UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA TAIRONE MACHADO

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1 UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA TAIRONE MACHADO AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS TECIDUAIS DE BOVINOS Tubarão 2012

2 TAIRONE MACHADO AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS TECIDUAIS DE BOVINOS Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Profa. Rosemeri Maurici da Silva, Dra. Coorientadora: Profa. Maria Luiza Bazzo, Dra. Tubarão 2012

3 TAIRONE MACHADO AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) NO ISOLAMENTO DE MICOBACTÉRIAS EM AMOSTRAS TECIDUAIS DE BOVINOS Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina. Professora e Orientadora: Rosemeri Maurici da Silva, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina. Professora: Anna Paula Piovezan, Dra. Universidade do Sul de Santa Catarina. Professor: Leonardo de Lucca Schiavon, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina.

4 RESUMO A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso e crônica, sendo que no Brasil apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos. O objetivo deste estudo foi avaliar o rendimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) no isolamento de micobactérias em amostras teciduais congeladas de bovinos. As amostras teciduais foram descongeladas e semeadas em meios de cultura Ogawa-Kudoh contendo piruvato de sódio, e outro contendo glicerol por 42 dias a 37ºC. Foram submetidas à PCR as amostras de tecido e os isolados das culturas, com primers específicos para M. tuberculosis e M. bovis. Foram analisadas 69 amostras teciduais de bovinos, das quais 81,2% constituíram-se de linfonodos. Tomando-se o resultado combinado das culturas como padrão áureo, identificou-se a presença de micobactérias em 17 amostras teciduais (24,6%), 12 delas (70,6%) pertencentes ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (Complexo MTB), e 5 (29,4%) identificadas como Micobactérias Não Tuberculosas (MNT). O melhor rendimento diagnóstico foi alcançado pela cultura específica Ogawa-Kudoh com Piruvato e com descontaminação. O rendimento da PCR realizada nas amostras teciduais com o gene alvo hsp65 em comparação com o padrão áureo, foi de 17,6% de sensibilidade (IC95%:-0,005-0,36), especificidade de 98,1% (IC95%:0,94-1,02), valor preditivo positivo de 75% (IC95%:0,33-1,17), valor preditivo negativo de 78,5% (IC95%:0,68-1,19), e acurácia de 78,3%. A razão de verossimilhança positiva foi de 9,18 e a negativa foi de 0,8. A PCR hsp65 realizada diretamente do tecido acometido apresentou alta especificidade e valor preditivo positivo, porém baixa sensibilidade, sendo desejável a otimização desta técnica para que possa ser utilizada na rotina laboratorial. Palavras-chave: Tuberculose. PCR. M. bovis.

5 ABSTRACT Brazilian cattle herds have high morbidity rates due to bovine tuberculosis, which is a chronic granulomatous disease. The aim of this study was to evaluate the performance of the polymerase chain reaction (PCR) in the recovery of mycobacteria from frozen tissue samples of cattle. The tissue samples were frozen-thawed and seeded into Ogawa-Kudoh culture media, one containing sodium pyruvate and another containing glycerol for 42 days at 37 C. Tissue samples and culture isolates with primers specific for M. tuberculosis and M. bovis were subjected to PCR. In total, 69 tissue samples of cattle were analyzed, 81.2% of which consisted of lymph nodes. Taking the combined results of cultures as the gold standard, the presence of mycobacteria was identified in 17 (24.6%) tissue samples, of which 12 (70.6%) belonged to the Mycobacterium tuberculosis complex (MTB complex), and 5 (29.4%) were identified as nontuberculous mycobacteria (NTM). The best diagnostic yield was achieved by Ogawa-Kudoh specific culture with Pyruvate and decontamination. The yield of PCR performed on tissue samples with the hsp65 gene as the target compared with the gold standard showed a sensitivity of 17.6% (95% CI: ), specificity of 98.1% (95% CI: ), positive predictive value of 75% (95% CI: ), negative predictive value of 78.5% (95% CI: ), and accuracy of 78.3%. The positive likelihood ratio was 9.18, and the negative likelihood ratio was 0.8. The hsp65 PCR performed directly on the affected tissue showed high specificity and positive predictive value, but low sensitivity. Optimization of this technique is highly desirable, so it can be used for laboratory routine monitoring. Keywords: Tuberculosis. PCR. M. bovis.

