Avaliação de uma fração proteica de 38 a 40 kda isolada de Acinetobacter baumannii como alvo para imunoterapia

Transcrição

1 Avaliação de uma fração proteica de 38 a 40 kda isolada de Acinetobacter baumannii como alvo para imunoterapia Lucas Machado, Programa de Biofármacos, Bio manguinhos

2 Introdução Patógenos ESCAPE (ESKAPE) Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Clostridium difficile, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter spp., incluindo também Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae OLEKSIEWIKZ, NAGY e NAGY, 2012

3 Introdução Acinetobacter baumannii Cocobacilo Gram negativo Catalase positivo Aeróbio obrigatório Oxidase negativo (PEREZ et al. 1996)

4 Introdução Bacteremia Pneumonia Meningite Acinetobacter baumannii Imagem: MCConnell et al Infecção urinária Infecção de ferimentos

5 Introdução Cepas resistentes Acinetobacter baumannii Imagem: MCConnell et al Bombas de efluxo, β lactamases, carbapenemases.

6 Introdução Isolados resistentes ao imipenem Secreções respiratórias (57%) Ferimentos (19%) Sangue (4%) Urina (3%) LEE et al Bile (3%)

7 Introdução Resistência aos carbapenens >50% 35 50% 25 35% 15 25% 10 15% 0 10% Adaptado de PEREZ et al Dados indisponíveis

8 Introdução Seria a imunoterapia passiva uma alternativa interessante?

9 Introdução Seria a imunoterapia passiva uma alternativa interessante? Anticorpos monoclonais

10 Introdução Haveria um alvo interessante em Acinetobacter baumannii para o desenvolvimento de uma imunoterapia passiva?

11 Introdução Haveria um alvo interessante em Acinetobacter baumannii para o desenvolvimento de uma imunoterapia passiva? Estudo de prédesenvolvimento

12 Justificativa BONIN, 2011

13 Justificativa MCCONNELL et al., 2011

14 Objetivos Objetivos Gerais Obter uma fração proteica de A. baumannii para realizar imunizações em modelo murino, avaliar o título de anticorpos obtidos a partir da resposta imune e o potencial desses anticorpos em neutralizar o crescimento bacteriano. Objetivos Específicos Realizar a extração da fração protéica (38 40 kda) Imunizar camundongos para avaliação da resposta imune Avaliar os títulos de anticorpos por imunoensaio enzimático (ELISA) Realizar ensaio de neutralização in vitro. Otimizar o modelo murino de infecção.

15 Materiais e métodos Extração Acinetobacter baumannii ATCC Caldo de Luria Bertani (LB) com Ampicilina 37 C 120 rpm, 16 18h Centrifugação 4000rpm 4 C pellets

16 Materiais e métodos Extração Pellet SDS PAGE Recorte da banda de 38 40kDa Eletroeluição Quantificação

17 Materiais e métodos Imunização BALB/C Imunizados 25µg da fração extraída + Hidróxido de Alumínio Controle Hidróxido de alumínio + PBS Volume final de 100µL Via intramuscular

18 Materiais e métodos Imunização Imunização dos animais priming (n=4) Booster Obtenção do soro imune Dia 1 Dia 2 Dia 13 Dia 14 Dia 24 Obtenção do soro préimune Obtenção do soro imune

19 Materiais e métodos ELISA Soros obtidos Avaliação dos Soro: 1:1600 títulos de IgG Soro: 1:200 Placa sensibilizada com a fração protéica Placa sensibilizada com A. baumannii

20 Materiais e métodos Neutralização Soros hiperimunes e soros controle (450μL) Banho maria 56 C por 30 minutos Agitação Inóculo bacteriano (aproximadamente 1x10 5 UFC) Quantificação em placas de LB+ampicilina, após 1, 2 e 3 horas Nome palestrante, Instituição

21 Materiais e métodos Modelo Murino Cultura do isolado clínico 944F de A. baumannii em LB+Ampicilina 120rpm, 37 C, por 16 18h. Quantificação em placas Centrifugação e lavagem em PBS estéril Estocagem das doses a 70 C

22 Materiais e métodos Modelo Murino Cargas crescentes de A. baumannii + Mucina (DL/DL 50) Balb/C Grupos de C57BL/6

23 Resultados Extração Raia 1: PadrãodepesomolecularBenchMarkProtein Ladder ( ). ~40 kda Raia 2: Pellet de A. baumannii. Raia 3: Banda recortada, após a eletroeluição.

24 Resultados ELISA *p<0,05 vs. Controle. **p<0,01 vs. Controle. Teste t de Student não pareado.

25 Resultados ELISA * * *p<0,05 vs. Controle, Teste t de Student não pareado.

26 Resultados Neutralização Tempo Redução 1 hora 71,5% 2 horas 77% 3 horas 24,5%

27 Resultados Modelo Murino C57BL/6 Experimentos preliminares indicam que as doses a partir de 5x10 4 UFC com o uso da mucina são letais.

28 Resultados Discussão Foi possível demonstrar que os anticorpos gerados contra as proteínas contidas na fração proteica também reconhecem a superfície bacteriana Foi observado que os anticorpos gerados possuem capacidade de neutralizar o crescimento bacteriano É necessária a realização de experimentos com a utilização de doses abaixo de 5x10 4 UFC em C57BL/6 para buscar definir a DL e a DL50 Estão sendo realizados em paralelo, estudos para a produção da proteína de interesse em plataforma recombinante

29 Obrigado!