Uso de vírus que infectam plantas como molécula. carreadora de proteínas patogênicas de interesse da. Medicina Veterinária.

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1 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Francisco Jarbas Santos de Sousa Uso de vírus que infectam plantas como molécula carreadora de proteínas patogênicas de interesse da Medicina Veterinária. Fortaleza, Ceará Dezembro de 2003

2 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-graduação e Pesquisa FACULDADE DE VETERINÁRIA Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Francisco Jarbas Santos de Sousa Uso de vírus que infectam plantas como molécula carreadora de proteínas patogênicas de interesse da Medicina Veterinária Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do Grau de mestre em Ciências Veterinárias Área de concentração: Reprodução e sanidade animal. Orientadora: Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira Fortaleza, Ceará Dezembro de 2003 II

3 Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-graduação e Pesquisa FACULDADE DE VETERINÁRIA Programa de Pós Graduação em Ciências Veterinárias Uso de vírus que infectam plantas como molécula carreadora de proteínas patogênicas de interesse da Medicina Veterinária Autor: Francisco Jarbas Santos de sousa Aprovada em / / Banca Examinadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira Orientadora Prof. Dra. Maria Izabel Florindo Guedes Co-orientadora Examinadora Profa. Dra. Maria Erivalda Farias de Aragão Examinadora Prof.a Dra. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos Examinadora III

4 AGRADECIMENTOS Ao Criador de todas as coisas, Deus. A professora Fátima que acreditou na minha capacidade e que teve um carinho muito grande por mim, mesmo sendo eu a pessoa difícil que sou. A professora Izabel que faz dos meus pequenos pensamentos um enorme sonho possível de realização. A professora Erivalda por toda a ajuda no desenrolar do trabalho, sendo mais que uma examinadora, foi parte deste sonho. Ao meu amigo Marcelo Róseo pela participação em todos os pontos nesta dissertação, me ensinando muito. Aos meus amigos Ney de Carvalho e Jeanberg por tudo o que vivemos durante o nosso mestrado. Aos amigos do laboratório de virologia e de bioquímica humana por terem me acolhido e permitido uma aprendizagem tranqüila e harmonioza, construindo em mim um pesquisador mais responsável e dinâmico. Aos meus pais que são tudo para mim, mesmo quando pareço muito distante. Sei que só chegarei onde quero ir porque eles me mostraram a direção. Aos meus amigos Ed, Jack, Jeff e evalnir sempre acreditar que posso conseguir um pouco mais. A vc que tanto adoro. A todos as pessoas que contribuíram direta e indiretamente para a realização deste trabalho. IV

5 AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS À Universidade Estadual do Ceará, por disponibilizar os laboratórios de Virologia e de Bioquímica Humana para a realização deste trabalho. de estudo. À Fundação Cearense de Amparo à Pesquisa (FUNCAP), pela concessão de bolsa Ao Banco do Nordeste/ETENE/FUNDECI pelo apoio financeiro. Ao Biotério Central da UFC por Ter cedido os animais para os experimentos. V

6 SUMÁRIO -AGRADECIMENTOS -AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS IV V - LISTAS DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS - RESUMO -ABSTRACT 1-INTRODUÇÃO 2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA VI VII VIII Artrite encefalite caprina Estrutura e genoma viral Vírus fitopatogênico Vírus de vegetais como sistemas de antigenos Caracterização do CPSMV 6 3-HIPÓTESE 8 4-JUSTIFICATIVA 9 5-OBJETIVO Geral Específicos 10 6-MATERIAIS E MÉTODOS Produção da massa viral Animais Purificação do vírus Dosagem de proteínas Produção da quimera Eletroforese desnaturante (SDS-PAGE) Preparação das amostras Imunização subcutânea Obtenção dos anti-soros Sorologia Elisa Western Blotting 17 8-RESULTADOS 18 9-DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 27 VI

7 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS C- graus Celsius d.p.- desvio padrão FUNCAP- Fundação Cearense de Apoio à Pesquisa FIG- figura g- gramas µg- micrograma mg- miligrama µl- microlitros ml- mililitros %- percentual PV- peso vivo VII

8 RESUMO O vírus da Artrite-encefalite caprina (CAEV) pertence à família Retroviridae, gênero lentivirus. Este vírus infecta caprinos do mundo inteiro causando artrite, encefalite, mamite, emagrecimento progressivo. Ainda não existe tratamento e nem vacina para esta enfermidade, sendo o controle realizado pelo diagnóstico, o mais precoce possível. Alguns vírus de vegetais vêm sendo utilizados para expressar e/ou carrear peptídeos de patógenos humanos e de animais, formando quimeras que são utilizadas como antígenos. O objetivo deste trabalho foi inserir a proteína P28 do CAEV no capsídeo do Vírus do Mosaico Severo do Caupí (CPSMV) através de ligação covalente com glutaraldeído e estudar a eficácia do mesmo como molécula carreadora. A quimera foi construída através da mistura de glutaraldeído, CPSMV e P28 do CAEV e purificada por meio de cromatografia em biogel e sefadex. G-50. Em seguida foram realizadas leituras em espectrofotômetro no comprimento de onda de 280nm Os picos contendo a quimera foram coletados e submetidos à eletroforese, sendo evidenciado a banda correspondente à mesma. Grupos de camundongos foram imunizados com o vírus quimérico, CPSMV e com a proteína P28 utilizando adjuvante de Freund incompleto. Os anticorpos específicos para o CPSMV e P28 reconheceram a proteína quimérica em Western Blotting e ELISA demonstrando eficácia do método. Os resultados demonstraram que o acoplamento covalente entre o CPSMV e a P28 do CAEV foi construída com sucesso, originando uma molécula. estável. Ademais demonstrou que o vírus quimérico apresenta maior imunogenicidade do que a proteína P28 sozinha. Desta forma pode se sugerir que o CPSMV pode ser utilizado como molécula carreadora na produção de vacinas para vírus que infectam animais. VIII