6 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Fluxograma da metodologia utilizada Figura 2 - Lesões macroscópicas em amostras teciduais hepáticas... 32

7 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Distribuição das amostras teciduais analisadas de acordo com o sítio anatômico.. 32 Tabela 2 - Distribuição das micobactérias isoladas Tabela 3 - Distribuição dos resultados das culturas específicas em comparação com o padrão áureo Tabela 4 - Rendimento diagnóstico das culturas específicas em comparação com o padrão áureo Tabela 5 - Distribuição dos resultados da cultura de acordo com a amostra tecidual analisada Tabela 6 - Distribuição do resultado da PCR hsp65 em amostras teciduais, de acordo com o padrão áureo

8 LISTA DE SIGLAS CMTB - Complexo M. tuberculosis CTAB - cetyltrimethylammonium bromide MAIS - Mycobacterium avium, M. intracelulareae, M. scrofulaceum MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MNT - Micobactérias não-tuberculosas MTBC - M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. caprae, M. canettii, e M. microti PNCEBT - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal PNCTBB - Plano Nacional de Controle da Tuberculose e Brucelose Bovina PPD Derivado protéico purificado de Mycobacterium

9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO O PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DA BRUCELOSE E TUBERCULOSE ANIMAL MÉTODOS DIAGNÓSTICOS BACTERIOSCOPIA CULTURA E IDENTIFICAÇÃO REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) RENDIMENTO DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MÉTODOS METODOLOGIA LABORATORIAL ANÁLISE DOS DADOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS ANEXOS ANEXO A Regulamento da Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal ANEXO B Instrução Normativa SDA n 10, de 15 de janeiro de

10 10 1 INTRODUÇÃO As micobactérias são organismos que provavelmente, já existiam há milhões de anos antes do surgimento dos primatas. Mycobacterium bovis, ou uma variante, provavelmente infectou animais no período paleolítico. O homem não era o hospedeiro natural e as primeiras infecções humanas ocorreram como eventos isolados, provavelmente resultantes da ingestão de carne ou de leite infectados. Havia, no entanto, pequena possibilidade da disseminação da doença nas comunidades humanas primitivas, devido à dispersão da população e ao mínimo envolvimento pulmonar (VERONESI; FOCACCIA, 2010). A agricultura, que iniciou há aproximadamente anos (a.c.), propiciou o surgimento de vilas e a domesticação de animais, sendo prática comum mantê-los no pavimento inferior das moradias para seu aquecimento interno. Essas condições favoreceram a disseminação de infecções entre os seres humanos, apesar de que a tuberculose não tenha sido um problema significativo nas populações pré-históricas (DANIEL, 2006). A doença podia ser encontrada na época paleolítica em virtude das características da conformação dos grupos de caça e de coleta os quais se constituíam como povos nômades e dispersos, dificultando a disseminação do agente etiológico. Entretanto, a maior concentração dos seres humanos no período Neolítico, começou a propiciar a difusão da tuberculose (DANIEL, 2006). A espondilite tuberculosa foi documentada em múmias egípcias datadas de (a.c.), muito provavelmente causada por Mycobacterium bovis. Contudo, como a espécie humana não é a hospedeira natural de Mycobacterium bovis, a doença provavelmente apresentava menor virulência quando comparada àquela causada por Mycobacterium tuberculosis (DANIEL, 2006; VERONESI, FOCACCIA, 2010). Relatos da disseminação da tuberculose podem ser encontrados em textos gregos e hindus, sendo que os primeiros a denominavam tisis (que significa debilitamento, desgaste), cabendo a esses povos a descrição mais apurada da doença. Os textos atribuídos a Hipócrates são assinalados como constituintes do melhor repertório de informações sobre o tema. O filósofo deslocou a interpretação da enfermidade do domínio exclusivo dos princípios religiosos, estabelecendo os fundamentos do raciocínio clínico sobre a doença basicamente pelos seguintes sinais: tosse, expectoração, hemoptise e debilitamento (DANIEL, 1997). Hipócrates estudou o aniquilamento progressivo que a doença causa no organismo, descrevendo o desenvolvimento da doença e o tratamento utilizado na época, que

