USO DA RADIACAO DE SINCROTRON EM CRISTALOGRAFIA

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1 USO DA RADIACAO DE SINCROTRON EM CRISTALOGRAFIA Yvonne Primerano Hascarenhas Instituto de Física e Quíaica de São Carlos - USP ESTRUTURAL RESUMO Métodos experimentais e teóricos atualmente bem desenvolvidos permitem a determinação e refinamento de estruturas moleculares em duas gamas: moléculas pequenas (-100 átomos por unj_ dade assimétrica, excetuando-se os hidrogênios) e de macromoléctj Ias. No Brasil apenas se realiza trabalhos de pesquisa na área de moléculas pequenas determinando-se estruturas de complexos de metais com ligantes orgânicos, de produtos naturais, de fármacos e de compostos orgânicos e inorgânicos obtidos por síntese. Tais pesquisas são realizadas por pesquisadores das seguintes Universidades: UFA1, UFGo, UFMG, UFPr, UFSC, Campus da USP de São Carlos e UNESP (Campus de Araraquara e Presidente Prudente). Entr tanto apenas o grupo do Instituto de Física e Química de São Ca_r los possui um difratamento automático para monocrist ais,cujo uso é estendido aos demais. No IFQSC se desenvolve há algum tempo um esforço para iniciar atividades na área de macromo(êcu1 as. Os resultados desse esforço são por enquanto modestos na área experimental mas já surgem os primeiros resultados interessantes na área teórica. 0 uso da radiação-x de sincrotron, devido ao seu alto brilho e larga distribuição espectral contínua é vantajosa em cristalografia estrutural principalmente na área de macromol cuias devido aos seguintes fatores: a) baixa intensidade de espalhamento dos cristais, b) grande número de reflexões a registrar o que aliado â baixa intensidade obriga a tempos de medida muito grandes, c) possibilidade de monocromat i zação de comprimeji to de onda correspondente ã aresta de absorção de algum espalhador de interesse existente na molécula com o objetivo de resolver o problema da fase, d) redução do problema de dano por radiação sempre presente nos cristais utilizados para coleta de dados. (UJ trás áreas da cristalografia estrutural que também poderão se be_ neficiar devido â alta colimação do feixe em relação ã das fontes convencionais são: a) estudos de deformação de densidade e- letrônica, utilizando comprimentos de ondas de -0.2 a 0.3 A, com o objetivo de evitar as correções por extinção prinária e secundária, b) refinamento de estruturas utilizando amostras policris_ talinas por análise do perfil dos picos de d if ração registrados (Método de Rietveld). 1. INTRODUÇÃO Como é bem conhecido, o uso dos métodos de difração de raíos-x para a determinação de estruturas cristalinas, baseia-se essencialmente no fato de que o intervalo de comprimento de onda adequado ã obtenção de resolução atômica está compreendido nessa faixa do espectro da radiação eletromagnética. A realização do 82

2 objetivo almejado, i.e., a obtenção da imagem do objeto iluminado pelos raios-x, encontra como obstáculo fundamental o fato de ser impossfvei fabricar as lentes necessárias ã construção do sis tema óptico adequado para a focai ização da radiação espalhada. ls_ to acontece porque o índice de refração dos raios-x é muito próximo da unidade para todos os materiais. A única opção que resta é a de desenvolver métodos matemáticos de cálculo da imagem a partir das medidas de intensidj» des dos feixes espalhados. É bem conhecido que a função de esp lhamento pode ser calculada a partir da função densidade eletrônica do objeto espalhador através da obtenção da sua transformada de Fourier e reciprocamente que a partir do conhecimento da fu ção de espalhamento pode-se obter a imagem do objetivo espalhador fazendo-se a transformação de Fourier inversa. 2. ESPALHAMENTO DOS RAIOS-X POR UMA MOLÉCULA 0 espal hamento dos raios-x pela matéria se dá essenci a_l_ mente através da interação do campo elétrico da onda incidente com os elétrons do objeto espalhador. Assim se considerarmos uma tunica molécula rígida (em repouso) podemos descrever a onda esp lhada em termos da sua densidade eletrônica. Na fig. 1 consideremos os pontos 0 e P. A diferença de fase entre as ondas espalhadas pelos elétrons situados nesses dois pontos é: A<f> 2ir 7 (t -%o) * 2TÍ 7. s d e r é o v e t o r p o s i ç ã o de P em r e l a ç ã o a 0,? * So * l/a, X c o m p r i m e n t o d e o n d a da r a d i a ç ã o u t i l i z a d a e s «2 s e n 9/X. Figura 1 83

