cell therapy and gene therapy for the treatment of critical lower limb ischemia. Keywords: Ischemia/physiopathology; Peripheral artery disease; Lower extremity; Tissue therapy; Gene therapy É importante ressaltar a crescente mortalidade na população com doença vascular periférica devido à influência do membro isquêmico sobre o sistema cardiovascular. O que parece bem estabelecido é que a DAOP coexiste frequentemente com a doença aterosclerótica cerebral e coronariana. Apesar da demonstração da íntima relação entre essas doenças, o impacto da modificação dos fatores de risco cardiovascular sobre a história natural da vasculopatia periférica é desconhecido 2,3. 1 Departamento de Cirurgia Geral e Especializada - Faculdade de Medicina - Universidade Federal Fluminense (UFF) - Niterói, RJ - Brasil 2 Clínica Angio-Care - Rio de Janeiro, RJ - Brasil 3 Programa de Pós-graduação stricto sensu (Mestrado) em Ciências Cardiovasculares - Universidade Federal Fluminense (UFF) - Niterói, RJ - Brasil 4 Centro Interdisciplinar de Terapia Gênica - Universidade Federal de São Paulo - São Paulo, SP - Brasil 5 Departamento de Histologia e Embriologia - Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) - Rio de Janeiro, RJ - Brasil Correspondência: Paulo Eduardo Ocke Reis vascular@pauloocke.com.br Rua Visconde de Pirajá, 414 sala Ipanema Rio de Janeiro, RJ - Brasil Recebido em: 29/01/2012 Aceito em: 02/04/

2 Reis et al. Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): A principal manifestação clínica da doença é a claudicação intermitente, definida como dor das pernas, que piora com a marcha e melhora após a interrupção da mesma. Num período de 5-10 anos, cerca de 70% desses pacientes permanecerão assintomáticos ou oligossintomáticos, mas 30% apresentarão sintomas progressivos e poderão ter indicação de revascularização arterial. Cerca de 20% destes evoluirão da claudicação intermitente para a isquemia crítica do membro, e os 10% restantes terão indicação de amputação menor, um ou mais pododáctilos ou parte do pé, com uma incidência abaixo de 4% para amputação maior, na perna ou coxa. A associação de diabetes mellitus e o hábito do fumo são os maiores agravantes para a DAOP, proporcionando uma evolução rápida da doença 3-6. Apesar dos esforços para revascularização do membro isquêmico, o tratamento cirúrgico pode evitar a amputação, mas não necessariamente resulta em deambulação e em vida independente, embora o aprimoramento das diversas técnicas de revascularização permitam resultados cada vez mais efetivos quanto ao salvamento do membro isquêmico 7. Esses pacientes são, na maior parte dos casos, do sexo masculino e encontram-se entre a sexta e a sétima décadas da vida. A mortalidade operatória, a permanência hospitalar e a sobrevida em longo prazo têm melhores resultados nos pacientes submetidos à revascularização do membro em vez da amputação 3-6,8. Os custos da amputação comparados aos da cirurgia de revascularização, embora não avaliados por estudos randomizados, são consistentemente maiores e estão longe de representar o desejado dos pacientes, seus médicos e familiares 8. Pacientes com claudicação leve, que não geram modificações nos hábitos de vida diários, devem ser tratados conservadoramente; pacientes com claudicação incapacitante para pequenas distâncias, com dor em repouso ou lesões isquêmicas nos membros inferiores são candidatos à revascularização 4. A revascularização cirúrgica dos membros inferiores pode ser realizada através de dois métodos: cirurgia aberta convencional ou endovascular. Ambos têm suas aplicações bem determinadas, embora as indicações de uma técnica ou outra possa variar de acordo com as características de cada caso e a experiência do cirurgião 6. A patência dessa cirurgia é variável e, em muitos casos, as falhas de enxertos na evolução do paciente são evidenciadas. Novas intervenções são necessárias quando existem indicativos de novos processos isquêmicos, ou falhas dos enxertos prévios. É importante ressaltar que a evolução da doença aterosclerótica não foi interrompida; nesse aspecto, a opção endovascular é muito atraente, seja para tratar as complicações do procedimento inicial ou reintervenções devido à evolução inexorável da doença aterosclerótica. A intenção com a revascularização é de permitir ao paciente autonomia, principalmente nos idosos, ainda que apenas por algum tempo nos estágios mais avançados de isquemia 6. Após a realização de procedimentos sucessivos, o paciente geralmente alcança um estágio de doença caracterizado por artérias de pequeno calibre, muitas vezes mantidas por extensa rede de colaterais insuficientes para gerar perfusão adequada àquela área tecidual; anatomias complexas, muitas vezes envolvendo enxertos arteriais e/ou venosos trombosados, com dificuldade de acesso percutâneo; ausência de enxertos venosos viáveis na utilização para a revascularização; presença de doença grave no leito distal que atenuam os potenciais benefícios dos procedimentos 4,9. Nesse contexto, forma-se uma classe de pacientes isquêmicos que não são candidatos ao tratamento cirúrgico e que sofrem com a progressão da doença isquêmica. As implicações terapêuticas dos fatores de crescimento angiogênicos foram inicialmente identificadas pelos estudos pioneiros de Folkman 10. Investigações posteriores estabeleceram a possibilidade da utilização de formulações