11 11 consistia basicamente da ingestão de mostarda, lentilhas, leite de vaca e de cabra adicionando água, mel ou orégano. Como alimentos sólidos, recomendava carne de carneiro cozida e pescados, sendo que os alimentos gordurosos e salgados eram tidos como os preferidos acrescia ainda o uso de vinho tinto. Galeno, partindo das observações de Hipócrates, foi um dos pioneiros na recomendação do regime climático para os doentes (DANIEL, 1997). Anteriormente à era bacteriana são numerosas as referências citando o perigo que representa para o homem o consumo de carne de animais sofrendo de caquexia e é muito provável que nesta designação estivesse incluída a tuberculose bovina. Nos ensinamentos da doutrina mosaica, encontra-se no Talmude, codificado em fins do século II, a proibição ao povo hebreu de utilizar-se de carne de bovinos em cujos pulmões fossem encontradas lesões ulcerativas. Em Munique, por volta de 1307 (d.c.), foi promulgada uma lei semelhante a do Talmude, e em Leipzg, 1788, a morte de 12 estudantes foi atribuída à ingestão de carne de animal tuberculoso (DANIEL, 2006; DANIEL, 1997; ABRAHÃO, 1998). Em 1889, Theobald Swit isolou Mycobaterium bovis, e em 1902, Revenel obteve a primeira prova definitiva da transmissão da tuberculose bovina ao homem decorrente da ingestão de alimentos. O isolado foi realizado em uma cultura pura dos bacilos presentes em gânglios mesentéricos de uma criança falecida de meningite tuberculosa, no Hospital Infantil da Filadélfia, tais bacilos foram inoculados em três bovinos, que em menos de 30 dias foram a óbito. Os resultados da necropsia destes animais não deixaram dúvidas de que a causa da morte foi tuberculose (DANIEL, 1997). Em 1908, Mantoux institui o teste cutâneo para diagnóstico e, em 1931, Kuhnaus verificou que a carne poderia transmitir a doença somente quando o animal era afetado por uma tuberculose generalizada e neste caso, seria condenado durante a inspeção realizada nos matadouros. Todavia, fabricantes gananciosos utilizavam as partes tuberculosas para o preparo de salsichas que, quando consumidas sem tratamento térmico prévio, ofereciam grande risco às pessoas (ABRAHÃO, 1998; AMANFU, 2006). O homem, na tentativa de se relacionar com o ambiente, adquiriu hábitos impróprios, os quais foram corrigindo-se ao longo das gerações. Conviver com animais ou em ambientes insalubres sem a mínima condição de saúde possibilitou aos microrganismos habitar outros organismos e provocar doenças. A tuberculose é uma doença dos seres humanos que acomete os pulmões e outros órgãos que pode apresentar perfil de resistência aos medicamentos acredita-se ter sido introduzida através da cadeia alimentar e nas grandes invasões à natureza (O REILLY; DABORN, 1995).