9 ABSTRACT Caprine arthritis-encephalits virus (CAEV) belongs to retroviridae family, lentvirus genus. This virus attacks caprine all over the world causing such arthritis,encephalits, mamitis and progressive fading. There is any known treatment or vaccine yet for this disease, and its control is under the most possible precocius diagnostic. Some plant virus have been used to express and/or carrie human patogenic peptides and in other animals, developing chimeric wich are used as antigens. The purpose of this study was to insert P28 protein CAEV in capsid of Caupi Severe Mosaic Virus (CPSMV) trhough the covalent bind with glutaraldehyde and research its efficacy as a carrier molecule. The chimera was developed from the mix of glutaraldehyde, CPSMV and CAEV P28, and purified through the chromotography in biogel and sephadex. After that, it was developed some measures in a spectrophometric to absorbence at 280nm. Peaks which countainned chimera were collected and submited to SDS-PAGE, evidencing the band relative to itself. Groups of swiss mice were immunized with chimerc virus, CPSMV with P28 protein using incomplete Freund Adjuvant.CPSMV-specific antibodies and P28 recognized chimeric protein in Western Blotting and ELISA showing efficacy of the method.the results showed the coupling covalent between CPSMV and CAEV P28 was sucessfully build, originating a stable molecule. Besides it showed that chimeric virus presents more immunogenicity than protein P28 isolated. So, we may suggest CPSMV can be used as a carrier molecule in the production of vaccines to the virus wich infect animals. IX

10 1-INTRODUÇÃO O rebanho caprino nacional é composto de cabeças, das quais 80% estão alocadas no Nordeste e 1/3 deste no Ceará. A caprinocultura atual é uma atividade de grande importância na nossa região. A implementação de técnicas de melhoramento genética aliada à falta de manejo sanitário contribuiu para o surgimento de doenças exóticas. No intuito de detectar doenças infecciosas que possam interferir na sanidade dos rebanhos, técnicas de diagnósticos de monitoramento de planteis saudáveis vêm sendo aplicadas, dentre estas estão os teste de imunodifusão em gel de agarose (IDGA); testes imunoenzimáticos como ELISA e western blot, testes de Biologia Moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR), realizados para detecção de doenças como brucelose, a Artrite Encefalite Caprina (CAE), etc. A Artrite Encefalite Caprina (CAE) é uma doença específica de caprinos, afetando-os em todo o mundo, tendo como principais sintomas clínicos: artrite, encefalite, mamite, emagrecimento crônico dos animais adultos e mais raramente pneumonia progressiva (Franke, 1998). Esta doença é causada por um vírus RNA, pertencente ao gênero Lentivirus da família Retroviridae e sub-família Lentivirinae, muito semelhante ao Maedi/Visna dos ovinos (Crawford et al., 1980; Norman, Smith, 1983). Pertencem também a esta família os vírus da anemia infecciosa eqüina (EIAV), da imunodeficiência felina (FIV), da imunodeficiência bovina (BIV), da imunodeficiência símia (SIV), da imunodeficiência humana (HIV) e doença de Jembrana. Mesmo com o diagnóstico em mãos, tudo o que pode ser feito é eliminar os animais positivos para que não venham a infectar o resto do rebanho. Porém, se os animais forem imunizados contra X

11 este vírus de forma segura estaria excluída a possibilidade de perdas financeiras desastrosas, uma vez que um animal infectado pode passar o vírus para todo o plantel. Para isso faz-se necessário à confecção de uma vacina diferente das de DNA que possuem riscos de reversão, e sem a preocupação das vacinas atenuadas. Os vírus fitopatogênicos vêm sendo utilizados em todo o mundo como um excelente vetor para proteínas exógenas, servindo então como o pivô na construção de vacinas mais seguras, uma vez que não são patogênicos para os homens e outros animais. O Vírus do Mosaico Severo do Caupí (CPSMV) possui diversas características que o coloca como um dos vírus fitopatogênicos mais promissor para este fim, dentre elas a fácil transmissão mecânica; a capacidade de atingi altas concentrações na planta hospedeira; de ser um vírus estável; de fácil purificação; e possuir um hospedeiro com um ciclo curto, facilitando o seu desenvolvimento. Sendo assim, uma quimera pode ser construída utilizando o CPSMV e uma proteína do CAEV, a P28 para imunização dos animais de forma eficiente e sem riscos. XI

12 2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1-Artrite Encefalite Caprina A CAE foi descrita pela primeira vez nos Estados Unidos (Cork et al., 1974). No Brasil, o primeiro registro sorológico do CAE foi realizado no Rio Grande do Sul (Moojen et al., 1986), assim como o isolamento do vírus (Hortze et al., 1992). Posteriormente, foram registrados casos em São Paulo (Garcia et al., 1992) e Minas Gerais (Assis, Gouveia., 1994). Na região nordeste foi registrada a ocorrência de animais soropositivos na Bahia (Fiterman, 1988; Assis, Gouveia, 1994), no Ceará (Pinheiro et al., 1989; Assis, Gouveia, 1994) e em Pernambuco (Castro et al., 1994). Em Fortaleza, onde se encontra a maior parte da caprinocultura leiteira do estado do Ceará, estudos epidemiológicos demonstraram uma soroprevalência de 40,7% (Melo, 1996; Melo & Franke, 1997). A transmissão do vírus entre os caprinos ocorre, com maior freqüência, através de monócitos e macrófagos infectados presente principalmente no colostro e leite (Adams et al., 1983; Ellis et al., 1986). Pode ocorrer também através de contato direto prolongado e/ou por outras fontes contaminantes como sangue, fezes, saliva, lágrimas, além de alimentos contaminados, máquinas de ordenha e materiais cirúrgicos mal higienizados (Rowe et al.,1992). XII