de fatores de crescimento angiogênico recombinantes com o objetivo de desenvolver ou aumentar a rede de colaterais em modelos animais de isquemia crônica miocárdica ou de membro inferior. Esse processo foi denominado então, angiogênese terapêutica 11. Asahara et al. 12 foram os primeiros a demonstrar que o sangue periférico contém células endoteliais progenitoras (CEP) que podem se diferenciar em diferentes funções em modelo animal 12. A neovascularização pós-natal ocorre por migração e proliferação de células endoteliais locais e através da diferenciação das CEP derivadas da medula óssea em pacientes com isquemia crítica de membros, sem opção de tratamento cirúrgico 13. Terapia celular e Terapia gênica As células-tronco (CT) se caracterizam por serem células indiferenciadas, capazes de se autorregenerar e de se diferenciar em diversas linhagens celulares 14. Estas células podem ter origem embrionária ou adulta. De acordo com a sua capacidade de autorrenovação 331

3 Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Reis et al. e diferenciação, as CT podem ser classificadas como totipotentes, pluripotentes ou multipotentes 14. As células pluripotentes, teoricamente, podem gerar todos os tipos celulares e possuem alta capacidade de proliferação em estado indiferenciado por um período prolongado, em cultura 14. Estas células derivam preferencialmente de tecidos embrionários, principalmente da massa interna do blastocisto 15. Células pluripotentes têm sido identificadas na medula óssea (MO) 16,17 e também no sangue de cordão 17. Organismos adultos têm a capacidade de autorregenerar determinados tecidos como a pele, o epitélio intestinal e principalmente o sangue, que têm suas células constantemente destruídas e renovadas num complexo finamente regulado por processo de proliferação e diferenciação celular. A noção de que vários tecidos e órgãos do corpo humano, como o fígado, músculo esquelético e sistema nervoso, têm estoque de células-tronco com capacidade limitada de regeneração tecidual após injúria é razoavelmente recente. Ainda mais recente é a ideia de que as CT presentes nesses vários órgãos são não apenas multipotentes, no sentido de que podem gerar as células constitutivas daquele órgão específico, mas também pluripotentes, em que também podem gerar células de outros órgãos e tecidos Obviamente, a possibilidade de utilizar as próprias células de indivíduos adultos resolveria simultaneamente os dois principais problemas enfrentados pela bioengenharia: a rejeição imunológica de transplantes heterólogos e as objeções éticoreligiosas do uso de material fetal. Vários estudos vêm demonstrando de forma cada vez mais consistente que células originadas na medula óssea participam intensamente da regeneração de várias estruturas do sistema cardiovascular O número de células endoteliais progenitoras circulantes aumenta em resposta à isquemia e são atraídas para os sítios de isquemia em isquemia de membro inferior e miocárdio 13,22. Na década de 1990, foram utilizadas para aplicação em tecido cardíaco as células satélites do músculo esquelético em transplantes celulares para corações submetidos a lesões criogênicas ou isquêmicas. Os estudos in vitro e in vivo demonstram que as células mononucleares da medula óssea podem se diferenciar em cardiomiócitos e vasos sanguíneos 23. Implante de mioblastos nas áreas de fibrose na cirurgia de revascularização miocárdica foi a primeira descrição de terapia celular em humanos 24. Em 2001, 332 Ikenaga et al. 25 publicaram trabalho cujo objetivo era investigar a extensão da angiogênese, induzida pela implantação de células autólogas mononucleares e verificada através da capacidade de melhora em exercícios. Os resultados tiveram significância estatística e demonstraram restabelecimento da força muscular pelo aumento do fluxo sanguíneo no músculo adutor 25. Em 2002, foi publicado o primeiro estudo clínico em humanos de transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea (CMMO) em 52 pacientes com isquemia crônica dos membros, baseado em modelos prévios e experimentais de isquemia de membro e de isquemia do miocárdio 26. Esse estudo demonstrou a segurança e a eficácia do método em desenvolver angiogênese terapêutica. A implantação das células melhorou a dor em repouso desses pacientes, assim como o fechamento de feridas isquêmicas 26. Outro grupo verificou em humanos, com isquemia crítica de membros na circulação após o procedimento, células CD34 + e CD por um mês 27. A eficiência clínica da terapia celular em isquemia crítica de membro inferior tem como primeiro fator determinante e correlação estreita o número de células CD34 +, células progenitoras circulantes, CEP que expressam em suas membranas a molécula CD Nos últimos anos vários estudos têm sido publicados, citando os resultados in vitro e in vivo, sugerindo o potencial do uso do transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea (TACMMO) para doença arterial periférica de membros inferiores 12,13,18-20, A literatura afirma que obter em humanos esses resultados apresentados com terapia angiogênica ainda representa uma dificuldade a ser transposta 41. A terapia gênica é geralmente obtida via introdução de DNA estranho nas células num processo conhecido como transdução ou transfecção. Pode envolver a entrega integral de genes ativos ou bloqueio da expressão de um gene nativo pela transfecção de oligonucleotídeos antisenso, conhecidos com ácido ribonucleico (RNA) de interferência. Esses RNA são pequenas cadeias de ácido nucleico em fita simples, que têm como finalidade se anelar ao mrna (RNA - mensageiro), impedindo a sua transcrição. A terapia gênica tem como objetivos: a correção, quando ocorre a inserção de um gene funcional no local de um não funcional, deleção de um gene deletério; a complementação quando é feita a introdução de cópia normal sem modificação do original e adição com o acréscimo de um gene ausente no genoma. Na doença vascular periférica, a terapia gênica se focaliza atualmente em três pontos:

