VII TÉCNICA DE DIAGNOSTICO MOLECULAR (DNA) PARA MICRORGANISMOS EMERGENTES EM ÁGUAS FLUVIAIS E USO NO MONITORAMENTO NO MUNICÍPIO DE GOIÂNIA- GO.

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1 VII TÉCNICA DE DIAGNOSTICO MOLECULAR (DNA) PARA MICRORGANISMOS EMERGENTES EM ÁGUAS FLUVIAIS E USO NO MONITORAMENTO NO MUNICÍPIO DE GOIÂNIA- GO. Carlos Alberto Soares Santana Júnior (1) Biomédico pela Universidade Federal de Goiás. Mestrando em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal de Goiás (ICB/UFG). Carlos Eduardo Anunciação Doutor em Biologia Molecular, professor Adjunto da Universidade Federal de Goiás. Cristiane Martins Alves da Silva Engenheira de Alimentos pela Universidade Católica de Goiás. Adriana Souza Ribeiro Graduanda em Farmácia e Bioquímica pela SOES/IUESO Faculdades Objetivo. Wilma Maria Coelho Bióloga pela Universidade Católica de Goiás. Mestre em Parasitologia pela Universidade Federal de Goiás. Endereço (1) : Rua Goiazes Q- 01 Lt. 25 Conjunto Anhanguera CEP: RESUMO Microrganismos dotados de potencial patogênico chegam aos ambientes aquáticos através das excreções do homem e de outros animais. Por isso, testes que determinam a qualidade da água foram desenvolvidos para indicar microrganismos que são encontrados normalmente nas fezes (coliformes).usualmente, através da presença destes microrganismos, estima-se a presença de outros patógenos em água, algo que deixa a desejar pelo fato de não analisar de forma real a presença de patógenos de importância clinica elevada, como é o caso das bactérias: Helicobacter pylori (gastrite, câncer gástrico) e Campylobacter coli e C. jejuni (diarréias, Síndromes de Miller Fisher e Guillain-Barre ). Desta forma técnicas moleculares como a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foram aplicadas para detecção e monitoramento dos referidos patógenos emergentes, obtendo resultados rápidos e precisos, sendo apresentado como uma alternativa aos métodos convencionais. PALAVRAS-CHAVE: Helicobacter pylori, Campylobacter coli; Campylobacter jejuni, diagnostico molecular, PCR, água, monitoramento ambiental. INTRODUÇÃO São insuficientes no país os estudos sobre os níveis de trofia e seus reflexos sobre a qualidade da água fluvial, com ou em tratamento e em represamentos. Um clima quente como o predominante na região centro-oeste, acelera o metabolismo de produção e de decomposição de matéria orgânica e, são ainda, escassos os estudos sobre a dinâmica microbiana em climas tropicais e subtropicais. Determinado volume de massas d água apresentam muitas características físicas e químicas de importância preponderante na ecologia dos organismos aquáticos, bem como para a sua utilização para abastecimento público. Muitas dessas características são devidas, exclusivamente, à sua estrutura molecular e outras, entretanto decorrem da sua exposição aos elementos físicos do meio ou à existência de substâncias químicas e orgânicas em solução, também provenientes da decomposição ou das variações do ambiente aquático. Sabe-se que os microrganismos dotados de potencial patogênico chegam aos ambientes aquáticos através das excreções intestinais do Homem e de outros animais, atuando como dispersores, podendo encontrar condições de sua multiplicação nestes ambientes. Dentre os vários microrganismos inclusos, destacam-se os considerados emergentes, oportunistas, como Helicobacter pylori, associados ao desenvolvimento de gastrites e câncer gástrico e, Campylobacter coli e C. jejuni relacionados a diarréias, Síndromes de Miller Fisher e Guillain-Barre. Apesar de patogênicos, pouco se sabe ainda sobre os mecanismos dispersores e a forma de contágio destes organismos na natureza, sendo encontrados relatos de sua persistência aos sistemas de tratamento com cloração. Os sistemas atuais de monitoramento de águas tratadas se baseiam na freqüência de coliformes fecais e de Escherichia coli como indicadoras de poluição, mas são ineficazes para diagnostico de ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 1