3 Tomando-se o ponto 0 como origem, pode-se dizer que a onda espalhada por um elemento de volume dv situado em p tem uma amplitude proporcional ao número.de elétrons contido em dv e fase <J>*2irr.s. Assim a amplitude de onda espalhada pela molécula como um todo será função de uma grandeza denominada fator de estrutura F(s) que incorpora essas características:a(s)-f(s) vol. molecular p (r) exp (2iri r. s) dv Facilmente podemos reconhecer a expressão acima como a transformada de Fourier da densidade eletrônica p(r). 0 espaço onde se define a radiação espalhada é usualmente denominada espaço recíproco e a função F(s) é aí descrita. Assim sendo, a densidade eletrônica pode ser obtida calculando-se a transformada de sua transformada: p(r) - J vo1. do espaço de d i f ração F(s) exp(-2iri r.s) dv s Entretanto, se nos fixamos agora nos dados experimentais a que temos acesso, notaremos que a grandeza experimentalme te medida é? intensidade da ondj espalhada que esta relacionada matematicamente com o fator dt estrutura da molécula porém de tal forma que não nos permite reconstruir toda a informação necessária ã sua definição, i.e., amplitude e fase pois I - F 2 - F. F* I - Fe^.Fe"'* - JF 2 e a informação relativa à fase foi perdida. Este fato ê o famoso problema da fase e constituí o principal obstáculo ã determinação das estruturas moleculares.

4 3. ESPALHAMENTO DE RAIOS-X POR CONJUNTOS DE MOLÉCULAS As amostras a serem analisadas por raios-x são compostos por um grande número de rroléculas. Estas moléculas poderão se apresentar numa fase desordenada, quando sob forma gasosa, l_í quida ou de sólido amorfo ou numa fase ordenada constituindo um cristal. As fases amorfas serão analisadas por outro autor e nos deteremos aqui na análise das fases cristalinas. Nos cristais temos periodicidade tri-dimensionai entre as moléculas e as diferenças de caminho ótico entre os feixes d_i_ fratados por cada molécula serão fixos permitindo que a interação entre os mesmos resulte agora numa figura de difração. Nessa fj_ gura de difração sempre que a diferença de caminho ótico for nula ou múltipla do comprimento de onda haverá reforço de feixe e palhado, obtendo-se uma amplitude Igual ã soma das amplitudes da onda espalhada naquela direção por todas as moléculas e zero em todas as outras direções. A intensidade da onda difratada será a s s i m d e s c o n t í n u a e p e r i ó d i c a com uma a m p l i t u d e q u e depende da es^ trutura molecular. Tal periodicidade da função que descreve a radiação difratada pelo cristal permite a definição de um conju to periódico de pontos denominado retículo recíproco em analogia ao retículo crista'ino que defina J cela unitária do cristal. W.C Bragg deu uma interpretação simplificada do fenõme no de difração pelos cristais em termos da reflexão da radiação por famílias de planos reticulares paralelos de espaçamento interplanar. Assim, considerando o retículo cristalino na figura 2, somente haverá reforço dos feixes refletidos quando a diferejj ça de caminho ótico entre os feixes refletidos por dois planos su cessivos for igual a um número inteiro de comprimentos de onda. Isto leva facilmente â lei de Bragg. nx * 2<J hk sen9 onde 8 é o ângulo de incidência - ang. de reflexão, hkl são os índices de Miller do plano refletor, (i.e., números inteiros que individualizam a família de planos paralelos cuja distância interpianar é d), ^ comp. de onda de radiação usada e n ordem de difração. 85