4 Reis et al. Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): angiogênese terapêutica, prevenção de reestenose após angioplastia com balão ou colocação de stent e prevenção de insucessos de enxertos vasculares. Os vetores mais utilizados são: adenovirus 25%, retrovirus 23%, Naked DNA 18% (plasmídio purificado) 42. Nos protocolos de terapia gênica clínica têm sido utilizados principalmente os seguintes fatores de crescimento: vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), angiopoetin 1 (Ang-1) ou a expressão da ypoxia inducible factor (HIF-1). Diversos estudos experimentais que utilizaram proteína recombinante ou transferência gênica de angiopoietina -1, VEGF, FGF-2 e HGF foram realizados ou citados A terapia gênica incrementa a produção de fatores de crescimento localmente, por esse processo: um gene que expressa o fator é introduzido em um DNA de origem bacteriana (plasmídio) ou viral (geralmente adenovirus), o qual é introduzido e se incorpora ao DNA nas células dos tecidos isquêmicos, passando a produzir o fator de crescimento Esses fatores de crescimento predominantemente agem nas células endoteliais para promover proliferação e migração dessas células. O VEGF foi identificado inicialmente como o fator que aumenta a permeabilidade vascular. Ele desempenha múltiplas funções biológicas nas células endoteliais: aumento de mediadores vasoativos, aumento de componentes trombolíticos e de via de coagulação, supressão de hiperplasia de célula muscular lisa (CML) vascular, inibição de trombose, hipotensão e vaso-relaxamento. A expressão do VEGF é regulada por hipóxia, a qual gera óxido nítrico (NO) e HIF A transfecção gênica em seres humanos utilizando DNA carreando VEGF (phvegf) foi inicialmente realizada para o tratamento de pacientes com isquemia grave de membros. O primeiro protocolo de terapia gênica para isquemia foi realizado em 1994, com o vetor plasmidial VEGF 165. Como a eficácia não foi inicialmente satisfatória utilizou-se a injeção intramuscular do vetor plasmidial VEGF 165. Surpreendentemente, o resultado foi bem melhor que o esperado e, em consequência disso, três pacientes com dor em repouso evoluíram com melhora sintomática do fluxo arterial após um ano de acompanhamento. Esses resultados foram ratificados através de evidências angiográfica e histológica de neoformação vascular 49. Outro autor sugeriu cautela na interpretação dos seus resultados, questionando se a injeção intramuscular com vetor plasmidial expressaria suficiente phvegf 165 para induzir angiogênese terapêutica em pacientes selecionados com doença arterial periférica 50. Outro estudo randomizado demonstrou resultados positivos, indicando circulação colateral aumentada no grupo tratado com VEGF através de angiografia em três meses 51. O estudo TRAFFIC 52, multicêntrico, fase II, randomizado e controlado por placebo, demonstrou angiogênese terapêutica com fator de crescimento vascular (FGF-2) recombinante, tendo optado pela via intra-arterial por acharem que a distribuição da proteína não é homogênea na injeção no músculo 52. Estudo prévio, fase I, deu suporte no uso de FGF-2 intra-arterial 53. Em estudo duplo-cego controlado com placebo, um grupo foi tratado com injeções intramusculares de vetor plasmidial com gene VEGF e o outro com placebo. Os resultados não foram significativos estatisticamente em relação ao desfecho primário; a amputação, entretanto, demonstrou melhora em relação aos seguintes parâmetros: ITB e cicatrização das feridas 54. Terapia Angiogênica A angiogênese pode ser ordenada assim: vasodilatação, aumento da permeabilidade capilar, degradação da membrana basal e da matriz extracelular, migração de células endoteliais, quimiotaxia de células murais, organização com estabilização celular nos vasos de maior calibre e especialização celular mural 21. Vasos de menor para os de maior calibre diferem, não somente pela sua luz, mas também pelo número de células murais e pelo seu grau de especialização. Essa organização pode ser desfeita por estímulos de injúria tissular, como exemplo, a hipóxia. As junções intercelulares têm importante papel na homeostasia do endotélio pelo fato de inibir por contato a sua migração. Sua sustentação no tecido é feita pelo arcabouço da membrana basal, um ultrafiltrado amorfo da matriz e por uma célula perivascular chamada de pericito 21. Em humanos foi demonstrado por Therapeutic Angiogenesis using Cell Transplantation (TACT), que o grupo tratado com CTMMO apresentou melhora significativa nos seguintes parâmetros: ITB, dor em repouso e ausência de dor ao caminhar. Kajigushi et al. 27 avaliaram sete pacientes com isquemia de membro de acordo com o protocolo TACT e verificaram as respostas encontradas com aumento de CD 34 + e CD mantido elevado por um mês 27. A liberação de citocinas como VEGF e bfgf moduladas por células da medula óssea remodelam a circulação colateral mais ativamente do que pela incorporação 333