12 12 O gênero Mycobacterium contém, na atual classificação, 154 espécies e 13 subespécies (EUZÉBY, 2011). É constituído pelo M. leprae, pelas espécies do Complexo M. tuberculosis (CMTB) e pelas micobactérias denominadas Micobactérias Não-Tuberculosas (MNT) (BROSCH et al., 2002; McGRATH et al., 2010). Mycobacterium tuberculosis foi batizado como bacilo de Koch em homenagem a este cientista ganhador do prêmio Nobel de Medicina em As micobactérias se distribuíram amplamente pelo ambiente, no solo, na água ou parasitando alguns animais intracelularmente, provocando doenças nos seres humanos. Em países que apresentam carência alimentar, falta de saneamento básico e ausência de orientação sanitária, a incidência da tuberculose é mais exacerbada, vitimando inúmeras pessoas independentemente de classe econômica ou social (CAMPOS, 2006). O indivíduo pode adquirir o bacilo e desenvolver a doença ao consumir água não tratada, carne de animais não vacinados e sem avaliação dos órgãos de saúde responsáveis pelos alimentos. Os bacilos também são encontrados no escarro das pessoas e animais doentes, e sua transmissão ocorre pelas microgotículas que são expelidas ao falar ou tossir, e instalam-se em lugares úmidos ao abrigo do sol. Desta forma, o confinamento dos animais é um fator propício à instalação da doença (BRASIL, 2008). No entanto, algumas precauções podem ser tomadas para evitar a doença, ferver o leite e cozinhar os derivados da carne antes do consumo, é uma das formas de evitar a transmissão da tuberculose, conhecida também como tísica consumptiva e peste branca. (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006). A tuberculose bovina é uma doença de caráter granulomatoso crônico, sendo que no Brasil apresenta alto índice de morbidade nos rebanhos leiteiros. Essa enfermidade, por se tratar de uma zoonose, é um problema de grandes proporções, pois acarreta prejuízos desde a produção de leite até transtornos econômicos causados diretamente aos pecuaristas. A população humana em geral é atingida através do consumo de leite cru, de subprodutos lácteos produzidos in natura, e do contato com animais portadores de tuberculose (KANTOR; RITACCO, 1994; CORREA, 1992). No Brasil, o risco para a saúde pública de se contrair o agente pela ingestão de produtos cárneos contaminados torna-se menor, devido à baixa incidência do agente em tecidos musculares, e do hábito de não se comer carne crua no país. Porém, tal risco não deve ser ignorado quando se leva em consideração o grande número de abates clandestinos, ou mesmo o abate de animais descartados de rebanhos positivos em matadouros municipais que não atendem as normas de inspeção exigidas pelo rigor da lei (BRASIL, 2008; ABRAHÃO, 1998).

13 13 Em humanos, quando a contaminação se dá por ingestão, pode ocorrer uma infecção inicial das amígdalas, prosseguindo então para as cadeias de linfonodos cervicais. A lesão inicial não passa de uma amigdalite, entretanto, lesões supurativas podem ocorrer nas cadeias cervicais, afetando linfonodos pré-auriculares, tonsilares e supraclaviculares, com posterior envolvimento da pele sobrejacente. Tais lesões são comumente conhecidas como scrofulodermia ou lupus vulgaris. O acometimento da tuberculose na região óssea e articular também é comum, provocando lesões ósseas localizadas e artrite. Em crianças, é comum se encontrar acometimento intestinal (CAMPOS, 2006; VERONESI; FOCACCIA, 2010). Quanto ao acometimento pulmonar, resultados obtidos de estudos experimentais demonstram que de um a cinco bacilos são capazes de produzir lesões pulmonares quando atingem as vias aéreas inferiores, principalmente os alvéolos, por inalação de aerossóis. Entretanto, estudos recentes demonstraram que a infecção intra-nasal em bezerros somente ocorre se houver inoculação de cerca de 10 4 a 10 6 unidades formadoras de colônias. A maior ocorrência da forma pulmonar da tuberculose bovina em indivíduos da área rural pode ser explicada por tais resultados, sendo considerada uma doença ocupacional (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006). Médicos veterinários e trabalhadores de frigoríficos, que mantêm um contato direto com o animal, também estão sujeitos à infecção pelo bacilo bovino devido à inalação de aerossóis. Outra forma de infecção da tuberculose bovina em humanos é através do acometimento cutâneo. A contaminação se dá pelo contato direto com carcaças contaminadas. Dessa forma, as pessoas mais acometidas pela tuberculose são os magarefes, auxiliares de inspeção e médicos veterinários. As lesões dessa infecção, na maioria das vezes são pouco extensas e regressivas, manifestando-se na forma de pequenas pápulas, semelhantes a verrugas, sendo conhecidas como butcher wart ou verruga do magarefe. (WHO, 1993; COSIVI et. al., 1998). A benignidade da tuberculose cutânea, provavelmente está relacionada à resistência que os adultos possuem ao bacilo, e não à menor virulência do mesmo. Essas lesões de mesma benignidade são encontradas nas mãos dos patologistas que praticam autópsias sem a proteção de luvas, sendo neste caso, causadas pelo bacilo humano (JULIANO, 2007). Há evidências que tanto a resistência genética do hospedeiro a uma infecção por M. bovis, quanto a influência de fatores fisiológicos e imunológicos, em animais e em pessoas, interferem no curso da tuberculose. Entretanto, não há comprovação experimental conclusiva que tais fatores possam interferir na infecção, pois esta pode ocorrer na infância e