5 (hkl) (hkl) (hkl) Figura 2 4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL í». 1. ASPECTOS GERAIS A obtenção dos dados experimentais necessários ã dete minação de estruturas cristalinas consiste essencialmente na medida da direção e intensidade de todos os feixes difratados pela amostra. Pode-se avaliar, que mesmo nas melhores condições, a ijn tensidade total da radiação difratada é apenas uma pequena fração, cerca de 1%, da intensidade do feixe incidente '. A precj^ são na medida da intensidade dos feixes difratados está condicio nada ao valor da própria intensidade medida. Assim tem-se que e_ xecutar as medidas fazendo-se um compromisso entre o tempo de me_ dida e a própria intensidade. Deveremos então considerar os seguintes fatores: a) Natureza das substâncias cuja estrutura se deseja determinar:- Pode-se de um modo geral afirmar que os métodos de determinação de estrutura atualmente existentes permitem resolver estruturas de moléculas pequenas (assim classificadas quando e- xistem até cerca de 100 átomos, sem contar os hídrogênios,na unj_ dade assimétrica) e de macromo1éculas com mais de cerca de 500 tomos. No caso de moléculas pequenas estão bem estabelecidos mé (2) ~* todo» tais como o método de Patterson e os métodos diretos,que em geral permitem resolver o problema de fase. No caso das macromoiéculas utiliza-se essencialmente o método de substituição isomórfica, e a contribuição do espalhamento anômalo nas reflexões relacionadas por um centro de inver- 86

6 são (o chamado par de Friedel). Fm geral por este método coti segue-se resolver o problema da fase a baixa resolução. A exten são da solução em alta resolução pode ser conseguida por técnicas de refinamento ou pela utilização dos métodos diretos. Esta é ainda uma área muito ativ» de pesquisa metodológica. b) N ú m e r o s de r e f l e x õ e s a m r d i r:- A d e t e riri n a ç ã o d e e s t r u- turas moleculares por difraçao visa â obtenção da imagem da mol cuia. A resolução dessa imagem é função do comprimento de onda da radiação utilizada e do máximo ângulo 26 em que são medidas Í tensidades dos feixes difiatadcs. Usualmente, no caso de molécjj Ias pequenas, tem-se que medir cerca de 1000 a 5000 reflexões p ra ter resolução atômica. No caso de macromo1écu1 as, esse número, dependendo da resolução desejada e do volume da cela unitária, em geral é muito maior. Assim, para o caso da molécula de mioglobina (apenas 151 amino ãc r dos) o número de reflexões a meo o dir para resolução de 6.0 A, 2.0 e 1.5 A é respectivamente 4C0, 9600 e c) Intensidade de cada reflexão a medir:- As intensidades podem ser registradas fotograficanente ou por técnicas de contagem. Em ambos os casos, o desvio estatístico das medidas depende do próprio valor da intensidade integrada. E um fato bem conhecido que para um mesmo valor de ângulo 20 da reflexão, mantidos outros parâmetros constantes, a intensidade é menor quanto maior a compiexibii idade da estrutura. Assim, as intensidades das reflexões de macromo1écu1 as são bem menores que para o caso de moléculas pequenas, exigindo por essa razão maiores tempos de co_n tagem CVJ de exposição. d) Dano por radiação:- Os cristais a serem estudados são normalmente submetidos a longos períodos de irradiação, enquanto se faz a medida das intensidades das reflexões. Em muitos casos, ocorrem danos por irradiação que causim decomposição ou perda da monocr i s t a 1 í n i dade da amostra. Este» efeitos ocorrem com pouca freqüência nos cristais de moléculas pequenas mas são o caso geral com as macromo1êeu 1 is. e) Natureza da fonte de raios-x utilizada:- As fontes convencionais freqüentemente utilizadas são: geradores de 1 a 3 KW de potência e que utilizam tubos selados, e geradores de até 12 kw de potência que utilizam tubos não selados de anodo rotatório 87