13 2.2-Estrutura e genoma viral Os retrovírus são partículas esféricas de aproximadamente 120nm de diâmetro revestido por um invólucro lipoprotéico derivado da membrana citoplasmática das células que os produzem, nos quais estão presentes duas glicoproteínas constituindo as espículas do vírion os quais proporcionam a entrada dos vírus no interior das células após a fixação nos receptores específicos presentes na membrana celular. Subjacente a estas estruturas, situase uma camada de natureza protéica (matriz). No interior do vírion localiza-se o nucleocapsídeo, que no caso dos lentivirus, apresenta-se de forma cônica. O genoma dos lentivirus contém genes gag e env que são estruturais e genes pol enzimáticos característicos da família Retroviridae, além de genes regulatórios que determinam o nível da expressão viral (tat e rev) e genes auxiliares (vif, vrp/vpx, vpu e nef), assim chamados por não serem necessários para a replicação viral in vitro (Narayan et al., 1997). O gene gag codifica proteínas do capsídeo, do nucleocapsídeo e da matriz. No interior do nucleocapsídeo encontra-se duas moléculas de RNA idênticas e não complementares, que contém a informação genética completa do vírus, associadas a proteínas básicas de pequeno peso molecular. Estão presentes também 10 a 50 cópias das enzimas transcriptase reversa e integrase indispensáveis para a síntese de DNA proviral e sua integração ao genoma da célula hospedeira, sendo estas codificadas pelo gene pol. O gene env codifica para as glicoproteínas do envelope (Tavares & Pereira, 1999). XIII

14 2.3-Vírus fitopatogênicos Vírus de vegetais como sistema de expressão de antígenos Os vírus fitopatogênicos, reconhecidos como não patogênicos para seres humanos e outros animais, têm despertado grandes interesses na ciência devido a possibilidade destes serem usados como veículos ou vetores para expressar fragmentos de proteínas antigênicas ou não na sua superfície, originando quimeras (Moffat, 1995; Scholthof & Scholthof, 1996; Modelska et al., 1998). O objetivo seria então, que esses vírus funcionassem como um sistema de apresentação de epítopos na fabricação de vacinas. Para tanto um gene que expressa o antígeno de interesse, é inserido no genoma do vírus vetor, o qual poderá infectar a planta uma vez que não perde a sua capacidade infectiva. Esses resultados abrem perspectivas para um tipo de aplicação dos vírus de vegetais em um domínio que vem sempre acenando para uma larga aplicação na medicina profilática, que é o uso de materiais biológicos inertes nos procedimentos de vacinação. No entanto, o uso de partículas de vírus de plantas para expressar peptídeos heterólogos requer meios que modifiquem geneticamente o genoma viral (Johnson et al., 1997). Além disso, para determinar se o vírus pode ser usado como vetor, deve-se observar: a sua capacidade de infectar os hospedeiros vegetais de forma eficiente, a natureza das infecções virais que ocorrem em curto espaço de tempo (uma a duas semanas após a inoculação), a facilidade com que muitos vírus são transmitidos mecanicamente, o vasto ciclo de plantas hospedeiras e a rapidez na obtenção dos resultados. XIV

15 O Tobacco Mosaic Virus (TMV) é um exemplo de vírus que vem sendo utilizados como sistema de apresentação de antígeno, mostrando-se eficiente quando utilizado para expressar uma enzima (Hamamoto et al., 1993), assim como o Tomato Bushy Stunt Virus (TBSV) que foi utilizado para expressar a glicoproteína 120 (gp120) do vírus da imunodeficiência humana, HIV-1 (Joelson et al., 1997), o Alstroemeria Mosaic Virus (ALMV) utilizado para expressar epítopos do vírus da raiva e do vírus HIV-1 (Yusibov et al., 1997) e o Vírus do Mosaico do Caupí (CPMV) tem sido o mais utilizado com o propósito de expressar genes estrangeiros em sua capa protéica, sendo expressa a VP1 do Foot-mouth Disease Virus, FMDV (Usha et al., 1993). O CPMV também já foi utilizado para expressar: a glicoproteína 41 do vírus da imunodeficiência humana (McLain et al., 1995, 1996), a proteína B da bactéria Staphylococcus aureus funcionando como um potente imunógeno através das via oral e nasal (Brennan et al., 1999a), a proteína F de Pseudomonas aeruginosa (Brennan et al., 1999b) Caracterização do CPSMV O CPSMV foi, por muito tempo, considerado uma raça do cowpea mosaic virus (CPMV), mas posteriormente foi reconhecido como um vírus distinto (Fulton & Scott, 1979; de Jager,1979). Os capsídeos do CPSMV, como os de todos os comovírus, apresentam virions não envelopados, exibindo morfologia isométrica com diâmetro entre 28 a 30 nm. Cada capsídeo é formado por 60 cópias de uma proteína longa (" Large", L) e uma cópia da proteína pequena ("Small", S) ((Murphy et al., 1995; Chen & XV

16 Bruening 1992), e essas proteínas têm massas moleculares aparentes de 42 kda e 23 kda, respectivamente, (Kitajima et al, 1997; Murphy et al., 1995). De acordo com MURPHY et al., (1995), a capa protéica dos comovírus, provavelmente apresenta proteínas glicosiladas. Assim como em todos os comovirus, o genoma do CPSMV possui dois segmentos de RNA de fita simples, com tamanhos de 5,8 kb (RNA1) e 3,6 kb (RNA2) (Murphy et al., 1995) os quais foram sequenciados por CHEN & BRUENING (1992) que mostraram ser a seqüência 5 -r UAUUAAAAUUUU, comum aos dois RNAs, o que está de acordo com o descrito na literatura para outros comovírus (Lomonossoff & Shanks, 1983; Van Wezenbeek et al.,1983;., Mac Farlane et al., 1991 e Chen & Bruening, 1992). Além disso, os RNAs 1 e 2 do CPSMV possuem 88% de identidade nos primeiros 150 nucleotídios e 66,5% de identidade em toda a sequência 5 não codificada. Ambos RNAs genômicos do CPSMV são necessários para que ocorra a infeção sistêmica na planta hospedeira. O RNA1 codifica funções necessárias à replicação, enquanto o RNA2 codifica as proteínas necessárias para o movimento do vírus, célula à célula e a longa distância (sistêmico), bem como codifica as proteínas do capsídeo (Goldbach et al., 1980; Willink & Van Kammen, 1989). XVI