14 14 permanecer silenciosa, e em algum momento da fase adulta pode ocorrer manifestação dos sintomas (CAMPOS, 2006; VERONESI; FOCACCIA, 2010). Os testes de tuberculinização têm sido utilizados para diagnóstico de tuberculose em bovinos há mais de um século. Estes testes avaliam respostas de hipersensibilidade retardada, 72 horas após uma injeção intradérmica de tuberculina (PPD derivado protéico purificado de Mycobacterium). Atualmente, duas modalidades de testes são utilizadas: o teste intradérmico simples, que utiliza apenas tuberculina bovina, e o teste intradérmico comparado, que utiliza tuberculina bovina e aviária (BRASIL, 2008; JULIANO, 2007). A tuberculinização comparada permite minimizar diagnósticos falso-positivos por reações decorrentes de bactérias do complexo MAIS (Mycobacterium avium, M. intracelulareae, M. scrofulaceum), que não são patogênicos para bovinos, porém são capazes de desencadear reações positivas. Resultados falso-negativos podem ser observados em diversas situações como: em infecções recentes (30 a 50 dias da infecção), nos casos de anergia decorrente do acometimento generalizado (tuberculose miliar); no período de 42 a 60 dias entre testes; durante o período de 4 a 6 semanas pós-parto (no qual se observa uma imunossupressão transitória) (RUGGIERO, 2007). Apesar da grande variação da sensibilidade do teste de tuberculinização (68% a 95%, podendo ser menor em condições de campo), o mesmo vem sendo utilizado como principal método de diagnóstico em programas de controle e erradicação da tuberculose bovina em muitos países, inclusive no Brasil (BRASIL, 2008; RUGGIERO, 2007). A tuberculose como zoonose, é preocupante principalmente nos países em desenvolvimento, pois o conhecimento da doença é escasso e as medidas de controle ineficientes. Por este motivo, é necessária maior preocupação por parte dos profissionais que atuam no campo da Saúde Pública, em relação à infecção por M. bovis, especialmente com as populações de risco, neste caso, os trabalhadores rurais que são os mais afetados, já que são expostos ocupacionalmente (ABRAHÃO, 1998). No entanto, existe outro agravante, a falta de diagnóstico efetivo que diferencie cepas de M. bovis e M. tuberculosis. A provável explicação para essa falha seria a perda de interesse epidemiológico, já que, após a obrigatoriedade da pasteurização do leite, o abate do gado tuberculínico, e a confiança na eficácia da quimioterapia atual contra todos os tipos de tuberculose, houve uma queda na incidência da doença. Entretanto, desde que a tuberculose causada por M. bovis reapareceu em países nos quais ela estava praticamente erradicada, e desde que a pirazinamida passou ser regularmente usada como um fármaco antituberculose de

15 15 primeira linha e M. bovis é naturalmente resistente a ela existem razões para fazer a distinção de ambas (ABRAHÃO, 1998; CHIMARA; FERRAZOLI; LEÃO, 2004). A principal razão seria o fato de que casos de tuberculose humana relacionados com M. bovis podem estar sendo tratados como tuberculose causada por M. tuberculosis em todo o país. Como M. bovis é naturalmente resistente à pirazinamida, cepas multidrogaresistentes poderão ser geradas nestes tratamentos falhos, impedindo a cura do paciente, tornando-o um potencial transmissor destas cepas resistentes a outras pessoas e animais e, eventualmente, levando-os à morte (ABRAHÃO, 1998; CAMPOS, 2006; PARREIRAS, 2004). O Brasil tem atualmente uma população bovina maior do que 190 milhões de cabeças de gado. Dados recentes mostram nível de infecção entre 0,9% a 2,9%, dos quais 6,2% a 26,3% dos rebanhos possuem animais infectados, sem que essas taxas mostrem diminuição da incidência. A taxa de animais abatidos encontrados com lesões em matadouros é de aproximadamente 0,14%. (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011). Em países desenvolvidos, estima-se que as perdas econômicas decorrentes da tuberculose afetem 10% da produtividade do gado leiteiro. No Brasil, as perdas na produção leiteira chegam a 18%, com retardo da primeira lactação e diminuição do número e da duração das lactações (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011; SABEDOT, 2009; COSIVI, 1998). O bovino é definido como o hospedeiro verdadeiro da tuberculose bovina, mas muitas espécies domésticas e silvestres também são susceptíveis à doença, entre elas o búfalo e o bisão (O REILLY; DABORN, 1995). Mycobacterium tuberculosis apresenta-se com menor patogenicidade em bovinos, sendo que a doença nessa espécie toma caráter autolimitante. Os animais infectados são a principal fonte de contaminação, sendo a via orofaríngea a porta de entrada mais comum, pastos e alimentos contaminados têm menor importância na transmissão da doença. O bovino uma vez infectado, já é capaz de transmitir a doença a outros. O agente pode ser eliminado pela respiração, pelo corrimento nasal, leite, fezes, urina, secreções vaginais e uterinas, e pelo sêmen. No entanto, a ingestão de leite contaminado é a principal via de transmissão para animais jovens, e também para o homem. Já a transmissão transplacentária é considerada muito rara ou inexistente nos bovinos. As vias de transmissão menos comuns são a intrauterina e o coito, através de sêmen contaminado (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006).