7 Em contraposição a essas fontes convencionais temos a radiação de sincrotron que dependendo das características do mesmo pode fornecer radiação na faixa dos raios-x adequados para determinação de estruturas cristalinas. Uma comparação e;.tre as características dessas fontes de raios-x foi apresentada por outro participante. Assim, faremos a seguir uma análise da utilização dessas fontes levando-se em conta alguns fatores acima mencionados. Discutiremos em sep rado o caso das moléculas pequenas e macromolécu1 as. í».2. MOLÉCULAS PEQUENAS 0 uso da radiação de sincrotron traz em geral apenas a vantagem de uma coleta de dados mais rápida. Entretanto, há dois casos específicos em que a radiação de sincrotron poderá dar resultados impossíveis de obter de outra forma: a) coleta de dados usando monocristais muito pequenos,da or_ dem de centésimos de milímetros; b) na determinação de deformações da densidade eletrônica dos elétrons de ligação e deformações devidas a polarização da nuvem eletrônica. Estas determinações exigem grande precisão na ava liação dos F.. j sendo indispensável a avaliação das correções por extinção primária e secundária. Estas extinções seriam min_i_ o mizadas usando-se um X de cerca de 0,2 a 0.3 A e a alta co1imação possível com radiação de sincrotron 4.3. MACROMOLÉCULAS Ê nestas que o uso de radiação de sincrotron é inegavelmente superior. Salientaremos os seguintes aspectos: a) Grande número de reflexões a medir:- Sendo esta fonte cerca de 10 vezes mais intensa que a raio Ka do cobre, a inten sldade difratada será igualmente mais intensa consumindo proporcionalmente menor tempo no registro do grande número de reflexões geradas pelo monocristal de macromolécula. 88

8 b) Utilização de espalhamento anômalo quer no caso de dete mi nação de fases por método de s^vr r i tu i ção 'somórfica, quer ut_i_ lizando um espalhador anômalo > p*5pria molécula. 0 uso da radiação no comprimento de r ' correspondente ã aresta de abso ção do espalhador anômala ~ extremamente facilitada no sincrotron pois pode ser obtida i>j f simples monocromat i zação a partir da r diação branca. c) Danos r " ad i ação: - "Jm resultado extremamente agradável no que tange * danos por radiação surgiu desde os primeiros tra bathos p'ando verificou-se que ao contrario do que se suspeitava intuitivamente, os danos de radiação foram menores que nas experiências com fontes convencionais. Isto está possivelmente associado a efeitos cooperativos e de migração dos defeitos de modo que o tempo mais curto gasto na coleta de dados impede que os efeitos deletérios da radiação se manifestem. Além disso, isto possibilita que todos os dados sejam colhidos utilizando apenas um cristal, evitando-se a necessidade de colocar na mesma escala dados colhidos com vários cristais. A qualidade dos dados de i tensidade é dessa forma substancialmente muito melhor, permitindo um refinamento muito mais preciso da estrutura, isto é,uma Io calização acurada das posições atômicas, ias interações da macro molécula com moléculas de solvente e ao estudo da flexibilidade da estrutura da macromoiécu1 a em relação às respectivas estruturas secundária, terciária e quaternária. d) Experimentos em tempo real:- A RS, devido ã sua alta in tensidade, já está sendo utilizada no estudo da dinâmica das variações estruturais reversíveis em moléculas de proteínas,que podem ser periodicamente estimuladas. Exemplos de estudos de gran de interesse seriam: (1) fotod i ssocí ação provocada por pulsos de luz de um laser, medindo-se em sincronia as intensidades dos raios-x difratados imediatamente antes e após o pulso e (2) variações estruturais do sítio ativo de uma enzima ao interagir com um substrato da estrutura das macromoiécui as em relação às respectivas estruturas secundárias, terciárias e quaternárias. 89