17 3-HIPÓTESE - Considerando a alta imunogenicidade das proteínas do CPSMV e tendo conhecimento da baixa resposta imunológica em animais acometidos de CAE, fica estabelecida a hipótese que uma quimera formada a partir de partículas de CPSMV com a proteína capsular P28 seja mais imunogênica que a proteína P28 do CAEV sozinha. XVII

18 4-JUSTIFICATIVA Os processos de vacinação e os métodos de diagnósticos são ferramentas indispensáveis para prevenção da maioria das doenças que acometem os rebanhos animais. Atualmente a Biologia Molecular tem fornecido as soluções ideais para precisão e rapidez de muitos procedimentos de rotina. As leguminosas além da importância econômica, são facilmente infectadas pelo CPMV, e têm sido usadas em experiências para propagação de vírus quiméricos (Johnson et al, 1997). Os métodos profiláticos do controle de enfermidades domésticas devem ser preventivos, assim as doenças podem ser detectados precocemente através de diagnósticos adequados. Os controles das mesmas são possíveis de ser executados, através de vacinas, tratamento ou eliminação dos infectados do rebanho quando for o caso. Uma grande parte dos métodos de diagnóstico utiliza antígenos, os quais cada vez mais trabalhados por tecnologia de ponta, oferecem produtos mais eficazes. Buscando uma forma eficaz de elaboração de antígenos para produção de vacinas contra enfermidades de animais domésticos, pensou-se na produção de antígenos animais, que pudessem ser expressos em plantas infectadas com vírus. Devido as formas clínicas do CAE não serem curáveis e o emprego de medicamentos contribuírem apenas com a melhora clínica temporária, não existindo portanto medicamentos ou vacina que combatam a doença de forma eficaz (Franke, 1998), despertou nosso interesse para tentar produzir um vírus quimérico utilizando como vetor um vírus de planta. XVIII

19 5- OBJETIVOS 5.1-Geral- Produzir antígenos para diagnóstico e/ou vacinas de enfermidades animais, utilizando um vírus de vegetal como molécula carreadora. 5.2-Específico- Inserir covalentemente a proteína P28 do vírus da artrite encefalite caprina, no CPSMV. Purificar a quimera para uso como antígeno para testes de ELISA e Western blotting. Estudar a imunogenicidade da quimera CPSMV-P28 em animais. XIX

20 6-MATERIAIS E MÉTODOS 6.1-Produção da massa viral No presente trabalho foram utilizadas plantas de Vígna unguiculata (L.) Walp cultivar Pitiúba. As plantas foram cultivadas em vasos em casa de vegetação, a partir de sementes fornecidas pelo Banco de Sementes do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Ceará. 6.2-Animais Foram empregados camundongos swiss, fêmeas, com idade entre 6 e 10 semanas, mantidos em colônia fechada no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universiadade Federal do Ceará. Essa colônia teve início com animais fornecidos pelo Centro de Bioterismo da Unicamp (Campinas SP) para constituição das colônias do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará (UFC). Foram usados também ratos albinos, machos de 300 a 400g, mantidos nas mesmas condições. 6.3-Purificação do Vírus O vírus do mosaico severo do caupi (CPSMV) foi purificado de acordo com o método descrito por LIMA & AMARAL (1985) com algumas modificações. As plantas de V. unguiculata foram mecanicamente inoculadas com CPSMV, sete dias após o plantio e mantidas em casa de vegetação. Para a purificação, o tecido foliar foi coletado duas semanas após a inoculação do vírus e macerado em tampão de extração (fosfato de potássio 0,1 M, ph 7,5, contendo 0,5% do anti-oxidante sulfito de sódio), na proporção de 1:2 (p/v). Após a maceração, o material foi filtrado em uma gaze dupla para XX

21 eliminação dos fragmentos maiores da planta. O extrato obtido foi submetido a uma clarificação com 8% de n-butanol por uma noite à 4 C, sob leve agitação. Na manhã seguinte a mistura foi centrifugada em uma centrífuga SORVAL, ROTOR GSA a g por 10 min. O precipitado foi descartado e ao sobrenadante adicionou-se 6% de polietileno glicol (PEG PM 6000) e 4% de NaCl, com o objetivo de precipitar o vírus. Essa mistura foi submetida a uma leve agitação por 1 h à 4 C e após foi centrifugada a g por 10 min. uma centrífuga Sorval com ROTOR GSA. A seguir o precipitado foi ressuspenso em tampão fosfato 0,01M e ph 7,5. A suspensão foi levemente agitada por 40 min. submetida a uma centrifugação de g por 10 min. no ROTOR SS-34 da centrífuga SORVAL. O precipitado foi descartado e o sobrenadante contendo o vírus foi submetido a mais três ciclos de precipitação com PEG, como foi descrito anteriormente. Após as etapas de precipitação com PEG, o sobrenadante final contendo o vírus foi submetido a uma ultracentrifugação de g durante duas h. O precipitado final contendo o vírus foi ressuspenso em 2 ml de tampão Tris-HCl 0,02 M, ph 8,2. A resuspensão obtida foi dividida em alíquotas de 0,5 ml e acondicionada à temperatura de 4 C, até o momento de ser usado. 6.4-Dosagem de proteínas A dosagem de proteína da suspensão viral foi determinada pelo método de Bradford (1976). A concentração de proteínas do capsídeo viral foi estimada com relação a uma curva padrão obtida com albumina sérica bovina. XXI

