Aspectos celulares e moleculares da resposta imunitária a Leishmania spp. Cellular and molecular aspects of immune response to Leishmania spp

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1 ARTIGO DE REVISÃO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Aspectos celulares e moleculares da resposta imunitária a Leishmania spp Cellular and molecular aspects of immune response to Leishmania spp José C.C. de Freitas*, Diana C.S.N. Pinheiro Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-Ceará Resumo: O sistema imunitário apresenta funcionamento complexo e envolve interações específicas entre os seus componentes, conferindo imunidade inata e adquirida ao indivíduo. A integração entre os sistemas inato e adaptativo trabalha de uma maneira orquestrada para a manutenção da homeostase do organismo. Dentre os agentes invasores destacam-se parasitos intracelulares como Leishmania spp. A resposta imunitária a Leishmania é iniciada no local de entrada do parasito, através das células sentinelas, onde as formas promastigotas são interiorizadas, promovendo a ativação da resposta imunitária. A interação de PAMPs nos patógenos com Toll-Like Receptors das células sentinelas desencadeará a ativação de fatores de transcrição, como o NF-κB e NF-AT, que estão envolvidos na ativação de genes que codificam para citocinas, como TNF-α, IL-1 e IL-12, quimiocinas, e a óxido nítrico sintetase induzível. A resposta imune direcionada por Th1, mediada por Interferon-γ e TNF-α, predominante nos cães assintomáticos tem sido relacionada à resistência à doença, enquanto que a resposta imune mediada por Th2, com produção de IL-4 e IL-10, é relatada nos casos sintomáticos. Embora o papel das citocinas liberadas por Th2 nos casos sintomáticos seja controverso, há evidências de sua correlação com a progressão da doença. Vêm sendo discutidas as atuações dos neutrófilos, mastócitos, basófilos, células natural killer (NK), linfócitos TCD8+ e T regulatórios (Treg) na leishmaniose. O estudo da resposta imunitária hospedeiro-parasito como fator de desencadeamento e severidade das lesões patológicas é essencial para melhor compreensão e caracterização da doença. Palavras-chave: Resposta imunitária, Leishmania spp, Células, Mediadores Summary: The immune system shows complex operation and involves specific interactions between its components, providing innate and acquired immunity to the individual. The integration between the innate and adaptive systems works in an orchestrated manner to maintain homeostasis. Among the invaders agents stand out intracellular parasites like Leishmania spp. The immune response to Leishmania starts at the entrance of the parasite, through the sentinel cells, where the promastigotes are internalized by promoting the activation of the immune response. The interaction of PAMPs on pathogens with Toll-Like Receptors of sentinel cells trigger the activation *Correspondência: joseclaudiocarneiro@yahoo.com.br Tel: +(55) ; Fax: +(55) of transcription factors such as NF-κB and NF-AT, which are involved in the activation of genes coding for cytokines such as TNF-α, IL-1 and IL-12, chemokines, and inducible nitric oxide synthase. The immune response directed by Th1 mediated by Interferon-γ and TNF-α, predominantly in asymptomatic dogs has been linked to disease resistance, while the immune response mediated by Th2 cells, with production of IL-4 and IL-10 is reported in symptomatic cases. Although the role of cytokines released by Th2 cells in symptomatic cases is controversial, there is evidence of its correlation with disease progression. Have been discussed the actions of neutrophils, mast cells, basophils, natural killer cells (NK), TCD8+ lymphocytes and T regulatory (Treg) in leishmaniasis. The study of immune response host-parasite as a factor in triggering and severity of pathological lesions is essential for better understanding and characterization of the disease. Keywords: Immune response, Leishmania spp, Cells, Mediators Introdução As leishmanioses são antropozoonoses, causadas por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania, consideradas um problema de saúde pública, representando um complexo de doenças com importante diversidade epidemiológica e espectro clínico, que incluem as formas: cutânea, mucocutânea e visceral (Ministério da Saúde do Brasil, 2006). Leishmania spp são parasitos digenéticos que se desenvolvem com a forma promastigota no aparelho digestivo de insetos flebotomíneos e com a forma amastigota intracelular no sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados, como os cães e humanos (Awasthi et al., 2004). O controle das leishmanioses é feito através do combate ao inseto vetor, detecção dos reservatórios e tratamento dos casos humanos (Santiago et al., 2008). Já o controle da leishmaniose canina (LCan) é baseado na detecção e sacrifício dos cães soropositivos para a doença, conforme norma da Organização Mundial de Saúde (OMS). Numerosos estudos apontam para uma variedade de fatores que contribuem para o estabelecimento da 11