16 16 Quando a infecção se dá pelo trato respiratório (aerossóis), o pulmão é o órgão primeiramente atingido, assim como os linfonodos regionais. Quando a infecção é pela via digestiva, a lesão se dá no sítio de entrada, principalmente nos linfonodos faríngeos e mesentéricos. No entanto, pode atingir praticamente todos os órgãos quando da generalização do processo. Na primo-infecção pulmonar os bacilos vão se alojar no tecido promovendo uma reação inflamatória, caracterizada como uma pneumonia. Desta forma, a doença se instala basicamente nos pulmões, formando nódulos caseosos de tamanhos variados, em muitos casos tomando todo o parênquima pulmonar e formando lesões cavitárias com expectoração de material bacilífero. Através de uma reinfecção exógena ou endógena, pela recrudescência da lesão, esta se torna necrosada, podendo atingir os tecidos vizinhos e se disseminar para vários órgãos do indivíduo. Quando a resistência orgânica é baixa, acontece a disseminação do agente pelo parênquima pulmonar, pela via aérea, ou pela via hematogênica, atingindo linfonodos regionais e formando metástases em outros órgãos (VERONESI; FOCACCIA, 2010). Neste sentido, ocorre no foco inicial uma infiltração celular, necrose de caseificação e circunscrição da lesão, que pode evoluir para resolução e calcificação. Assim, a presença de um nódulo calcificado, predominantemente no terço distal do lobo caudal, e/ou aumento de volume do linfonodo regional denomina-se complexo primário. Os bacilos podem permanecer nos linfonodos ou nos nódulos tuberculosos por longos períodos, se multiplicando ou sob a forma latente (VERONESI; FOCACCIA, 2010; CAMPOS, 2006).

17 17 2 O PROGRAMA NACIONAL DE CONTROLE E ERRADICAÇÃO DA BRUCELOSE E TUBERCULOSE ANIMAL O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), instituiu em 2001 o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Animal (PNCEBT), o qual tem o objetivo de diminuir a incidência das duas zoonoses, bem como reduzir o impacto econômico que causam (BRASIL, 2006). Portanto, a tuberculose causada por Mycobacterium bovis, está disseminada por todo o país e afeta tanto os bovinos como os bubalinos. No entanto, sua prevalência e distribuição regional não estão bem caracterizadas. (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011; KANTOR; RITACCO, 1994). Os objetivos específicos do programa consistem em baixar a prevalência e a incidência de novos focos de tuberculose, criar um número significativo de propriedades certificadas livres de tuberculose ou monitoradas, e que ofereçam ao consumidor produtos de baixo risco sanitário (BRASIL, 2006). São consideradas estratégias do programa: A capacitação de médicos veterinários tanto da rede oficial quanto da iniciativa privada. Esses profissionais contribuirão para a solução de importantes problemas de saúde pública e animal, através da integração do serviço veterinário oficial e privado, e da constante melhoria do padrão dos serviços oferecidos aos pecuaristas e à população em geral (BRASIL, 2006). Diagnóstico e o apoio laboratorial constante a laboratórios privados e oficiais. O resultado será a normatização de exames no campo e em laboratórios, padronizando os exames de diagnóstico e procurando sempre a atualização no caso do surgimento de testes mais eficientes em relação aos recomendados (BRASIL, 2008). A certificação de propriedades livres e monitoradas de responsabilidade do serviço oficial será realizada mediante diagnóstico por amostragem a qualquer momento em propriedades certificadas e nos testes finais que conferem o certificado de propriedades livres. Todas estas estratégias visam a promoção da educação sanitária, na qual o MAPA considera essencial a necessidade de entendimento pelos pecuaristas e consumidores da adesão ao Programa, considerando-o como um projeto da sociedade brasileira, permitindo que as ações sanitárias sejam efetivamente aceitas e cumpridas (BRASIL, 2006; BRASIL, 2008).