22 6.5-Produção da quimera O CPSMV foi covalentemente acoplado com a proteína P28 do capsídeo do vírus da artrite encefalite caprina de acordo com a metodologia empregada por McKenzie et al. (1984). Foram incubados 200 µl de P28; 10 µl de glutaraldeído 25% e 200 µl de tampão fosfato 0,1 M, ph 6,8, que permaneceram toda a noite em temperatura ambiente (25 C) e na ausência de luz. No dia seguinte, a mistura foi aplicada a uma coluna de biogel dextrana blue calibre p-100, arquitetada em uma pipeta de 10 ml e equilibrada com tampão PBS (0,01 M fosfato de sódio; 0,1 M NaCl, ph 7,3). A eluição das frações foi realizada com PBS e visualizada por espectrofotômetro a 280nm. A fração contendo o maior pico, abrigava a P28 ligada covalentemente ao glutaraldeído. Uma amostra de 200 µl de solução de CPSMV previamente aquecida a 100 C por 60 segundos contendo 2 J de proteína viral foi diluída em 1 ml de PBS e 200 µl de tampão carbonato 1 M, ph 9,5 e em seguida adicionada à P28 covalentemente ligada ao glutaraldeído. A mistura foi encubada por 24 horas a 4 C e aplicada em uma coluna de Sephadex Dextran Blue G- 150, arquitetada em seringa de 5 ml e equilibrada com PBS. A quimera (CPSMV-P28) foi eluída em um só pico. 6.6-Eletroforese desnaturante (SDS-PAGE) As proteínas dos capsídeo virais, a P28 e a quimera foram analisadas em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) de acordo com o método descrito por LAEMMLI (1970), adapatado para uso de placas de vidro (10X7,2 mm). O stacking gel de concentração 4% foi preparado com 1,5 ml de água destilada; 0,315 ml de Tris- HCl 1 M, ph 6,8; 25µL de SDS 10% (p/v); 0,630 µl de acrilamida (30%); 15 µl de XXII

23 Tetramethilenodiamine (Temed) e 40 µl de persulfato de amônia (APS) 10% (p/v). O gel de separação a 12% foi composto de 1,655 ml de água destilada; 1,25 ml de Tris-HCl 1,5 M, ph 8,8; 50µL de SDS 10% (p/v); 2 ml de acrilamida (30%); 15 µl de Temed e 40 µl de APS 10% (p/v). A eletroforese transcorreu à temperatura ambiente (25 C) em tampão Tris-glicina ph 8,0 (glicina 250 mm; Tris-base 25 mm; SDS 0,1% (p/v)), a 150 volts e 30 ma (constante), até que o azul bromofenol ficasse aproximadamente 2 cm do final do gel separador. Para visualização das bandas foi utilizado o seguinte método: o gel foi corado, por imersão, solução contendo 0,25% de comassie Brilhant Blue R-250 (SIGMA); 40% de metanol; 10% de ácido acético e água destilada durante 30 min. O descorante do gel foi realizado com uma solução contendo 7% de ácido acético; 30% de metanol e água destilada. 6.7-Preparação das amostras As amostras de CPSMV foram preparadas de 80 µl de suspensão de vírus purificado, as quais foram adicionados em eppendorf contendo 20 µl de tampão da amostra (Tris-HCl 0,5 M; ph 6,8; SDS 10%(p/v); glicerol 20% (v/v); β-mercaptoetanol 4% (v/v) e azul de Bromofenol 2% (p/v)), seguindo aquecimento a 100 C durante 2 min. XXIII

24 As amostras da P28 foram preparadas utilizando 10 µl da proteína, as quais foram adicionados em eppendorf contendo 90 µl de tampão da amostra. As amostras da quimera foram preparadas de 80 µl do pool dos picos que continham a quimera, as quais foram adicionados em eppendorf contendo 20 µl de tampão da amostra. 6.8-Imunização subcutânea Três grupos de dez camundongos swiss fêmeas com 7 a 8 semanas de idade foram imunizados por via subcutânea, na região dorsal, com 10µg de proteína do vírus CPSMV, 10µg da proteína P28 do CAEV e 10µg da quimera (CPSMV + P28), utilizando o adjuvante de Freund incompleto, respectivamente. Os animais receberam reforços 21 e 35 dias após o início da imunização. 6.9-Obtenção dos anti-soros. As amostras de sangue foram coletadas com pipeta de Pasteur no plexo retro-orbital dos camundongos, nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após o início da imunização. O pool de sangue foi deixado em repouso durante 1 hora em temperatura ambiente para retenção do coágulo. Após a retenção o soro foi colhido e centrifugado a 3000 g por 10 min. para que o tornasse livre de hemácias. Em seguida o anti-soro obtido foi armazenado a 20 ºC. XXIV