5 Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Reis et al. celular direta. O espectro da expressão gênica das citocinas pelas células da medula óssea está relacionado aos mecanismos parácrinos que sustentam os efeitos biológicos da terapia celular para tecido isquêmico 55. A liberação de citocinas é suficiente para mediar arteriogênese e circulação colateral após a terapia celular. Entretanto, mecanismos complementares devem contribuir para o efeito benéfico e formação de vasos sanguíneos. As células endoteliais derivadas da medula devem ter um efeito parácrino nas células endoteliais in situ pela secreção de fatores de crescimento angiogênicos 56. As células precursoras endoteliais originadas na medula óssea podem ser identificadas como CD34 + e VEGFR2 +, embora outros marcadores como o AC133 + e CD31 + tenham sido descritos. Durante a isquemia tecidual, com a queda dos níveis de oxigênio, ocorre aumento da produção de HIF-1 que, por sua vez, desencadeará aumento de vários fatores de crescimento, mais notadamente o VEGF. O aumento de VEGF vai ser o principal estímulo para a mobilização das células da MO, assim como o principal sinal para o homing dessas células nos tecidos isquêmicos e sua posterior diferenciação em células endoteliais em estruturas tubulares 31,50. Baumgartner et al. 50, em 1998, publicam o seu trabalho em humanos, documentando a segurança e eficiência da transferência gênica intramuscular em pacientes com isquemia crítica de membros, demonstrando: elevação do VEGF em pico por uma a três semanas, melhora do ITB, circulação colateral evidente e melhora do fluxo sanguíneo 50. A aplicação de VEGF para a neovascularização terapêutica mobiliza as CEP 57. O granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) é sabidamente um fator de crescimento estimulador da hematopoese, que aumenta a proliferação e sobrevivência das células hematopoiéticas. Em animais com isquemia de membro, demonstrou-se que o uso da proteína recombinante GM-CSF estimula a função dos tecidos afetados 31, porém esse resultado não foi confirmado em pacientes com DAOP 58. Os monócitos têm importante ação no remodelamento dos vasos locais e o GM-CSF inibe a apoptose dessas células, demonstrando regeneração física e fisiológica em modelo de isquemia em camundongo 59. É um dos fatores que mobiliza as células-progenitoras circulantes auxiliando assim potencialmente a maturação dos vasos. Ele mobiliza também os progenitores endoteliais, iniciando eventualmente a vasculogênese que pode complementar a angiogênese 31,60. Os efeitos da aplicação subcutânea do GM-CSF na distância máxima de caminhada e ITB 334 no estudo START 58 não demonstraram também efeito terapêutico em pacientes com claudicação intermitente grave 58. O transplante intramuscular de células-tronco da medula óssea em pacientes com arteriopatia periférica grave, sem possibilidade de tratamento cirúrgico ou percutâneo, viabiliza a melhora clínica desses pacientes de forma segura, através da diferenciação dessas células em células vasculares, gerando um processo de angiogênese capaz de diminuir a carga isquêmica e de promover a regeneração tecidual. Entretanto, em The optmization of progenitor endothelial cells in the treatment of critical leg ischemia (OPTIPEC) os autores concluem seu trabalho afirmando que em pacientes com isquemia crítica, o tratamento com terapia celular talvez não seja suficiente para prevenir amputação na isquemia grave, embora a terapia com CMMO induza atividade na isquemia crítica de membro inferior 39. A terapia gênica pode induzir aumento da função endotelial, desenvolvimento de circulação colateral, cicatrização de úlceras e salvamento de membros, eliminando a necessidade de amputação em alguns pacientes 36,49,50. Perspectiva atual Apesar dos avanços tecnológicos na terapêutica clínica conservadora ou cirúrgica intervencionista com técnicas abertas convencionais ou endovasculares, está clara a necessidade de opções adicionais de tratamento. Outras já utilizadas não demonstraram benefício em diminuir os índices de amputação após seis meses de acompanhamento 36. A terapia celular e a terapia gênica, ambas, tanto nos experimentos em animais como em estudos clínicos, demonstraram resultados promissores usando populações de células-tronco, uma variedade de gens, introduzidos com diferentes vetores, respectivamente. Um dos aspectos mais desafiadores para o futuro em relação ao tratamento da isquemia crítica de membros inferiores é que ele poderá interferir tanto no prognóstico de sobrevida como no salvamento dos membros. Um membro revascularizado com sucesso significa redução da dor e melhora da qualidade de vida plenamente, ainda que por tempo limitado, dependendo do estágio da doença. A amputação pode ser uma alternativa para reduzir a dor, porém diminui ou impossibilita, na maioria das vezes, a oportunidade do restabelecimento social e a autonomia individual dos pacientes portadores de DAOP 6,61. A atenção com a DAOP deverá aumentar, seja pelo número de pacientes seja pela complexidade das lesões em termos de sua gravidade e impacto direto devido à natureza sistêmica da doença 3-6.