2 microrganismos não culturáveis ou fastidiosos como os descritos acima. Assim, torna-se urgente o desenvolvimento de metodologias alternativas para o diagnostico e monitoramento destes organismos em massas de água, para propor medidas saneadoras que posam contribuir para a redução da incidência de doenças oportunistas. No Estado de Goiás, pelas características climáticas e hídricas do cerrado e de sua forte vocação econômica na agropecuária, representa um potencial risco dispersor de doenças emergentes provocadas pelos microrganismos. O Rio Meia Ponte, que banha 35 municípios e 45% da população do Estado, recebe os esgotos da capital tratados pela ETE, das cidades vizinhas e dos pólos industriais sediados na região. O Ribeirão João Leite, importante manancial de água potável e lazer do município de Goiânia, é tributário do Rio Meia Ponte e recebe os esgotos sem tratamento dos município de Anápolis, cidades vizinhas, pocilgas, além do Pólo Farmoquímico de Anápolis-DAIA. No município de Goiânia, as águas eutrofizadas dos 3 lagos internos, Areião, Vaca Brava e Bosque dos Buritis, que são utilizadas para lazer, não possuem monitoramento da presença de microrganismos emergentes, constituindo também um risco para a população. O objetivo deste trabalho é padronizar um método de diagnóstico rápido, sensível e passível de uso em águas fluviais, para detectar e monitorar a presença de microrganismos fastidiosos e emergentes no Município de Goiânia. MATERIAIS E MÉTODOS 1-Coleta das Amostras Amostras de água foram coletadas em frascos estéreis contendo como conservante 0,1% SDS e 1mM Na2EDTA ph 8,0, no período matutino, até no Maximo às 9:00 horas. As coletas foram realizadas mensalmente durante os meses de junho, julho, agosto, setembro, outubro, novembro, janeiro e fevereiro nos rios, Meia Ponte e João Leite, nos Lagos Vaca Brava, Areião e Bosque dos Buritis. No Rio Meia Ponte as coletas foram feitas antes e depois da Estação de Tratamento de Esgotos-ETE e, no Ribeirão João Leite, a 150 metros da juzante, próximo à captação de água da Estação de Tratamento Jaime Câmara. As amostras foram encaminhadas para o Laboratório de Diagnóstico Genético e Molecular/ICB/UFG (LDGM) para o estudo molecular no prazo máximo de 60 minutos e, simultaneamente, para o P-SLE (Produção Supervisão do Laboratório de esgoto) e P-SLA (Produção Supervisão do Laboratório de água) da SANEAGO para analise dos aspectos físico-químicos e os testes bacteriológicos. 2 - Analise Laboratorial As amostras encaminhadas a SANEAGO foram analisadas segundo parâmetros determinados pela Resolução CONAMA Nº 20, de 18 de junho de Seguindo esta resolução foram realizadas as contagens de bactérias heterotróficas, o número de Coliformes totais e fecais (termotolerantes), Escherichia coli e Enterococcus. A metodologia utilizada para determinação destes parâmetros de referencia foram feitas de acordo com o Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, Análise Molecular Concentração da amostra. Para reter as partículas maiores, foi feita uma clarificação da amostra da água coletada (1000ml) pelo processo de filtração a vácuo. Em seguida, a água foi submetida a uma nova filtração utilizando filtro de nitrocelulose, com o objetivo de reter bactérias e DNA livre. O material aderido à membrana foi eluído com 2,5ul de tampão TE (ph 8,0) e alicotado para as análises moleculares, sendo conservado a -20 o C até o momento de seu processamento (Bej, et al.,1991, Lee, et al., 2002). Procedendo-se então a extração do DNA Extração de DNA. Para a extração de DNA, o material eluído foi