2 leishmaniose como, características do parasito, relação parasito-hospedeiro e a resposta imunitária ao parasito. O estudo da resposta imunitária à Leishmania spp é essencial para a compreensão da dinâmica do parasito no hospedeiro e caracterização da doença. As leishmanioses são caracterizadas por apatia, perda de peso, alopecia, hepato-esplenomegalia, linfadenopatia, complicações renais e sistêmicas. Esses sinais e sintomas estão correlacionados às formas clínicas da doença. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo fazer uma revisão descrevendo aspectos celulares e moleculares associados à resposta imunitária à Leishmania spp. Resposta imunitária na leishmaniose canina O sistema imunitário apresenta funcionamento complexo e envolve interações específicas entre os seus componentes e entre os diferentes parasitos. A atuação do sistema imunitário confere ao indivíduo a imunidade nas formas inata e adquirida, dirigidas em resposta a um antígeno. Apesar de a resposta imunitária adaptativa ser induzida especificamente, uma integração entre o sistema inato e adaptativo trabalha de uma maneira orquestrada para a manutenção da integridade do organismo do indivíduo. Dentre os agentes invasores estão os protozoários que apresentam uma grande variação estrutural entre espécies e, por isso, não é surpreendente que ativem diferentes respostas imunes específicas. Leishmania spp apresenta uma ampla variedade antigênica que permite a interação com as células do hospedeiro na promoção de sinais desencadeadores da liberação de mediadores e ativação de células da resposta imunitária inata e adaptativa. São parasitos intracelulares obrigatórios que invadem preferencialmente macrófagos ou células dendríticas, que estão envolvidas não só na destruição do parasito, mas na liberação de mediadores envolvidos na interação parasito-hospedeiro (Martinez et al., 2009). Imunidade inata A resposta imunitária a Leishmania é iniciada no local de entrada do parasito através das células sentinelas, incluindo células dendríticas e macrófagos, onde as formas promastigotas de Leishmania spp são interiorizadas por um processo chamado de fagocitose, formando um fagossomo que se une com lisossomos para formar um fagolisossomo (Rittig e Bogdan, 2000). Esse processo é realizado por um grupo de "fagócitos profissionais" e tem como alvo micro- -organismos, que são englobados em um compartimento celular no qual os mesmos podem ser mortos (Handman e Bullen, 2002). Os patógenos, dentre eles os protozoários, podem ser reconhecidos por fagócitos através das proteínas moleculares associadas ao patógeno (PAMPs) que interagem com receptores de reconhecimento de patógenos (PPRs) expressos nos fagócitos. Acredita-se, que esse reconhecimento sirva para a ativação da imunidade inata, bem como um sinal para os processos da imunidade adquirida (Muzio et al., 2000; Ross, 2000; Gordon, 2002; Janeway e Medzhitov, 2002). PAMPs estão presentes entre todas as classes de patógenos e podem representar um sinal em particular de cada classe. Uma característica comum de todos os PAMPS é que eles são produzidos por micro-organismos, mas nunca pelas células hospedeiras. Portanto, a detecção dos PAMPs pelos PPRs, dentre eles os receptores Toll-like (TLRs) pode representar o reconhecimento imune, com diferenciação entre "self" e "nonself" (Medzhitov e Janeway, 1997; Schnare et al., 2001). Muitas proteínas de Leishmania spp que já foram identificadas são expressas na forma amastigota e na forma promastigota. Essas proteínas contêm numerosos aminoácidos repetidos que representam uma alta porcentagem (75%) do total da molécula. Muitos genes são apresentados em cópias múltiplas, mas é desconhecido como essas cópias são expressas e como elas são usadas pelo parasito. Essas cópias múltiplas são capazes de produzir várias proteínas isoformes que devem favorecer a adaptabilidade do parasito. Algumas dessas características podem ser elucidadas no estudo do proteoma de Leishmania e relatadas para o genoma (Kubar e Fragaki, 2006). Portanto, essas proteínas estão relacionadas com a virulência e a resposta