6 Reis et al. Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): O número de intervenções está aumentando e é estimado que o procedimento endovascular responda por 50% a 70% do total de procedimentos nos membros inferiores 6. Muitas dessas técnicas são utilizadas simultaneamente com técnicas abertas tradicionais ou complementares a essas. Nesse caso, o procedimento é chamado de cirurgia híbrida. Nas técnicas cirúrgicas abertas (convencionais), apesar das inovações, não existe nenhum novo conceito de impacto, além dos conhecimentos já preconizados e divulgados, que altere o prognóstico desse grupo de pacientes. As novas técnicas tendem a se relacionar a técnicas minimamente invasivas nas reconstruções arteriais, com o objetivo de reduzir a morbidade, complicações nas feridas e seus efeitos negativos na patência das revascularizações 3,6. Os critérios utilizados para contraindicar os procedimentos de revascularização são de acordo com dados padronizados por consensos internacionais 4,9. Por exemplo: artérias de pequeno calibre que não servem como artérias receptoras de enxerto, muitas vezes mantidas por extensa rede de circulação colateral que, no entanto, não é suficiente para gerar perfusão adequada à determinada área distal do membro inferior, portanto, há ausência de leito distal e de artéria viável para a anastomose das revascularizações. Deficiência de circulação distal da artéria receptora do deságue do enxerto, anatomias complexas muitas vezes envolvendo enxertos arteriais e/ou venosos, dificuldade de acesso percutâneo, ausência de enxertos venosos compatíveis que possam ser utilizados na revascularização, representam condições clínicas desfavoráveis. A história natural da isquemia crítica de membros inferiores pode ter uma progressão inexorável para a amputação, a menos que seja realizado um procedimento que melhore a perfusão do membro. O prognóstico do paciente se agrava e cerca de 30% dos sobreviventes irão falecer em dois anos e uma segunda amputação será necessária em 1/3 desses pacientes. Esses pacientes têm uma qualidade de vida semelhante aos pacientes com câncer em fase terminal 62. Existem controvérsias sobre a via ideal de liberação das células progenitoras, sendo motivo de investigação. Van Torgeren et al. 40 demonstraram eficiência nas duas formas de administração em termos de salvamento de membro, aumento do tempo livre de dor ao caminhar, ITB e alívio da dor isquêmica 40. Alguns autores usaram preferencialmente a via intramuscular para injeção terapêutica 26,27,40,44,46,54,61. Existe também o potencial de liberação dos fatores de crescimento ao longo da parede dos vasos 40,44,46. Estudos preliminares de transferência gênica intramuscular utilizando vetor plasmídio de ph VEGF 165 demonstraram desenvolvimento de circulação colateral e melhora do sintoma de dor 50. Alguns autores estão utilizando vetores virais para melhorar a eficiência da transferência gênica 44,63,64. As maiores limitações do vetor adenoviral são: a falta de sustentação da expressão, a antigenicidade das proteínas virais e a possível toxicidade em doses altas. Em protocolos humanos, vetores adenovirais têm causado reação inflamatória, formação de anticorpos contra o adenovirus e febre transitória 45. Esses vetores podem ter uma expressão gênica maior, mas o risco de incompatibilidade imunológica é maior do que aquele observado com os vetores plasmidiais; os vetores virais são micro-organismos e os plasmídios, moléculas mais fáceis de serem manipuladas 42. O DNA nu liberado diretamente nos tecidos pode induzir à expressão gênica local; embora a eficiência da taxa de transfecção muscular seja baixa, a expressão transgênica persiste por até vários meses. A transfecção de um plasmídio, contendo o gene VEGF (phvegf 165 human plasmid) em músculo ou na parede dos vasos sanguíneos, é seguida pela sua expressão local e aumento dos níveis circulantes de VEGF por pelo menos 15 dias 43. Para aumentar a entrada de DNA nu na célula foram aplicados vários métodos entre eles a eletroporação 65. Uma expressão gênica in vivo com nível terapêutico mínimo e suficiente é essencial para terapia gênica. Ao lado do VEGF, FGF e angiopoietina, outros fatores de crescimento estão sendo investigados 46,52,53,66. Um dos principais problemas encontrados no uso de VEGF é que os vasos formados são instáveis e muito permeáveis (leaks). Os vasos gerados por VEGF são normalmente capilares, enquanto os produzidos por FGF parecem ser mais maduros 66. Os trabalhos iniciais em humanos para isquemia crítica de membros foram limitados a pacientes com doença oclusiva avançada, os quais foram excluídos da possibilidade de revascularização dos seus membros ou aqueles que após o procedimento cirúrgico não obtiveram êxito satisfatório, realizando então a terapia angiogênica. O fato é que provavelmente esses pacientes, que têm doença avançada, terão potencial terapêutico reduzido nas células colhidas de suas medulas, o que não é o mesmo do que sem nenhum potencial, mas representa um desafio em termos de se executar uma estratégia em que células autólogas utilizadas podem ter diferentes potenciais e os pacientes que mais precisam ajuda podem ser os mesmos, os quais, as células progenitoras tenham a menor potência. 335