transferido para um tubo contendo 2ml de clorofane, misturado por inversão e centrifugado a 6000 rpm por 10 minutos. Após este procedimento, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e re-extraído com 2 ml de clorofil, nas mesmas condições. A fase aquosa contendo o DNA foi então removida para outro tubo ao qual foi acrescentado 1/10 do volume resultante de NaCl 4M, juntamente com 1 volume de isopropanol. A solução foi misturado por inversão e centrifugado a 10000rpm por 15 minutos a 4oC, obtendo-se então o pellet de DNA. Este pellet foi lavado com etanol 70% ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 2

3 com nova centrifugação, seco ao ar, ressuspenso em 1 ml de tampão TE (ph 8,0) e conservado a 4oC até a amplificação pela PCR Amplificação por PCR Forão utilizados primers especificos para detectar Helicobater pylori (Monteiro, et al 1997, Foxall, et al 1992), Campylobacter col e, Campylobacter jejuni (HANNINEN, et al., 2000., Huo-Shu, et al., 2001). Para a amplificação, num volume final de 25ul, foram acrescentados 10ul do DNA extraído das amostras de água, 2,5mM de dntp, 1,75mM de MgCl2, 1X de tampão Taq DNA polimerase, 20pmol de cada primer e 2,5 U de taq Polimerase. Foram utilizados como controle positivo amostras de DNA confirmadas positivas, e como controle negativo ddh2o. Os ciclos de amplificação para Helicobater pylori (primer Urease) consistiram de um ciclo inicial de 94oC 2min, 40 ciclos de 1min a 94oC, 1min a 43oC e 1min 72oC e 7 min a 72oC para o último ciclo. Para os primers H1/H2, utilizados para confirmar a presença de DNA na mostra, nos 40 ciclos da aplificação a temepratura de anelamento foi de 55oC. Para a detecção do DNA de Campylobacter jejuni e C. coli, a reação consistiu em utilizar 94oC para o 1o ciclo, dois ciclos de 1min a 50oC, 1min 72oC e 1min 94oC, 35 ciclosde 1 min 50oC, 40 seg 72oC e 40 seg 94oC, com um estensão final de 8 min 72oC Análise do Produto de PCR O produto de PCR amplificado foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com brometo de etídio, verificando o aparecimento do fragmento amplificado com seus respectivos pesos moleculares. O marcador 100pb ladder foi utilizado como referência. RESULTADOS No meio ambiente existem de um grande número de microrganismos culturáveis e competidores com as bactérias H. pylori, Campylobacter jejuni e C. coli. Estes competidores, além de culturáveis, possuem um rápido crescimento, tornando-os um empecilho para a utilização da cultura microbiológica no seu monitoramento (Jiang & Doyle, 2002). Por isso, a utilização dos métodos convencionais para detecção destes microrganismos não pôde ser usada, sendo então necessário o desenvolvimento de uma nova técnica capaz de monitorar ambientalmente tais microrganismos sem utilização da cultura microbiológica. Assim, optou-se por desenvolver uma metodologia molecular, através da qual pudemos observar resultados satisfatórios em alguns meses entre o período de seca (julho a outubro) e chuva (novembro a março). A presença de H. pylori foi determinada pela detecção do produto de amplificação do gene UreA de 411pb e através da amplificação de uma seqüência especifica, de gene desconhecido, para a referida bactéria, amplificando-se um fragmento de 282pb. A presença de Campylobacter jejuni e C. coli, foram determinadas pela amplificação de fragmentos de 783pb e 645pb, respectivamente (figura 1). Como controle positivo foram utilizados amostras extraídas de DNA de cada microrganismo. Amostras positivas foram encontradas no Rio Meia Ponte, córrego João Leite, que abastece a cidade de Goiânia, e nos lagos Vaca Brava e Bosque dos Buritis (tabelas 1, 2, 3). DNA de H. pylori foi detectado em todos os meses coletados e não se observou influencia da estação do ano. As maiores oscilações foram observadas no Rio