imunitária do hospedeiro ao parasito. Proteínas A2 expressas em amastigotas e LMPK expressas em promastigotas são fatores de virulência encontrados em várias espécies de Leishmania que tem papel importante na sobrevivência do parasito no hospedeiro mamífero, pois na ausência das mesmas os hospedeiros foram capazes de controlar a infecção (Wiese e Gorcke, 2001). As promastigotas "lmpk- -deleted" podem ser usadas como vacina, principalmente em cães, com infecção causada por L. infantum (Kubar e Fragaki, 2006). Outros fatores de virulência estão incluídos no potencial de sobrevivência do parasito: LPG (Turco et al., 2001), cisteina proteinase (Mottram et al., 1998), gp63 (Yao et al., 2003) e CRK3 (Hassan et al., 2001). O potencial de virulência do Lepp 12 permanece ainda incerto. Como L. major é a espécie que vem sendo estudada mais exaustivamente pelos imunologistas, existem menos informações sobre a forma visceral da doença do que a forma tegumentar (Fragaki et al., 2003). TLRs são uma família de receptores transmembrana com estrutura altamente conservada que reconhecem 12

3 produtos do metabolismo microbiano (PAMPS), ativam uma resposta imunitária específica ao patógeno (Trinchieri e Sher, 2007). Reconhecimento de um patógeno único pode envolver a ativação de múltiplos TLRs. São os únicos receptores que medeiam diretamente a maturação das células dendríticas. Além disso, o fato que eles são diferentemente expressos entre os subtipos de células dendríticas sugere que já estão diferencialmente ativados de acordo com os patógenos desafiados (Kelsall et al., 2002), induzindo a produção de diferentes citocinas em um único tipo de célula dendritica ou secretando diferentes citocinas em distintos subtipos de células dendríticas (Reis e Sousa, 2004). A interação TLR com PAMPs desencadeará a ativação de fatores de transcrição envolvidos na ativação de genes que codificam para diversas citocinas e síntese de outras moléculas (Grazzinelli e Denkers, 2006). Uma resposta imunitária adaptativa eficiente não requer somente a apresentação do antígeno no contexto do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), mas também depende da ativação de sinais acessórios, como fatores co-estimulatórios e citocinas, nas APCs. TLRs expressos nas APCs podem regular esses sinais acessórios através do reconhecimento dos PAMPs e, conseqüentemente, controlar a ativação da resposta imunitária adaptativa antígeno-específica (Schnare et al., 2001). A fagocitose requer uma interação seqüencial e circunferencial entre receptores especializados na superfície das células fagocíticas e ligantes complementares na superfície das partículas fagocitadas. Como as promastigotas de Leishmania spp aderem aos fagócitos na região polar, pode-se então presumir que sua internalização é feita pelo alongamento de pseudópodes em torno do parasito de forma radial. A localização no sítio intracelular da Leishmania spp é predominantemente no vacúolo parasitófago (VP), podendo residir individualmente ou em grandes vacúolos com várias formas amastigotas (Rittig e Bogdan, 2000). Entretanto, estudos em pacientes com a forma cutânea foram observados um pequeno número de formas amastigotas na região citosólica da célula, e a partir de então foi verificada a possibilidade, de nesses casos, ser induzida a resposta imunitária mediada pelo MHC de classe I (Rittig e Bogdan, 2000). Uma vez dentro do fagócito mononuclear, as promastigotas sofrem significantes alterações bioquímicas e metabólicas, as quais resultam na forma intracelular obrigatória a amastigota. As formas amastigotas de Leishmania spp desenvolveram mecanismos para subverter e escapar da ação dos macrófagos, podendo reinvadir células dendríticas e fibroblastos, bem como novos macrófagos (Rittig e Bogdan, 2000; Handman e Bullen, 2002). O principal mecanismo de liberação das formas amastigotas no meio extracelular é feito de forma mecânica, pela elevada multiplicação intracelular (Handman e Spira, 1977). Por outro lado, também foi observado que Leishmania, no interior do fagolisossomo tem a capacidade de influenciar o sistema vacuolar da célula hospedeira, sugerindo que as amastigotas recrutem a maquinaria de exocitose auxiliando a liberação mecânica (Rittig e Bogdan, 2000). Recentes estudos demonstraram que a entrada e sobrevivência de Leishmania spp dentro de macrófagos, só são possíveis com a prévia infecção de neutrófilos que são recrutados como uma resposta normal à picada do inseto. Novos achados indicam que Leishmania spp são capazes de infectar os neutrófilos, sendo estes fagocitados por macrófagos, e