7 Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Reis et al. Apesar dos resultados diversificados, principalmente em humanos, é estimulante para os cirurgiões vasculares, que novos alvos de pesquisa e de tratamento para isquemia de membros inferiores estejam em desenvolvimento contínuo e, portanto, aperfeiçoando-se. A angiogênese terapêutica é uma nova ferramenta no tratamento da isquemia crítica de membros inferiores, no entender deste grupo de pesquisadores. Esse fato não veio substituir nenhuma outra ferramenta, mas complementar e contribuir em conjunto com outras técnicas. Entretanto, pode-se admitir que já se esteja no limiar do futuro ou da próxima fronteira, com os resultados verificados na literatura em animais e em estudos clínicos, permitindo afirmar que poderá haver surpresas positivas por ser uma área do conhecimento humano ainda embrionária. Apresenta tópicos ainda a serem resolvidos, como a questão de por que os efeitos pró-angiogênicos são tão evidentes nas pesquisas pré-clínicas e não são tão evidentes nos estudos clínicos 36? Como realizar a seleção dos pacientes com variadas comorbidades? A investigação de um determinado efeito próangiogênico, a dose a ser aplicada na terapêutica, a via de liberação e escolha do fator de crescimento são tópicos que merecem análise mais rigorosa. Animais com diabetes e aterosclerose apresentam resposta endotelial aos fatores angiogênicos diferentes: camundongos diabéticos demonstraram uma revascularização diminuída, devido a alterações no sistema de regulação angiogênica 67. Em relação à hipercolesterolemia, verificou-se também diminuição no crescimento de circulação colateral em camundongos 68. Mecanismos induzidos pela isquemia, sensores metabólicos demonstram a indução da expressão VEGF e angiogênese em modelos animais independente da via HIF-1, podendo ser um fator adjuvante no tratamento da doença isquêmica 69. Conclusão Sem dúvida a angiogênese terapêutica é uma nova ferramenta no tratamento da isquemia crítica de membros inferiores, que necessita de estudos randomizados e controlados para definir a melhor direção a ser tomada. A terapia angiogênica é uma opção de tratamento viável para pacientes com isquemia crítica de membros inferiores, sendo necessários perseverança e entusiasmo nos estudos experimentais e clínicos em humanos. Outras investigações serão necessárias para a otimização dessas terapias, avaliando a eficácia e a segurança delas no tratamento da isquemia crítica de membros 336 inferiores 36,45. Até o momento demonstrou-se que tais terapias são factíveis, mas é necessário realizar mais protocolos randomizados com número grande de doentes analisados e tendo como parâmetro final a preservação do membro, evitando a amputação maior e a qualidade de vida dos pacientes. Sendo assim, o tratamento angiogênico emerge como uma terapia proeminente para tratamento da DAOP grave, atuando como formador de condutos, bypass endógenos, em torno de artérias periféricas ocluídas e distais a estas, dando a oportunidade, acredita-se, de mudar finalmente a história natural dessa doença. Potencial Conflito de Interesses Declaro não haver conflitos de interesses pertinentes. Fontes de Financiamento O presente estudo não teve fontes de financiamento externas. Vinculação Acadêmica Este artigo representa parte da tese de Doutorado em Ciências Morfológicas de Paulo Eduardo Ocke Reis pela Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Referências 1. Kannel WB, McGee DL. Update on some epidemiological features of intermittent claudication: the Framingham Study. J Am Geriatr Soc. 1985;33(1): Murabito JM, D Agostino RB, Silbershatz H, Wilson WF. Intermittent claudication. A risk profile from The Framingham Heart Study. Circulation. 1997;96(1): Dormandy JA, Rutherford RB. Management of peripheral arterial disease (PAD). TASC Working Group. TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC). J Vasc Surg. 2000;31(1 Pt 2):S1-S Suggested standards for reports dealing with lower extremity ischemia. Prepared by the Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery/ North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg.1986;4(1): Erratum in: J Vasc Surg. 1986;4(4): Dormandy JA, Heeck L, Vig S. Predictors of early disease in the lower limbs. Semin Vasc Surg. 1999;12(2): Norgren L, Hiatt WR, Dormandy JA, Nehler MR, Harris KA, Fowkes FG; TASC II Working Group. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). J Vasc Surg. 2007;45(Suppl S):S Bosch JL, van der Graaf Y, Hunink MG. Health-related quality of life after angioplasty and stent placement in patients with iliac artery occlusive disease: results of a randomized controlled clinical trial. The Dutch Iliac Stent Trial Study Group. Circulation. 1999;99(24):