9 5. SITUAÇÃO DA CRISTALOGRAFIA ESTRUTURAL NO BRASIL A Cristalografia Estrutural no Brasil ê relativamente incipiente. Um único grupo (o do IFQSC) possui os equipamentos necessários e seu principal esforço tem sido voltado ã preparação de pessoal e interação com outros grupos de pesquisa do pafs visando tornar assim a técnica acessível e despertar o interesse em seu desenvolvimento em outros centros de pesquisa. 0 Laboratório de Cristalografia do IFQSC estende o uso de seus equipamentos a vários centros, na maioria dos quais estão sediados pesquisadores que realizaram treinamento põs-grad^a do em cristalografia estrutural em São Carlos: Departamento de Física e Química, Universidade Federal do Paraná; Departamento de Química do Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal de Minas Gerais; Instituto de Física e Matemática da Universidade Federal de Goiás; Instituto de Ciências Ambientais de Presiden te Prudente, UNESP; Departamento de Química da Universidade Fed ral de Alagoas; Departamentos de Engenharia Química e de Ciência dos Materiais da UFSCar; Instituto de Física, USP; Departamento de Física da Universidade Federal de Santa Catarina. A pesquisa realizada até agora é essencialmente voltada ã determinação de estrutura cristalina de moléculas pequenas tais como: 1) Substâncias inorgânicas sintéticas, em geral envolvendo metais com ligantes orgânicos ou inorgânicos. 2) Produtos naturais extraídos da nossa flora. 3) Compostos orgânicos sintéticos e fatmaco:, Das colaborações havidas entre o grupo de São Carlos e os demais grupos resultam nos últimos três anos 10 publicações em revistas internacionais especializadas com arbitre, 22 comunicações em congressos internacionais e 31 comunicações em congressos nacionais. Um esforço vem sendo feito para iniciar trabalhos de pesquisa na área de macromoléeulas sendo que os esforços iniciais estão voltados para a obtenção de monocristais de algumas protei nas em colaboração com o grupo de bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto na área de toxinas de escorpião e ofídi cas. Esta etapa sendo vencida, teremos condições para esperar por um futuro bastante promissor para o estabelecimento dessa impor- 90

10 tante área de pesquisa, que certamente será beneficiada caso sejam levados adiante os planos de construção de um sincrotron no Brasil. 6. SUGESTÕES PARA 0 DESENVOLVIMENTO DA CRISTALOGRAFIA ESTRUTURAL DE MACROMOLECULAS Acreditamos que prevalecendo a idéia da construção do Sincrotron no Brasil, deveríamos intensificar os programas de t re i- namento de cristalôgrafos estruturais nessa área e proporcionar condições para o estabelecimento de um ambiente interdiseipiinar nos Laboratórios de Cristalografia. Sob um ponto de vista prátj_ co, acreditamos que seria importante aglutinar em torno desse projeto biofísicos, cristalôgrafos, bioquímicos e especialistas em computação de modo a criar condições de intensa dedicação a todos os aspectos da problemática da área. BIBLIOGRAFIA 1. Cullity, B.D., Elements of X-ray diffraction, Addison-Wesley Pub)ishing Co., Inc. 2. Woolfson, M.M., An introduction of X-ray crystallography. Cambridge, at the University Press. 3. Blundell, T.L. Johnson, L.N., Protein crystal lography, Academi c Press. k. FeiI, D., comunicação particular. 5. Phytlips, J.C. & Hodyson, K.D., Single crystal X-ray diffraction scattering using synchrotron radiation, em "Synchrotron Radia tion Research", H. Winiek 6 S. Doniach, Ed., Plenum Press. 6. Bartinik, H.O.; Fourme, R. & Phillips, J.C., MacromoI ecu 1ar Crystallography, em "Uses of Synchrotron Radiation", H.B. Stuhrman, Ed., Academic Press, London, 1982.

1. 3 2. 4 3. 4 4. 5 5. 6 6. 8 7. 9 8. 12 9. 16 10. 17 11. O

1. 3 2. 4 3. 4 4. 5 5. 6 6. 8 7. 9 8. 12 9. 16 10. 17 11. O 1 DIFRAÇÃO DE RAIOS X Prof. Dr. Walter Filgueira de Azevedo Jr. Laboratório de Sistemas Biomoleculares. Departamento de Física-Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas-UNESP, São José do Rio

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