25 7.0-SOROLOGIA. 7.1-Elisa Os antissoros específicos para o CPSMV, P28 e Quimera foram submetidos a teste de ELISA indireto (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Para esse ensaio, as placas foram sensibilizadas com cada antígeno (0,5µg/orifício). Os antígenos foram diluídos em tampão de carbonato de sódio 50 mm, ph 9,6, sendo usado 100 µl em cada poço. As placas foram incubadas a uma temperatura de 37 C por 2 h. Em seguida, as placas foram lavadas com PBS (NaCl, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4. 12H 2 O e KCl)/Tween (0,05 %) e bloqueadas por 2 h a uma temperatura de 37 C com PBS- com leite desnatado (10 mm, ph 7,2, contendo 5% de molico). Após a lavagem das placas, foram adicionados os anticorpos diluídos (1:40) em PBS e incubadas a uma temperatura de 37 C por 2 h. As placas foram novamente lavadas e em cada uma adicionado o conjugado imunoglobulinas anti-mouse ligadas à peroxidase, em uma diluição de 1 : 1.000, por 2 h a uma temperatura de 37 C. Após lavagem das placas com PBS-Tween, a reação foi desenvolvida pela a adição de orthophenylenediamine (OPD) a uma temperatura de 37 C. A reação foi interrompida com a adição de 20 µl de H 2 SO 4 2,5 N e a intensidade da reação foi avaliada espectrofotometricamente em um comprimento de onda de 492 nm com um micro Elisa Labystems Multiskam MS. XXV

26 7.2-Western Blotting Para a realização do teste de western blotting foram utilizadas proteínas do CPSMV, P28 e Quimera. As proteínas foram submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrilamida a 4-12% (SDS-PAGE), como descrito anteriormente e depois transferida para uma membrana de nitrocelulose. Em seguida, a membrana foi incubada com uma solução tampão de PBS com 5 % de leite desnatado, a 4 C, por aproximadamente 18 h, para bloqueio dos sítios ativos livres da membrana. Após a incubação, as membranas foram lavadas quatro vezes por 15 min. com solução tampão PBS-Molico (5 %), sob leve agitação. As membranas lavadas foram imersas em tampão PBS contendo ou anticorpos específicos para o CPSMV ou anticorpos específicos para P28 ambos numa diluição de 1:500 e incubadas por 2h. Em seguida as membranas foram submetidas a quatro lavagens de 15 minutos em PBS e transferidas para uma placa de petri contendo o 2 anticorpo anti-igg de camundongo ligado à peroxidase na diluição de 1:5000 por duas horas sob leve agitação em temperatura ambiente. As membranas foram novamente submetidas a quatro lavagens de 15 minutos em PBS e foram colocadas em uma solução reveladora, com substrato para peroxidase, composta de diaminabenzidina (DAB) 0,1 g/ml e Cloreto de Níquel (NiCl 2 ) 0,4 g/ml em tampão Tris- HCl 100 mm ph 7,2, sendo adicionado 12,5 µl de Peróxido de Hidrogênio (H 2 O 2 ) 30V, sendo mantidas no escuro à temperatura ambiente por aproximadamente 10 min., quando então a reação foi interrompida com a lavagem da membrana com água destilada. As membranas foram secas, envolvidas em filme de PVC e posteriormente fotografadas. XXVI

27 8-RESULTADOS Após ativação da P28 com glutaraldeído foi realizada uma cromatografia de bio-gel como mostra a FIGURA 1. Somente o primeiro pico (pico I) foi utilizado para a posterior conjugação com o CPSMV. Portanto, o pico I foi misturado ao CPSMV e deixado por uma noite de repouso. Em seguida, a mistura foi submetida a uma cromatografia em coluna de Sephadex G-150 revelando a presença de 2 picos, sendo que as proteínas acopladas covalentemente foram eluídas no primeiro pico, como mostra a FIGURA 2. O perfil eletroforético em SDS-PAGE de alíquotas do primeiro pico revelou a migração proteíca de uma fração com massa molecular estimadas em 116 kda (FIGURA 3). A FIGURA 4 mostra a cinética da síntese de anticorpos policlonais, induzida em camundongov LPXQL]DGRV FRP J GH SURWHínas da quimera utilizando adjuvante de Freund incompleto. Podem ser observadas as respostas primárias e secundárias específicas dos anticorpos reativos com o CPSMV, com a P28 e com a quimera. O teste de Western blotting comprova a existência da quimera através de seu reconhecimento por anticorpos específicos para o CPSMV e para a P28 (FIGURA 5) XXVII

28 3*OX%LRJHO DEVRUE QFLD WXER )LJ &URPDWRJUDILD GH / GD DPRVWUD GH 3 H JOXWDOGHído, em coluna de Biogel- P100, equilibrada com PBS. Volume total da coluna foi de 10 ml e o volume das frações coletadas foi de 1 ml. XXVIII

29 Quimera 01/09/03 abs 280 nm 2,5 2 1,5 1 0,5 0 abs 280nm tubos FIGURA 2: Filtração em gel da preparação do conjugado CPSMV+P28. Uma coluna de 10 ml foi preparada usando Sephadex G-150, equilibrada com PBS. A amostra aplicada para ser eluída foi de 4 ml As amostras coletadas foram de aproximadamente 1 ml para cada tubo. XXIX

30 Figura 3- Perfil eletroforético em SDS-PAGE das amostras. No poço 1-quimera purificada (10 µl), poço 2 -quimera purificada (5 µl), poço 3- quimera não purificada (10 µl), poço 4 CPSMV (3 µl), poço 5- P28 (3 µl),. Os poços 6, 7, 8, 9 e 10 são repetições.das mesmas seqüências. XXX

31 Elisa ABS 492 nm 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 CPSMV P-28 Q pré-imune Dias após a imunização FIGURA 4: Teste de Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) com antissoro SROLFORQDO GH FDPXQGRQJRV LPXQL]DGRV FRP J GH 4XLPHUD &36093 FRP adjuvante de Freund incompleto, na diluição de 1:40, mostrando reações específicas contra o CPSMV (v), P28 ( v ) e Quimera (v ). XXXI

32 A A B A Figura 5-Westhern blotting mostrando que a Quimera (CPSMV+P28) é reconhecida por anticorpos específicos contra o CPSMV (A)-No poços 1 (amostra 5 e 6), poço 2 (amostra 4) e poço 3 (quimera bruta). No poço 4 CPSMV e poço 5 P28. Em (B) anticorpos específicos contra a P28 detectados: poço 1 (amostra 5 e 6), poço 2 (amostra 4) e 3 (quimera bruta), poço 4 CPSMV e poço 5 P28. XXXII