8 Reis et al. Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Spichler D. Amputações maiores de membros inferiores no município do Rio de Janeiro, por doença arterial periférica e diabetes mellitus: incidência, mortalidade hospitalar e tardia. Período [tese]. São Paulo: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP); Second European Consensus Document on chronic critical leg ischemia. Circulation. 1991;84(4 Suppl):IV Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. N Engl J Med. 1971;285(21): Takeshita S, Zheng LP, Brogi E, Kearney M, Pu LQ, Bunting S, et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. J Clin Invest. 1994;93(2): Asahara T, Murohara T, Sullivan A, Silver M, van der Zee R, Li T, et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 1997;275(5302): Sprengers RW, Lips DJ, Moll FL, Verhaar MC. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Ann Surg. 2008;247(3): Weissman IL. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science. 2000;287(5457): Donovan PJ, Gearhart J. The end of the beginning for pluripotent stem cells. Nature. 2001;414(6859): Reyes M, Lund T, Lenvik T, Aguiar D, Koodie L, Verfaillie CM. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood. 2001;98(9): Kucia M, Wysoczynski M, Ratajczak J, Ratajczak MZ. Identification of very small embryonic like (VSEL) stem cells in bone marrow. Cell Tissue Res. 2008;331(1): Shi Q, Rafii S, Wu MH, Wijelath ES, Yu C, Ishida A, et al. Evidence for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood. 1998;92(2): Asahara T, Isner JM. Endothelial progenitor cells for vascular regeneration. J Hematother Stem Cell Res. 2002;11(2): Al-Khaldi A, Al-Sabti H, Galipeau J, Lachapelle K. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model. Ann Thorac Surg. 2003;75(1): Jain RK. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 2003;9(6): Shintani S, Murohara T, Ikeda H, Ueno T, Honma T, Katoh A, et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circulation. 2001;103(23): Jackson KA, Majka SM, Wang H, Pocius J, Hartley CJ, Majesky MW, et al. Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 2001;107(11): Menasché P, Hagège AA, Scorsin N, Pouzet B, Desnos M, Duboc D, et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 2001;357(9252): Ikenaga S, Hamano K, Nishida M, Kobayashi T, Li TS, Kobayashi S, et al. Autologous bone marrow implantation induced angiogenesis and improved deteriorated exercise capacity in a rat ischemic hindlimb model. J Surg Res. 2001;96(2): Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, Ikeda U, Shintani S, Masaki H, et al; Therapeutic Angiogenesis using Cell Transplantation (TACT) Study Investigators. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bonemarrow cell: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 2002;360(9331): Kajiguchi M, Kondo T, Izawa H, Kobayashi M, Yamamoto K, Shintani S, et al. Safety and efficacy of autologous progenitor cell transplantation for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Circ J. 2007;71(2): Saigawa T, Kato K, Ozawa T, Toba K, Makiyama Y, Minagawa S, et al. Clinical application of bone marrow implantation in patients with arteriosclerosis obliterans, and the association between efficacy and the number of implanted bone marrow cells. Circ J. 2004;68(12): Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res. 1999;85(3): Asahara T, Kalka C, Isner JM. Stem cell therapy and gene transfer for regeneration. Gene Ther. 2000;7(6): Buschmann I, Schaper W. The pathophysiology of the collateral circulation (arteriogenesis). J Pathol. 2000;190(3): Carmeliet P, Luttun A. The emerging role of the bone marrow-derived stem cells in (therapeutic) angiogenesis. Thromb Haemost. 2001;86(1): Iba O, Matsubara H, Nozawa Y, Fujiyama S, Amano K, Mori Y, et al. Angiogenesis by implantation of peripheral blood mononuclear cells and platelets into ischemic limbs. Circulation. 2002;106(15): Reis PEO. Bone marrow stem cells and their role in angiogenesis. J Vasc Br. 2005;4(4): Huang PP, Yang XF, Li SZ, Wen JC, Zhang Y, Han ZC. Randomised comparison of G-CSF-mobilized peripheral blood mononuclear cells versus bone marrowmononuclear cells for the treatment of patients with lower limb arteriosclerosis obliterans. Thromb Haemost. 2007;98(6): Emmerich J. Current state and perspective on medical treatment of critical leg ischemia: gene and cell therapy. Int J Low Extrem Wounds. 2005;4(4): Araújo JD, Araújo Filho JD, Ciorlin E, Ruiz MA, Ruiz LP, Greco OT, et al. A terapia celular no tratamento da isquemia crítica de membros inferiores. J vasc br. 2005;4(4): Yoshida WB. Angiogênese, arteriogênese e vasculogênese: tratamento do futuro para isquemia crítica de membros? J vasc br. 2005;4(4):

9 Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Reis et al. 39. Duong Van Huyen JP, Smadja DM, Bruneval P, Gaussem P, Dal-Cortivo L, Julia P, et al. Bone marrow-derived mononuclear cell therapy induces distal angiogenesis after local injection in critical leg ischemia. Mod Pathol. 2008;21(7): Van Tongeren RB, Hamming JF, Fibbe WE, Van Weel V, Frerichs SJ, Stiggelbout AM, et al. Intramuscular or combined intramuscular/intra-arterial administration of bone marrow mononuclear cells: a clinical trial in patients with advanced limb ischemia. J Cardiovasc Surg (Torino). 2008;49(1): Kalka C, Baumgartner I. Gene and stem cell therapy in peripheral arterial occlusive disease. Vasc Med. 2008;13(2): Baptista-Silva JC, Chester BS. Princípios da terapia gênica para isquemia crônica-crítica. In: Brito JL. Cirurgia vascular, endovascular e angiologia. Rio de Janeiro: Revinter; p Takeshita S, Weir L, Chen D, Zheng LP, Riessen R, Bauters C, et al. Therapeutic angiogenesis following arterial gene transfer of vascular endothelial growth factor in a rabbit model of hindlimb ischemia. Biochem Biophys Res Commun. 1996;227(2): Tsurumi Y, Kearney M, Chen D, Silver M, Takeshita S, Yang J, et al. Treatment of acute limb ischemia by intramuscular injection of vascular endothelial growth factor gene. Circulation. 