Meia Ponte que, antes da ETE, recebe menor carga de esgotos sanitários, aonde estão locaalizadas cidades de baixa densidade populacional. Após a ETE não se detectou a amplificação de DNA de H. pylori, mas observou-se uma grande variação nos índices físico-quimicos analisados. No lagos do Bosque dos Buritis e Vaca Brava, analisados com menor freqüência, a detecção foi praticamente integral. Nestes lagos a mata ciliar, quando presente, é reduzida e apresenta profundas alterações na conservação. Nas águas do Bosque Areião não foi detectado significativamente DNA de H.pylori. Neste lago observou-se maior área e integridade da mata ciliar, maior fluxo e ausência de depósitos orgânicos de alimentos na nascente. ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 3

4 Tabela 1. Freqüência da detecção de Helicobacter pylori utilizando-se os primers H3+H4/H1+H2, no Rio Meia Ponte antes (MPA) e depois da ETE (MPD), no Córrego João Leite (JL), lagos vaca brava (VC), bosque dos Buritis (BB) e areião (A) no município de Goiânia-GO. JL MPA MPD VC BB A JUN +/+ -/- -/- N/N N/N N/N JUL +/+ +/+ -/- N/N N/N N/N AGO +/+ -/- -/- +/+ +/+ -/- SET +/+ -/- -/- +/+ +/+ -/- OUT* -/- -/- -/- +/+ +/+ -/- NOV +/+ N/N N/N N/N N/N N/N JAN +/+ N/N N/N N/N N/N N/N FEV +/- -/- -/- +/- +/- -/- * Mês com chuvas esporádicas; positivo (+), para negativo(-), não avaliado (N). Ao contrario do esperado, tanto para C. Coli e jejuni, não se observou uma elevada incidência na detecção de DNA em nenhuma das estações do ano, tabela 2 e 3. Tabela 2. Freqüência de Campylobacter coli no Rio Meia Ponte antes (MPA) e depois da ETE (MPD), no Córrego João Leite (JL), lagos vaca brava (VC), bosque dos Buritis (BB) e areião (A) no município de Goiânia-GO. JL MPA MPD VC BB A JUN N N N JUL N N N AGO SET OUT* NOV - N N N N N JAN + N N N N N FEV * Mês com chuvas esporádicas; positivo (+), para negativo(-), não avaliado (N). Tabela 3. Freqüência de Campylobacter jejuni no Rio Meia Ponte antes (MPA) e depois da ETE (MPD), no Córrego João Leite (JL), lagos vaca brava (VC), bosque dos Buritis (BB) e areião (A) no município de Goiânia-GO. JL MPA MPD VC BB A JUN N N N JUL N N N AGO SET OUT NOV - N N N N N JAN + N N N N N FEV * Mês com chuvas esporádicas; positivo (+), para negativo (-), não avaliado (N). Pelo recepção de águas de esgotos com dejetos humanos, em todas as amostras a incidência de coliformes fecais foi alta no Rio Meia ponte, mesmo a jusante da ETE, aonde a recepção de descarga de dejetos humanos é menor. No córrego João Leite o índice de coliformes fecais oscilou em torno de a , dentro dos parâmetros de classe III, destinada ao abastecimento domestico. Apenas no inicio das chuvas no mês de outubro esse índice saltou pra , mas não se detectou influencia sobre a deteção de DNA das bactérias analisadas. Apesar da aparente eutrofização e da presença de elevada população de patos, tartarugas e peixes, o índice de coliformes fecais foi baixa nos lagos, oscilando de 20 a Alguns parâmetros físico-quimicos básicos foram analisados pela SANEAGO e, destes, apenas nas águas lago do Bosque dos Buritis se observou uma alteração significativa, no ph, mas das análises efetuadas, turbidez, DBO, oxigênio dissolvido, e condutividade não mostram alterações significativas correlacionáveis à presença dos microrganimos. Embora o ph tneha oscilado entre 6,34 e 10,09 no Bosque dos butitis (figura 2), ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 4