assim desencadear um processo no macrófago conhecido como modelo "cavalo de Tróia" (Jochim e Teixeira, 2009). Macrófagos são células frequentes no local da infecção causada por Leishmania spp e apresentam múltiplas funções: servem como células hospedeiras na multiplicação do parasito, como célula apresentadora de antígenos e como células produtoras de citocinas moduladoras da resposta mediada por linfócitos T. Estas células medeiam a ativação de células Th1 que agem sobre os macrógafos infectados como efetores para a morte intracelular do parasito (Zer et al., 2001). Os macrófagos são oriundos da migração dos monócitos ao sítio infeccioso, que ocorre nos estágios iniciais após a picada do inseto, promovida pelos produtos da saliva do inseto vetor. A maturação destas células se dá pelo processamento antigênico, induzindo sua ativação e produção de mediadores, como as quimiocinas, dentre elas podemos citar a proteína inflamatória macrofágica (MIP-1β) (van Zandbergen et al., 2004). Nessa situação, os macrófagos são capazes de liberar citocinas que agirão diretamente na ativação e recrutamento de células T. Essas células desempenham papel muito importante, tanto diretamente, por mediarem respostas celulares na ativação dos próprios macrófagos residentes, quanto indiretamente, na regulação e produção de anticorpos produzidos por plasmócitos que derivam de linfócitos B (Teixeira et al., 2006; Martinez et al., 2009). Alguns fatores têm a capacidade de influenciar a resposta imunitária a Leishmania spp, participando diretamente na resistência ou susceptibilidade à doença, dentre eles podemos citar os mediadores inflamatórios e outras moléculas. Os leucotrienos (LTB4) e o fator de ativação plaquetária (PAF) participam diretamente no processo de resistência à infecção, agindo diretamente nos macrófagos, estimulando o aumento da produção de óxido nítrico (Serezani et al., 2006; Santiago et al., 2006). Já as prostaglandinas (PGE2), o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), a adenosina e o fator indutor de hipóxia-1 estão diretamente relacionados aos processos que desencadeiem suscep- 13

4 tibilidade a infecção, onde PGE2 e IGF-1 interferem diretamente na produção do óxido nítrico pelos macrófagos (Maioli et al., 2004; Guimarães et al., 2006; Degrossoli et al., 2007; Vendrame et al., 2007). Outras células apresentadoras de antígenos (APCs), como é o caso das células dendríticas (CD), são consideradas importante vínculo entre a resposta imunitária inata e adaptativa numa infecção causada por Leishmania spp. CDs são um grupo heterogêneo e largamente distribuído de células migratórias, derivadas da medula-óssea, especializadas no reconhecimento, apreensão, transporte e processamento de antígenos patógenos. Na resposta imunitária inata e adaptativa ativam as células NK e os linfócitos T virgens (Granucci et al., 2004) e estão envolvidas na indução da tolerância periférica aos antígenos próprios (Steinman et al., 2003). CD possuem múltiplos mecanismos de sobrevivência que podem detectar os patógenos direta ou indiretamente; então, podem representar um importante ponto pelo qual sinais associados ao patógeno ou à vacina são integrados e transmitidos ao sistema imunitário adaptativo. Com isso, podem capturar um patógeno invasor e migrar para os órgãos linfóides de drenagem mais próximos onde, depois da maturação, apresentam os antígenos processados para ativar as células T, desse modo induzindo a diferenciação das células ativadas em células T efetoras (Biron et al., 2002; Garg et al., 2007). As células de Langerhans (CL) são um específico subtipo de células dendríticas da pele que formam uma densa rede na camada suprabasal da epiderme. CL podem atuar como células sentinelas na epiderme e também parecem possuir funções protetoras numa infecção causada por Leishmania spp (Moreno, 2007). Durante muitos anos foi aceite que, numa infecção microbiana, as CL aprisionavam os antígenos dos parasitos e migravam para uma área dependente de células T no linfonodo de drenagem da pele, com o objetivo de apresentá-los às células T virgens, e esse ciclo ficou estabelecido como um paradigma para outras CD (Wilson e Villadangos, 2004). Entretanto, em estudos recentes, ficou demonstrado que outros subtipos de CD falharam na atividade do ciclo de vida tipificado pelas CL (Romani et al., 2006). Tem sido proposto então que, a resposta imunitária mediada pelas células T contra L. major é gerada pelas CD da derme e que as CL tem uma função regulatória instalada e devem ser responsáveis pela supressão da resposta inflamatória (Ritter e Osterloh, 2006). Os macrófagos ativados em função da interação com o parasito ou através das citocinas secretadas pelas células efetoras Th1 passam a produzir óxido nítrico (NO) o qual é requerido para uma efetiva destruição de um elevado número de patógenos, os quais podem ser citados: vírus, bactérias, protozoários, fungos e helmintos (Shin et al., 2000). NO é sintetizado por uma família de enzimas conhecidas como óxido nítrico sintetase (NOS), podendo esse evento ocorrer em diferentes tipos celulares (Bogdan et al., 2000), como produtos da ativação de genes relacionados a produção de fatores de transcrição ativados pela interação celular com o parasito. Estudos realizados in vitro sugerem que a óxido nítrico sintetase induzida (inos) apresente uma elevada importância na regulação e no processo efetivo de controle da multiplicação intracelular das formas amastigotas de Leishmania spp. Macrófagos caninos infectados in vitro e ativados por interferon-γ (INF-γ) apresentaram uma elevada expressão de NO (Sisto et al., 2001) e ao serem incubados com linfócitos de cães imunizados anteriormente, apresentaram aumento na produção de NO, subseqüente à liberação de INF-γ, além de uma significante série de apoptose, mediada por NO, das formas amastigotas intracelulares (Holzmuller et al., 2006). Já em estudos realizados in vivo, nos quais foram utilizados humanos e camundongos, foram sugeridos que a expressão de inos pelos macrófagos ativados era o principal mecanismo efetor no controle das leishmanioses (Serarslan e Atik, 2005). A síntese de NO pelos macrófagos ativados é mediada pelas citocinas derivadas pelas células Th1, dentre elas está principalmente o INF-γ (Bogdan et al., 2000). Devido a falta de estudos sobre a expressão de inos em testes in vivo utilizando cães infectados com Leishmania spp, Zafra et al. (2008) avaliaram o efeito do NO produzido a partir de inos em macrófagos ativados demonstrando um importante papel no controle da disseminação da infecção por Leishmania spp nos cães e que a combinação de macrófagos ativados e a elevada expressão de inos são capazes de destruir ou mesmo inibir a multiplicação de formas amastigotas, e por outro lado a baixa expressão de inos pelos macrófagos pode facilitar a multiplicação das formas amastigotas de Leishmania spp. Também foi sugerido que um mecanismo de escape utilizado pelos parasitos seria a inibição da expressão de inos nos macrófagos ativados, mas sem apresentar ainda dados definitivos para a afirmativa (Zafra et al., 2008). O reconhecimento do parasito e a produção de citocinas são os dois principais mecanismos estimulatórios para as células NK, e ambos estimulam suas respostas efetoras (Alli e Khar, 2004). Muitos avanços têm sido feitos no entendimento dos receptores que ativam e inibem a funcionalidade das células NK maduras, as citocinas iniciando pela produção do INF-γ e a atividade citolítica. Entretanto, pouco se sabe sobre outros aspectos da diferenciação das células NK. Estudos in vitro sugerem que as células NK podem se diferenciar pela produção de interleucina-10 (IL-10) (Grant et al., 2008) e devem apresentar atividades regulatórias (Deniz et al., 2008). Evidências sobre a regulação inibitória das células NK nas doenças infecciosas, como as leishmanioses, necessitam de 14

5 estudos mais aprofundados (Maroof et al., 2008). Durante infecção causada por L. donovani, o baço apresenta uma extensiva remodelação associada com a esplenomegalia, que pode estar associada também ao aumento do número de células NK (Kaye et al., 2004), que se acumulam promovendo aumento no número absoluto considerável no baço e nos granulomas hepáticos em camundongos infectados, além de representar outra fonte de IL-10. Além disso, confirmando a hipótese de que a inibição da expressão do gene da IL-10 seja uma característica encontrada no momento inicial da ativação das células NK, somente as células isoladas de organismos com a infecção estabelecida são capazes de suprimir a resistência do hospedeiro, função essa que está associada com o aumento do RNA mensageiro de IL-10 e da secreção de IL-10 (Maroof et al., 2008). O principal mecanismo de ativação das células NK se dá através de interação do lipofosfoglicano (LPG) do parasito com TLR-2, que sinaliza fatores de transcrição para a síntese de IL-10 (Becker et al., 2003). A aproximação e fagocitose de partículas são também facilitadas pelos receptores de complemento (RC), RC1 e RC3, que participam de ambos os processos. A interação do parasito com os receptores de complemento ocorre de três formas: na presença