1997;96(9 Suppl):II Bobek V, Taltynov O, Pinterova D, Kolostova K. Gene therapy of the ischemic lower limb--therapeutic angiogenesis. Vascul Pharmacol. 2006;44(6): Ylä-Herttuala S, Alitalo K. Gene transfer as a tool to induce therapeutic vascular growth. Nat Med. 2003;9(6): Silva JC, Moraes MR, Han SW. Doença aterosclerótica generalizada e aterotrombose: da ciência experimental à abordagem clínica e à terapia celular. In: Sitrângulo Jr C, Kauffman P, eds. Doença aterosclerótica periférica. São Paulo: BBS; p Murohara T, Asahara T, Silver M, Bauters C, Masuda H, Kalka C, et al. Nitric oxide synthase modulates angiogenesis in response to tissue ischemia. J Clin Invest. 1998;101(11): Isner JM, Pieczek A, Schainfeld R, Blair R, Haley L, Asahara T, et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phvegf165 in patient with ischaemic limb. Lancet. 1996;348(9024): Baumgartner I, Pieczek A, Manor O, Blair R, Kearney M, Walsh K, et al. Constitutive expression of phvegf165 after intramuscular gene transfer promotes collateral vessel development in patients with critical limb ischemia. Circulation. 1998;97(12): Mäkinen K, Manninen H, Hedman M, Matsi P, Mussalo H, Alhava E, et al. Increased vascularity detected by digital subtraction angiography after VEGF gene transfer to human lower limb artery: a randomized, placebocontrolled, double-blinded phase II study. Mol Ther. 2002;6(1): Lederman RJ, Tenaglia AN, Anderson RD, Hermiller JB, Rocha-Singh K, Mendelsohn FO, et al. Design of the therapeutic angiogenesis with recombinant fibroblast growth factor-2 for intermittent claudication (TRAFFIC) trial. Am J Cardiol. 2001;88(2): Lazarous DF, Unger EF, Epstein SE, Stine A, Arevalo JL, Chew EY, et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 2000;36(4): Kusumanto YH, van Weel V, Mulder NH, Smit AJ, van den Dungen JJ, Hooymans JM, et al. Treatment with intramuscular vascular endothelial growth factor gene compared with placebo for patients with diabetes mellitus and critical limb ischemia: a doubleblind randomized trial. Hum Gene Ther. 2006;17(6): Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, Lee CW, Barr S, Fuchs S, et al. Marrow-derived stromal cells express genes encoding a broad spectrum of arteriogenic citokines and promote in vitro and in vivo arteriogenesis trough paracrine mechanisms. Circ Res. 2004;94(5): Erratum in: Circ Res. 2005;97(3):e Kamihata H, Matsubara H, Nishiue T, Fujiyama S, Tsutsumi Y, Ozono R, et al. Implantation of bone marrow mononuclear cells into ischemic myocardium enhances collateral perfusion and regional function via side supply of angioblasts, angiogenic ligands, and cytokines. Circulation. 2001;104(9): Kalka C, Tehrani H, Laudenberg B, Vale PR, Isner JM, Asahara T, et al. VEGF gene transfer mobilizes endothelial progenitor cells in patients with inoperable coronary disease. Ann Thorac Surg. 2000;70(3): van Royen N, Schirmer SH, Atasever B, Behrens CY, Ubbink D, Buschmann EE, et al. START Trial: a pilot study on STimulation of ARTeriogenesis using subcutaneous application of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as a new treatment for peripheral vascular disease. Circulation. 2005;112(7): Sacramento CB, Cantagalli VD, Grings M, Carvalho LP, Baptista-Silva JC, Beutel A, et al. Granulocytemacrophage colony-stimulating factor gene based therapy for acute limb ischemia in a mouse model. J Gene Med. 2009;11(4): Buschmann IR, Busch HJ, Mies G, Hossmann KA. Therapeutic induction of arteriogenesis in hypoperfused rat brain via granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Circulation. 2003;108(5): Attanasio S, Snell J. Therapeutic angiogenesis in the management of critical limb ischemia: current concepts and review. Cardiol Rev. 2009;17(3): Albers M, Fratezi AC, De Luccia N. Assessment of quality of life of patients with severe ischemia as a result of infrainguinal arterial occlusive disease. J Vasc Surg. 1992;16(1):54-9.

10 Reis et al. Rev Bras Cardiol. 2012;25(4): Takeshita S, Isshiki T, Mori H, Tanaka E, Eto K, Miyazawa Y, et al. Use of synchrotron radiation microangiography to assess development of small collateral arteries in a rat model of hindlimb ischemia. Circulation. 1997;95(4): Shah PB, Lotun K, Losordo DW. Cardiovascular gene therapy. In: Templeton NS. Gene and cell therapy: therapeutic mechanisms and strategies. New York: Marcel Deckker; p Escoffre JM, Portet T, Wasungu L, Teissié J, Dean D, Rols MP. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Mol Biotechnol. 2009;41(3): Rissanen TT, Vajanto I, Ylä-Herttuala S. Gene therapy for therapeutic angiogenesis in critically ischaemic lower limb - on the way to the clinic. Eur J Clin Invest. 2001;31(8): Schiekofer S, Galasso G, Sato K, Kraus BJ, Walsh K. Impaired revascularization in a mouse model of type 2 diabetes is associated with dysregulation of a complex angiogenic-regulatory network. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005;25(8): van Weel V, de Vries M, Voshol PJ, Verloop RE, Eilers PH, van Hinsbergh VW, et al. Hypercholesterolemia reduces collateral artery growth more dominantly than hyperglycemia or insulin resistance in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26(6): Arany Z, Foo SY, Ma Y, Ruas JL, Bommi-Reddy A, Girnun G, et al. HIF-independent regulation of VEGF and angiogenesis by the transcriptional coactivator PGC- 1alpha. Nature. 2008;451(7181):