5 fora dos limites ótimos para sobrevivência dos coliformes fecais, não influenciou na persistência das mesmas no meio. O oxigênio dissolvido foi outro fator que pouco influenciou na presença dos microrganismos variando seus valores com Maximo de 11,4 e mínimo de 1,6mg/L O2 (figura 3). O mesmo se observou com a DBO, que variou intensamente de 0,5 a 102mg/L O2 (figura 4). Figura 1. Gel de poliacrilamida a 6%, demonstrando as amplificações do gene urea de H. pylori de amostras extraídas diretamente de água. Linha M: marcador de 100pb; linha 1: ddh2o (C- ); linha 2: DNA humano (C-); linha 3: DNA de E. coli (C-); Linha 4: DNA de H. pylori P05 (C+); Linhas 5,6,7 e 9: produtos de PCR de 411pb do gene urea; linha 8: amostra negativa para urea. pb M Figura 2. Variação do ph no Rio Meia Ponte antes (MPA) e depois da ETE (MPD), ribeirão João Leite (JL), lagos Vaca Brava (VC), Bosque dos Buritis (BB) e Areão (A) nos meses de agosto (AGO), setembro(set) e outubro(out) AGO SET OUT J. L MPA MPD VC BB A ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 5

6 Figura 3. Variação do oxigênio dissolvido nos rios João Leite (JL), meia ponte antes da ETE (MPA), meia ponte depois da ETE (MPD), lagos vaca brava (VC), bosque dos Buritis (BB) e Areião (A) nos meses de agosto (AGO), setembro(set) e outubro(out) AGO SET OUT J. L MPA MPD VC BB A Figura 4. Variação do debito de oxigênio nos rios João Leite (JL), meia ponte antes da ETE (MPA), meia ponte depois da ETE (MPD), lagos vaca brava (VC), bosque dos Buritis (BB) e Areiao (A) nos meses de agosto (AGO), setembro(set) e outubro(out) AGO SET OUT J. L MPA MPD VC BB A CONCLUSÕES A metodologia utilizada de concentração e extração do DNA de águas pluviais demonstrou-se, rápida, sensível e efetiva para o diagnostico de microrganismos emergentes. O processo total pode ser realizado num período curto, cerca de 8 horas, quando existe um treinamento adequado, possibilitando seu uso na rotina laboratorial associado às técnicas de amostragem convencionais. A homoglobina, composto comum em águas de despejo sanitário humano e de animais, é um potente inibidor da enzima Taq DNA polimerase, empregada nas reações de amplificação. Mesmo assim, foi possível detectar e amplificar DNA dos microrganismos emergentes extraídos diretamente da água. Certamente, a oscilação observada no Rio Meia Ponte na presença do DNA das bactérias pode ter sido afetada pela presença de traços de hemoglobina, não removidas no processo da extração do DNA. Mas esse problema pode ser contornado, possivelmente, com uso de métodos de extração baseados em resinas sintéticas, muito empregado para extração de DNA a partir de sangue total. Através da metodologia molecular empregada foi possível observar a presença de DNA em todas as fontes amostrais de água, com exceção do lago Areião, todos os outros ambientes estavam contaminados com pelo menos uma das bactérias ao longo do período analisado. Visto que as referidas bactérias estudadas são patógenos gastrintestinais, sendo que fezes de animais e principalmente humanas, são a principal causa de contaminação dos mananciais de água, era esperado a ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 6

7 detecção em todas as amostras procedentes dos rios e sua ausência nas águas dos lagos. Relativo ao H. pylori, segundo a bibliografia, este patógeno é exclusivamente humano e não se multiplica em águas pluviais. Sua presença nos rios pode ser justificada pelo despejo de resíduos fecais humanos que, após o tratamento dá água, como a estação da ETE, proporcionaria sua remoção completa. Isto poderia corroborar, também, para a sua oscilação à montante da ETE. Entretanto, sua detecção nos lagos poderia ser um alerta de contaminação com material fecal humano ou de animais diretamente relacionados. Pela sua localização urbana e, insenta de contato com águas residuais domesticas, a presença deste microrganismo pressupõe uma possível fonte de contaminação constante, ou a sobrevivência do mesmo através de outra fonte dispersora animal. Considerando este fato, novas extrações foram feitas a partir de volumes reduzidos de amostra de água do lago Vaca Brava e do ribeirão João