do soro pela ativação do componente C3 do complemento, através do processo soro-independente com a aproximação de glicoproteína (gp63) para RC3 e do LPG do parasito com o sítio específico de RC3 e RC1 (Handman, 1999). RC4 também apresenta papel importante no processo de fagocitose do parasito (Alexander e Russell, 1992). Basófilos e mastócitos são importantes células efetoras no processo inflamatório mediado por IgE. Os basófilos são raramente encontrados no sangue circulante, perfazendo menos de 1% dos leucócitos sanguíneos, além de normalmente não serem encontrados nos tecidos. Entretanto, eles podem ser recrutados para alguns sítios inflamatórios, como o local da picada de insetos, onde os antígenos estão presentes (Kawakami e Galli, 2002), sendo assim capazes de liberar mediadores pró-inflamatórios no local, corroborando para o estabelecimento do processo inflamatório. Sendo assim, os basófilos podem aparecer como auxiliares e subverter a função das CD na apresentação de antígenos. Quando isso ocorre, elevadas concentrações de IL-4 são produzidas pelos basófilos e mastócitos, ocorrem alterações do perfil imunológico, direcionando o sistema imunitário para uma resposta mediada por células Th2 e consequentemente por IgE (Yoshimoto et al., 2009). Durante uma infecção parasitária, o sistema imunitário controla tanto o número de parasitos presentes no organismo quanto à resistência a infecção, mas também pode induzir a doença associada ao parasitismo. As células T desempenham papel muito importante, tanto diretamente, por mediarem respostas celulares, quanto indiretamente, na regulação e produção de citocinas e anticorpos (Belkaid e Tarbell, 2009). A ativação e diferenciação de células Th1 têm sido associadas à TLR, fato esse ainda não demonstrado nas respostas mediadas por células Th2. As respostas mediadas por Th2 podem ser dependentes de outros, ainda não-caracterizados, tipos de PPRs (Schnare et al., 2001). O principal mecanismo de defesa contra protozoários que sobrevivem dentro de macrófagos é através da imunidade mediada por células, principalmente através da ativação dos próprios macrófagos, por citocinas derivadas das células Th1 (Martinez et al., 2009). Imunidade adquirida Os linfócitos T constituem-se de duas principais subpopulações: as células T CD4+ e as células T CD8+. Em resposta aos antígenos protéicos dos micro-organismos, as células T CD4+ auxiliares podem se diferenciar em subpopulações de células efetoras, que produzem distintos grupos de citocinas. As subpopulações de células T CD4+ auxiliares efetoras são denominadas de Th1, Th2 e Th17, sendo o INF-γ, a IL-2 e o TNF as citocinas características de Th1, e a IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 as citocinas características de Th2. O INF-γ secretado pelas células Th1 promove a diferenciação de Th1 e inibe a proliferação das células Th2. De outro modo, a IL-4 produzida pelas células Th2 promove a diferenciação das próprias células Th2 e, juntamente com IL-10, inibe a ativação das células Th1. A diferenciação para subpopulações de células Th1 e Th2 está relacionada a três fatores: as citocinas presentes no ambiente da estimulação, o tipo de célula apresentadora de antígeno e a natureza e quantidade do antígeno (Hailu et al., 2005). A IL-12 é a principal indutora das células Th1, indicando que essa citocina tem participação no processo de resistência à infecção, com conseqüente aumento da produção de INF-γ (Santos-Gomes et al., 2002). A principal função das Th1 é a defesa mediada por fagócitos, especialmente no combate a micro-organismos intracelulares; enquanto a de Th2 ocorre nas reações imunes mediadas por IgE e pelos eosinófilos/mastócitos (Hailu et al., 2005). Animais infectados com Leishmania spp podem desenvolver uma infecção sintomática resultando em morte, enquanto outros permanecem assintomáticos, ou desenvolvem um ou poucos sintomas e são classificados como oligossintomáticos (Barbieri, 2006). Os animais sintomáticos apresentam algumas alterações imunológicas que envolvem as células T, dentre elas a ausência de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) (Cardoso et al., 1998; Solano-Galego et al., 2000), diminuição do número de células T no sangue periférico (Martinez-Moreno et al., 1995; De Luna et 15