33 9-DISCUSSÃO Os resultados do presente estudo mostraram que o CPSMV pode funcionar como uma efetiva molécula carreadora. Isto porque foi capaz de formar uma quimera estável com a proteína P28 do CAEV, através de ligações covalentes com o glutaraldeído. Vários estudos têm mostrado que o glutaraldeído, por possuir grupos carbonílicos expostos em suas extremidades pode funcionar como ligante entre duas proteínas com aminoácidos que possuem grupos aminos- NH 2 expostos McKENZIE et al. (1984); HAJIMORAD & FRANKI, (1991); HAMAJINA et al., (1995); CUMMINGS et al. (1991). A seqüência de aminoácidos do CPSMV CHEN & BRUENING, (1992) e da proteína P28 do CAEV SALTARELLI et al. (1990) mostra que ambas possuem várias lysinas e argininas, que são aminoácidos que apresentam o grupo NH 2 em suas extremidades, facilitando a formação das ligações covalentes com grupo carbonílico do glutaraldeído. A estabilidade da fração covalentemente ligada (CPSMV+P28) eluída em cromatografia (Figuras 1 e 2) foi mostrada em eletroforese em gel de acrilamida SDS- PAGE onde foi detectada uma molécula protéica de aproximadamente 116 KDa (Linhas 1 e 2 da Figura 3), comprovando a ocorrência da ligação das proteínas, uma vez que o CPSMV apresenta três polipeptídios de pesos do moleculares correspondentes a 44, 21 e 14 KDa (Linha 4 da Figura.3 A) e o peso molecular da P28 é de aproximadamente 57 KDa (Linha 5 e 11 da Figura-3B). A linha 3 da figura 3 mostra duas bandas protéicas uma de 116 KDa e outra de aproximadamente 55 KDa, correspondente a mistura (P28 + glutaraldeído + CPSMV) antes de purificação em cromatografia. A imunização de camundongos com a quimera (CPSMV+P28), através da via subcutânea, com adjuvante de Freund incompleto mostrou que a mesma induziu uma XXXIII

34 resposta imunológica humoral com síntese de anticorpos específicos reativos tanto com CPSMV como com a P28, em teste de ELISA (Figura 4). No entanto, os títulos mais elevados são observados quando a placa é sensibilizada com a própria quimera. Isto sugere que o acoplamento covalente da P28 ao CPSMV potencializa a resposta imunológica. Também foi mostrado por meio de Western blotting que os anticorpos específicos para o CPSMV e para a P28, reconheceram especificamente a quimera (Figura-5). Isto prova que a banda protéica de 116 KDa é a quimera formada entre o CPSMV e a P28. O aumento da imunogenicidade da P28 sugere que este procedimento pode ser importante para a possibilitar a produção de uma vacina para o vírus CAEV, assim desenvolver métodos de diagnósticos efetivos. A alta imunogenicidade do CPSMV através das vias subcutâneas e oral foi mostrada por FLORINDO (1999) e FLORINDO et al. (2002), sugerindo que o mesmo pode ser usado como vetor de expressão de peptídeos ou como molécula carreadora na produção de vacinas, uma vez que o mesmo induz a produção de IgA e de IgG e não induz a produção de IgE. Muitas investigações têm mostrado o interesse do uso de proteínas conjugadas para estimular a imunogenicidade de vírus e de bactérias McKENZIE, (1984). HAJIMORAD & FRANCKI (1991) mostraram que a imunogenicidade de alguns vírus de planta é elevada pela estabilidade de seus capsídeos com formaldeído e glutaraldeído. A imunogenicidade de algumas proteínas podem ser aumentada quando acoplada em uma molécula carreadora (ZHANG et al., 1996 e TRIOZZI et al., 1994). XXXIV

35 10-CONCLUSÕES A ligação covalente entre o CPSMV e a P28 foi eficaz na formação de ume quimera imunogência. A mesma foi capaz de imunizar camundongos contra a P28 sendo confirmado através de testes de ELISA e Western blot. Há possibilidade de uso como antígenos para diagnósticos e vacinas. XXXV

36 11-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÀFICAS ADAMS, D.S.; KLEVJER; ANDERSON, P.; CARLSON, J.L.; McGUIRE, T.C.; GORHAM,.R. Transmission and control of caprine arthritis encephalitis virus. American Journal of veterinary Researsh, v. 44, n. 9, p , 1983 ASSIS, A.P.M.V.; GOUVEIA, A.M.G. Evidência sorológica de lentivírus (Maedi Visna/CAE) em rebanhos nos Estados de MG, RJ, BA e CE. In: ENCONTRO DE PESQUISA DA ESCOLA VETERINÁRIA DA UFMG, 1994, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte, p. 46, 1994 BRADFORD, M. M. Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal. Biochem. v. 72, p , 1976 BERGER, N., et al. Characterization of chimeric enzymes between caprine arthritis virus, maedi-visna virus and human immunodeficiency virus type 1 integrases expressed in Escherichia coli. Journal of General Virology. v. 82, p , BRENNAN, F.R.; BELLABY, T.; HELLIWELL, S.M.; JONES, T.D.; KAMSTRUP, S.; DALSGAARD, K.; FLOCK, J.I.; HAMILTON, W.D. Chimeric plant virus particles XXXVI