leite. Embora esta análise ainda não tenha sido concluída, em volumes reduzidos de água, cerca de 500ul, foram suficientes para a detecção. Durante o processo de extração do DNA utilizado, ocorrem perdas consideráveis de amostra, superiores a 20%, indicando que a mesma pode estar numa concentração bem superior ao eu se possa imaginar. Para responder a esta questão, novos experimentos estão sendo padronizados para relacionar a população da bactéria nas águas e os possíveis agentes dispersores na população aquática. Embora nem H.pylori, nem Campylobacter jejuni, nem Campylobacter coli estivessem nos seus ph ideais (West, Millar e Tompkins, 1990, Gomes, 2004, Solomon et al 1999), podemos observar que este fator pouco influenciou na sobrevivência destes referidos microrganismos, pois os mesmos foram identificados mesmo com intensas variações de ph, o qual variou de 6,34 e 10,09. De acordo com os dados fornecidos pela SANEAGO, as mais altas concentrações de matéria orgânica puderam ser notadas em: outubro (JL, MPA,MPD), setembro(mpa, MPD), agosto (MPD), sendo justificado pelo baixo índice de OD, e elevada turbidez. Em alguns pontos de coleta a elevada presença de matéria orgânica pode ter influenciado negativamente na analise molecular, pois justamente nestes meses os ambientes os quais apresentaram maiores índices de matéria orgânica encontraram-se quase em sua totalidade negativos para os microrganismos analisados. Quanto aos lagos este fator possivelmente não tenha influenciado no resultado, pois o índice de amostras positivas não abaixou em decorrência da presença de matéria orgânica. Isto pode ser justificado pelo fato de que a matéria orgânica presente nos lagos possivelmente deva ser de origem da flora amplamente disseminada nestes ambientes, diferentemente da matéria orgânica presente nos rios, a qual acreditasse que seja originaria de dejetos humanos e animais onde estão presentes um grande numero de substancias inibidoras da atividade da enzima taq DNA Polimerase como por exemplo a hemoglobina. Estudos mais aprofundados ainda são necessários para verificação dos dados analisados contudo pode-se destacar que a presença dos patogenos emergentes Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni e Campylobacter coli, são de fato importantes para a saúde publica e devem ser monitorados nas águas pluviais dos rios e lagos de Goiás. Com a barragem das águas do ribeirão João Leite, com objetivo de ampliar a captação de água para consumo urbano, a presença destes organismos pode elevar o índice das doenças a eles associadas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20 th edition, 1999.The American Public Health Association, The American Water Works Association, and the Water Environment Federation 2. GOMES, B. C.; DE MARTINIS, E. C. P. The signicance of Helicobacter pylori in water, food and environmental samples. Food Control, v. 15, p , BEJ, A. K.; MCCARTY; S.C. & ATLAS, R.M. Detection of coliform bacteria and Escherichia coli by multiplex polymerase chain reaction: comparison with defined substrate and plating methods for water quality monitoring. Appl. Environ. Microb. 57: , GUYADER, F.L.; MIOSSEC, L.; HAUGARREAU, L.; DUBOIS, E.; KOPECKA, H. & POMMEPUY, M.. TR-PCR evaluation of viral contamination in five shellfish beds over a 21-month period. Wat. Sci. Tech. 38: 45-50, SOBSEY, M.D.; BATTIGELLI, D.A.; SHIN, G.A. & NEWLAND, S. RT-PCR amplification detects inactivated viruses in water and wastewater. Wat. Sci. Tech. 38: 91-94, BEJ, A. K.; MAHBUBANI, M.; DICESARE, J. and ATLAS, R Polymerase chain reaction-gene probe detection os microorganisms by filter-concentrated samples. Applied Env. Micorbiology, 57: ABES - Associação Brasileira de Engenharia Sanitária e Ambiental 7

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