6 al., 1999) e ausência de INF-γ e IL-2 (Pinelli et al., 1995; 1999; Santos-Gomes et al., 2002). A resistência à infecção está associada à ativação de células T CD4+ Th1 específicas para Leishmania spp, que produzem INF-γ, IL-2 e o fator de necrose tumoral-γ (TNF-α) e, desse modo, ativam os macrófagos para destruírem as amastigotas intracelulares, via produção de óxido nítrico, como já foi demonstrado em estudo realizado com cães infectados com L. infantum (Vouldoukis et al., 1996). Já a participação das citocinas de Th2 na LCan ainda não foi bem definida. Entretanto, em infecções humanas com L. chagasi, o aumento da produção de IL-10 tem apresentado correlação com patologia (Ghalib et al., 1993). Fato esse que confirma que, a ativação de células Th2 resulta no aumento da sobrevivência do parasito e na exacerbação das lesões, em razão das ações supressivas de suas citocinas nos macrófagos (Brachelente et al., 2005). Evidências de uma resposta mista de Th1 e Th2 têm demonstrado o aparecimento de cães assintomáticos, com os níveis de IL-2, INF-γ e IL-10 aumentados. Entretanto, a produção de IL-2 e INF-γ predominaram nos cães assintomáticos e a expressão de IL-10 não foi conclusiva para as infecções sintomáticas (Santos-Gomes et al., 2002; Chamizo et al., 2005). A expressão aumentada de mrna IL-4 não foi observada nas células do sangue periférico dos cães assintomáticos, contudo essa citocina foi detectada em cães assintomáticos estimulados por antígeno leishmanial solúvel (SLA) (Chamizo et al., 2005). Já nos animais sintomáticos, IL-4 foi detectada em aspirados de medula óssea de cães que apresentavam os mais severos sinais clínicos da doença (Quinnell et al., 2001). Essa polarização não é regra geral para todos os casos de infecções causadas por Leishmania spp, e isso se deve ao fato da participação de células T regulatórias (Treg) (Miyara e Sakaguchi, 2007). Células Treg são subpopulações de células T que apresentam atividade supressiva, essenciais na manutenção da homeostase, através da interação célula-célula e/ou pela produção de citocinas como a IL-10 e TGF-β (Miyara e Sakaguchi, 2007, Belkaid e Tarbell, 2009). Essas células podem ser divididas em dois tipos principais, de acordo com sua origem, geração e mecanismo de ação: as células que expressam naturalmente o fator de transcrição forkhead box P3 (Foxp3 + ), que se desenvolvem normalmente no timo e as células Treg induzidas (itreg), que se desenvolvem no sangue periférico através de uma diferenciação das células CD4 +, depois de serem expostas a alguns sinais como citocinas regulatórias, drogas imunossupressivas ou a algumas APCs, adquirindo a capacidade de secretar IL-10 e TGF-β (Sakaguchi et al., 2008). Treg são classicamente definidas por expressarem a cadeia α do receptor para IL-2 (CD25). Além desta, também expressam membros da família do receptor para o TNF, CD39 e CD73, além de altos níveis de receptor para folato (Shevach et al., 2006; Deaglio et al., 2007; Yamaguchi et al., 2007). Entretanto, nenhum desses marcadores é especifico para as células Treg, podendo ser expressos por outras células T ativadas. Já o fator de transcrição Foxp3 é o principal marcador para as células Treg (Shevach et al., 2006). Ficou demonstrado que o Foxp3 orquestra os programas celulares e moleculares envolvidos na função das células Treg através da interação com outros fatores de transcrição como o fator nuclear de células T ativadas (NFAT) e fator nuclear k de células B ativadas (NF-κB). A atividade do fator nuclear de células T ativadas (NFAT) é controlada por cálcio e por proteínas dependentes de cálcio e formam complexos com NF-κB e promovem a expressão de IL-2 e IL-4, além de outros genes, que contribuem para a ativação das células T e sua diferenciação em células T efetoras (Sakaguchi et al., 2008). IL-2 tem fundamental importância para as funções das células Treg, propiciando a proliferação e diferenciação das células T. O receptor de IL-2 tem alta afinidade com o marcador CD25 que é essencial para o desenvolvimento das células Treg (Belkaid et al., 2002; Sakaguchi et al., 2008). A participação das células Treg no controle da infecção por L. infantum já foi descrita em humanos e camundongos (Gantt et al., 2003; Campanelli et al., 2006). A participação dos linfócitos T CD8 + na resistência a LCan ainda não está bem documentada. Esses linfócitos são normalmente detectados em cães assintomáticos e não nos cães sintomáticos, sugerindo que ocorra lise dos macrófagos pelo linfócito T citotóxico, representando então um mecanismo adicional na resistência à infecção (Pinelli et al., 1995). Colaborando com esse achado, em estudo realizado com cães infectados com L. infantum, foi observada uma redução dos níveis de células T CD4 + e T CD8 + e após o tratamento, os níveis normais dessas células foram reestabelecidos (Bourdoiseau et al., 1997). Diversos estudos