18 18 A distribuição da tuberculose é mundial, apresentando alta prevalência nos países em desenvolvimento devido à ausência de controle e erradicação eficientes, fazendo com que os focos da doença se perpetuem. Nos países que implantaram programas de controle da tuberculose animal ao longo do século passado, baseados em tuberculinização e sacrifício de animais reagentes, o número de animais infectados foi reduzido drasticamente (ESSEY, KOLLER, 1994; GORDEJO; VERMEERSCH, 2006). No Brasil, dados oficiais indicam a prevalência média nacional de 1,3% de animais reagentes à tuberculina no período entre 1989 e 1998 (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2011). A tuberculose bovina é responsável por graves perdas econômicas em outros animais domésticos e de reconhecido perigo para a saúde humana, causando as mesmas formas clínicas e lesões patológicas que M. tuberculosis. A prevalência da tuberculose humana de origem animal tem diminuído nos países onde a pasteurização é obrigatória, ou onde existem campanhas de combate à enfermidade bovina. Naqueles países onde ocorre o costume de consumo de leite, seus derivados e carne, que passam por um processo de fervura ou cozimento, a incidência da infecção por M. bovis tem sido mais baixa (GORDEJO; VERMEERSCH, 2006). As infecções causadas por M. bovis em bovinos, bubalinos, outras espécies animais e também no ser humano se dá em 90% dos casos por via respiratória, a partir da inalação de aerossóis contendo o microrganismo. O exame clínico e a baciloscopia do escarro não permitem a diferenciação entre a infecção por M. bovis ou por M. tuberculosis no homem. Essa diferenciação só é possível pelo isolamento e identificação do agente (RODRIGUES, 2008; BRASIL, 2008). Portanto, a busca ativa realizada para a tuberculose humana é de suma importância, pois, se estas pessoas residirem no meio rural e tiverem contato com animais, certamente teremos animais infectados. Nessa hipótese, os animais deverão ser descartados ou caso contrário, o foco persistirá e o tratamento humano não terá resposta positiva. O controle da tuberculose bovina deve ser realizado por intermédio dos exames em bovinos e bubalinos, controle da saúde dos trabalhadores, espécies animais que se encontram em cada propriedade, e a utilização de instalações com boa ventilação e com exposição direta à luz solar. A higienização deve ser realizada com desinfetantes apropriados, como hipoclorito de sódio, fenol, formol cresol, dentre outros. O consumidor deve somente adquirir carne de estabelecimentos que comercializem produtos com inspeção federal, estadual ou municipal (BRASIL, 2006).