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42 NARAYAN,O.; JOAG, S.V.; CHEBLOUNE, Y.; ZINK, M.C.; CLEMENTS, J.E. Viral Pathogenesis. Ed Neal Nathansan, Raven Publisher. Philadelphia, p , 1997 NORMAN, S. & SMITH, M.C. Caprine arthritis encephalitis: review of the neurologic form in 30 cases. Journal of American Veterinary Medicine Association, v.182, p , 1983 NORMAN, S.; SMITH, M.C. Caprine arthritis encephalitis: review of the neurologic form in 30 cases. Journal of American Veterinary Medicine Association, v.182, p , 1983 PINHEIRO, R.R.; EGITO,A.S.; SANTA ROSA, J. et al. Artrite-Encefalite Caprina Viral (CAEV). Com. Tec. EMBRAPA-CNPC, n. 19, p. 1-5, 1989 ROWE, J.D.; EAST, N.E.; THURMOND, M.C.; FRANTI, C.E.; PEDERSEN, N.C. Cohort study of nature transmission and two methods for control of caprine cathritis encephalitis virus infection in goats on a California dairy. American Journal of veterinary Researsh, v. 53, n. 12, p , 1992 SALTARELLI, M., et al... Nucleotide Sequence and Transcriptional Analysis of Molecular Clones of CAEV Which Generate Infectious Virus. Viroly, v. 179, p SCHOLTHOF, H.B.; SCHOLTHOF, B.G.; JACKSON, A.O. Plant virus vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annu. Ver. Phytopathol, v. 34, p , 1996 XLII

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44 ZHANG, S, et al. Augmenting the immunogenicity of synthetic MCUI peptide vaccines in mice. Cancer Res. v. 56. P XLIV

45 Utilização do CPSMV como uma efetiva molécula carreadora para a P28 do CAEV e aumento da sua imunogenicidade. The use of CPSMV as an effective carrier molecule to CAEV P28 and increase of its immunogenicity. Francisco Jarbas Santos de Sousa 1; Marcelo Róseo de Oliveira 2; Ney de Carvalho Almeida 1; Marlos Gomes Martins 3. Maria Erivalda Farias de Aragão 4 ; Maria Fátima da Silva Teixeira 4; Maria Izabel Florindo Guedes 4. Resumo O vírus da Artrite-encefalite caprina (CAEV) pertence à família Retroviridae, gênero lentivirus. Este vírus infecta caprinos do mundo inteiro causando artrite, encefalite, mamite, emagrecimento progressivo. Ainda não existe tratamento e nem vacina para esta enfermidade, sendo o controle realizado pelo diagnóstico, o mais precoce possível. Alguns vírus de vegetais vêm sendo utilizados para expressar e/ou carrear peptídeos de patógenos humanos e de animais, formando quimeras que são utilizadas como antígenos. O objetivo deste trabalho foi inserir a proteína P28 do CAEV no capsídeo do Vírus do Mosaico Severo do Caupí (CPSMV) através de ligação covalente com glutaraldeído, e estudar a eficácia do mesmo como molécula carreadora. A quimera foi construída através da mistura de glutaraldeído, CPSMV e P28 do CAEV e purificada por meio de cromatografia em biogel e sephadex. G-50. Em seguida foram realizadas leituras em espectrofotômetro no comprimento de onda de 280nm Os picos contendo a quimera foram coletados e submetidos à eletroforese, sendo evidenciado a banda correspondente à mesma. Grupos de 1-Mestrando de Ciências veterinárias UECE 2- Estudante de Graduação- Ciências Biológicas UECE 3- Bacharel em Ciências Biológicas UECE 4- Professor Doutor Universidade Estadual do Ceará Correspondência: Maria Izabel Florindo Guedes. Endereço: Rua Bernado de Figueiredo 2588 Ap.102; CEP: ; florin@daterranet.com.br XLV

46 camundongos foram imunizados com o vírus quimérico, CPSMV e com a proteína P28 utilizando adjuvante de Freund incompleto. Os anticorpos específicos para o CPSMV e P28 reconheceram a proteína quimérica em Western Blotting e ELISA demonstrando eficácia do método. Os resultados demonstraram que o acoplamente covalente entre o CPSMV e a P28 do CAEV foi construída com sucesso, originando uma molécula estável. Ademais demonstrou que o vírus quimérico apresenta maior imunogenicidade do que a proteína P28 sozinha. Desta forma pode se sugerir que o CPSMV pode ser utilizado como molécula carreadora na produção de vacinas para vírus que infectam animais. Palavras-chave: CPSMV; P28; CAEV; Quimeras; Ligação covalente. XLVI

47 ABSTRACT Caprine arthritis-encephalits virus (CAEV) belongs to retroviridae family, lentvirus genus. This virus attacks caprine all over the world causing such arthritis,encephalits, mamitis and progressive fading. There is any known treatment or vaccine yet for this disease, and its control is under the most possible precocius diagnostic. Some plant virus have been used to express and/or carrie human patogenic peptides and in other animals, developing chimeric wich are used as antigens. The purpose of this study was to insert P28 protein CAEV in capsid of Caupi Severe Mosaic Virus (CPSMV) trhough the covalent bind with glutaraldehyde and research its efficacy as a carrier molecule. The chimera was developed from the mix of glutaraldehyde, CPSMV and CAEV P28, and purified through the chromotography in biogel and sephadex. After that, it was developed some measures in a spectrophometric to absorbence at 280nm. Peaks which countainned chimera were collected and submited to SDS-PAGE, evidencing the band relative to itself. Groups of swiss mice were immunized with chimerc virus, CPSMV with P28 protein using incomplete Freund Adjuvant.CPSMV-specific antibodies and P28 recognized chimeric protein in Western Blotting and ELISA showing efficacy of the method.the results showed the coupling covalent between CPSMV and CAEV P28 was sucessfully build, originating a stable molecule. Besides it showed that chimeric virus presents more immunogenicity than protein P28 isolated. So, we may suggest CPSMV can be used as a carrier molecule in the production of vaccines to the virus wich infect animals. Key words: CPSMV; P28; CAEV; Chimeric; Covalent bind. XLVII