já foram realizados com o objetivo de se elucidar o perfil de imunoglobulinas (Ig) nos cães. Vem sendo estudada o papel da IgG na resposta imunitária a Leishmania spp, sobretudo às subclasses de IgG: IgG1 IgG4. As concentrações séricas de IgG obedecem a ordem de IgG1 > IgG2 > IgG3 > IgG4, entretanto esses estudos precisam ser ainda mais aprofundados, principalmente no que se refere ao conhecimento da função de cada subclasse, como a habilidade de carrear proteínas e carboidratos, fixar complemento, opsonizar, entre outras. Além disso, ainda não há evidências que associe as subclasses de IgG caninas com populações imunoregulatórias específicas (i.e. Th1 versus Th2) ou uma resposta imunitária dominada por um perfil de citocinas polarizados (Day, 2007). Entretanto, alguns estudos vêm sendo realizados, onde se caracteriza o perfil de Ig na LCan. A partir de 16

7 então, chegou-se a conclusão de que a correlação direta entre a indução de altos títulos de IgG1 anti-leishmania e o aparecimento de sinais clínicos foi demonstrada em cães infectados, enquanto anticorpos IgG2 foram associados com cães assintomáticos (Iniesta et al., 2005). No entanto, em estudo realizado em cães com diferentes formas clínicas de LCan, foi observado que animais assintomáticos possuíam níveis de IgG1 elevados, que decaíam à medida que havia progressão dos sintomas, e que níveis elevados de IgG2 estariam associados com a morbidade (Reis, 2001). Também foi observada forte relação entre títulos de IgG total e IgG2 em cães sintomáticos (Almeida et al., 2005). Além disso, sugere-se que a produção policlonal de anticorpos anti-leishmania, que inclui também a produção de IgE, poderia caracterizar a resposta mediada por Th2 na LCan. A hipótese segundo a qual susceptibilidade e resistência estão associadas à produção de anticorpos específicos IgG1 e IgG2 ainda não foi confirmada (Quinnell et al., 2003). Tem sido sugerido que, cães que desenvolvam resposta imunitária mediada pelas células T CD4 + são provavelmente capazes de evitar a disseminação do parasito para superfície mucosa e, como conseqüência, produzem níveis menores ou básicos de IgA específica, reconhecida como a principal imunoglobulina componente do sistema imunitário das mucosas (Rodriguez-Cortes, 2007). As subclasses de IgG1 e IgG2 têm sido utilizadas como marcadores para a evolução clínica da LCan, sendo consideradas mais confiáveis que a determinação de IgG total (Desplazes et al., 1995). Conclusões Durante uma infecção causada por Leishmania spp, a resposta imunitária é modulada por um sistema integrado que potencializa a imunidade inata e adquirida. Na última década, uma grande quantidade de conhecimento tem sido adquirida sobre a participação dos sinais moleculares na integração da imunidade inata e adquirida, além do incremento das pesquisas focadas nos mediadores sistêmicos, os quais têm crucial participação no direcionamento e controle da resposta protetora eficiente e nas alterações da sinalização e controle, que podem estar envolvidos na persistência e/ou aumento da expressão de mediadores inflamatórios e conseqüentes danos teciduais. O entendimento da cooperação entre os mediadores da ativação imune (citocinas) e mudanças celulares pode propiciar estudos futuros sobre a imunidade do hospedeiro a parasitas intracelulares. A compreensão de como o organismo responde a esse processo infeccioso, além de como esses parasitos se disseminam nos diferentes órgãos e tecidos, permitirá então diferenciar os casos sintomáticos e assintomáticos nos animais positivos para leishmaniose. O conhecimento imunológico das infecções causadas por Leishmania spp poderá fornecer subsídios para elaboração de fármacos eficazes ao tratamento dos casos caninos da doença. Bibliografia Alexender J, Russell DG (1992). The interaction of Leishmania species with macrophages. Adv Parasitol, 31, Alli RS, Khar A (2004). Interleukin-12 secreted by mature dendritic cells mediates activation of NK cell function. FEBS Lett, 559, Almeida MAO, Jesus EEV, Sousa-Atta MLB, Alves LC, Berne MEA, Atta AM (2005). Antileishmanial antibody profile in dogs naturally infected with Leishmania chagasi. Vet Immunol Immunopathol, 106, Awasthi A, Mathur R, Saha B (2004). Immune response to Leishmania infection. Indian J Med Res, 119, Barbieri CL (2006). Immunology of canine leishmaniasis. Parasite Immunol, 28, Becker I, Salaiza N, Aguirre M, Delgado J, Carrillo- -Carrasco N, Kobeh LG, Ruiz A, Cervantes R, Torres AP, Cabrera N, González A, Maldonado C, Isibasi A (2003). 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