19 19 3 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS 3.1 BACTERIOSCOPIA Nos indivíduos com suspeita de tuberculose pode-se colher escarro, lavado gástrico, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano, urina, líquido articular, material de biópsia ou outro material suspeito, que deverá ser submetido à coloração de Ziehl-Neelsen para a procura de bacilos álcool-ácido-resistentes (BRASIL, 2008; FRÁGUAS, 2008). Os bacilos da tuberculose são visualizados como bastonetes retos e finos com aproximadamente 0,4 x 3 µm, que se coram em vermelho. A observação de BAAR nesses materiais clínicos é uma evidência presuntiva de tuberculose, mas não definitiva, uma vez que existem outros bacilos álcool-ácidos-resistentes (BRASIL, 2008; CAMPOS, 2006). 3.2 CULTURA E IDENTIFICAÇÃO Os materiais clínicos obtidos de sítios estéreis (como o líquor) podem ser cultivados diretamente. O escarro é tratado, inicialmente, com hidróxido de sódio a 2% ou com outros agentes bactericidas que eliminem a viabilidade dos microrganismos de crescimento rápido, como bactérias e fungos de vias aéreas superiores. A seguir, o escarro liquefeito é neutralizado e centrifugado, e o sedimento semeado (BRASIL, 2008). Podem ser utilizados os seguintes meios de cultura (BRASIL, 2008): a) Meios sintéticos simples As micobactérias crescem em meios sintéticos simples, após algumas semanas, a partir de inóculos grandes. A partir de inóculos pequenos, não há crescimento nestes meios, devido à presença de quantidades mínimas de ácidos graxos. b) Meios com ácido oleico e albumina Podem sustentar a proliferação de pequenos inóculos, principalmente se Tweens (ésteres hidrossolúveis de ácido graxos) estiverem presentes (por exemplo, no meio de Dubos). Em geral, as micobactérias crescem em grumos ou massas por causa da característica hidrofóbica da superfície celular. Os Tweens umedecem a superfície, permitindo o crescimento difuso nos meios líquidos. O crescimento é quase sempre mais rápido que em meios complexos. c) Meios orgânicos complexos Os inóculos pequenos, como no caso de material obtido de pacientes, são cultivados em meios contendo substâncias orgânicas complexas, como gema de ovo, soro animal e extratos de tecidos. Frequentemente, estes meios contêm penicilina ou verde malaquita para inibir outras bactérias (por exemplo, meio de Löwenstein-Jensen).

20 20 Embora a diversidade de meios de cultura, no Brasil é adotada os meios a base de ovo Löwenstein-Jensen ou Ogawa-Kudoh, com glicerol para cultivo de micobactérias em geral e com piruvato para cultivo de M. bovis, além dos meios líquidos que compõem sistemas automatizados como MGIT 960 (BRASIL, 2011). As micobactérias são bacilos aeróbios estritos e obtêm energia a partir da oxidação de muitos compostos simples de carbono. Desta forma, o aumento da concentração de CO 2 produzido durante seu metabolismo estimula o crescimento. As atividades bioquímicas não são características, e a velocidade de crescimento é muito menor do que a maioria das bactérias. O tempo de multiplicação do bacilo da tuberculose é de 12 horas a 25 horas, o que impõe a incubação dos meios inoculados a 37 C, por até oito semanas. As formas saprófitas de Mycobacterium tendem a crescer mais rapidamente, proliferam bem a 22 C, produzem mais pigmento e são menos álcool-ácido-resistentes que as formas patogênicas (BRASIL, 2008; MARCHI, et. al., 2008). A identificação de micobactérias pode ser feita de duas maneiras, com testes fenotípicos ou moleculares. A identificação fenotípica é muito trabalhosa e implica na utilização de uma série de reações. Essa identificação para algumas espécies é realizada da seguinte forma (BRASIL, 2008): a) Observar o crescimento a cada cinco dias. Fazer coloração de Ziehl-Neelsen das colônias para confirmação da propriedade do álcool-ácido-resistência. b) Se o crescimento de colônias de BAAR for obtido em menos de cinco dias (microrganismos de crescimento rápido), deve-se realizar a reação de arilsulfatase. Resultado fortemente positivo indica M. fortuitum; Resultado negativo ou fracamente positivo indica outras micobactérias desse grupo, a serem identificadas pelas fermentações de açúcares (M. smegmatis, M. phlei). c) Se o crescimento de colônias de BAAR for obtido acima de 15 dias (microrganismos de crescimento lento), deve-se realizar a reação da niacina. Colônias rugosas com reação positiva, indicam M. tuberculosis. Colônias pequenas e planas com reação negativa, indicam M. bovis, cepa BCG, ou micobactérias patogênicos para coelhos e cobaias. Colônias semiesféricas e lisas com reação negativa, devem ser subcultivadas a 37 C em dois tubos com meio de Löwenstein-Jensen, sendo um mantido na luz e o outro, enrolado em papel de alumínio, mantido no escuro. Se formar pigmento amarelo a laranja no tubo mantido na luz, e nenhum pigmento no tubo mantido no escuro, identifica-se como M. kansaii.

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