L(go UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA FABIANA SARCINELLI METZKER

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1 L(go UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA FABIANA SARCINELLI METZKER Análise molecular da frequência dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC em Bactérias Gram Negativas isoladas de hemoculturas de pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás Goiânia 2013 i

2 FABIANA SARCINELLI METZKER Análise molecular da frequência dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC em Bactérias Gram Negativas isoladas de hemoculturas de pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública. Orientador:Prof. Dr. André Kipnis Co-orientador:Profª. Drª. Maria Cláudia D. P. B. André Goiânia 2013 ii

3 Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Aluna:Fabiana Sarcinelli Metzker Orientador:Prof. Dr. André Kipnis Co-orientadora:Profª. Drª. Maria Cláudia D. P. B. André Membros: 1. Prof. Dr. André Kipnis 2. Prof. Drª. Alessandra Marques 3. Prof. Drª. Juliana Lamaro Cardoso Data: iii

4 SUMÁRIO TABELAS, FIGURAS E ANEXOS vi SIGLAS E ABREVIATURAS RESUMO ABSTRACT 1 INTRODUÇÃO/REVISÃO DA LITERATURA 1.1 Antibióticos 1.2 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA β-lactamase de espectro estendido Enzima TEM Enzima SHV Enzima CTX-M Carbapenemase MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE β-lactamase MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO DE CABAPENEMASE 23 2 JUSTIFICATIVA 26 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 4 MÉTODOS AMOSTRAS BACTERIANAS Confirmação fenotípica de resistência Isolamento e identificação dos isolados Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos CONDIÇÕES DE CULTURA EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO 4.4 CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DO DNA ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) TESTE DE HODGE MODIFICADO 33 iv

5 4.8 ANÁLISE DE DADOS 33 5 RESULTADOS CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO DE ESTUDO AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE ANTIMICROBIANA Antibiograma Concentração Inibitória Mínima (CIM) Detecção genética de ESBL Diferença entre os métodos VITEK 2 e PCR ANÁLISE DA RELAÇÃO GENÉTICA ENTRE AS ESPÉCIES BACTERIANAS PELA TÉCNICA DE PULSED FIELD GEL 41 ELETROPHORESIS 6 DISCUSSÃO 44 7 CONCLUSÃO 51 REFERÊNCIAS 51 ANEXOS v

6 TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Tabela 1: Tabela de classificação de β-lactamases de acordo com Bush et al e Ambler 11 Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho dos produtos e do PCR para detecção dos mecanismos de resistência 31 Tabela 3: Distribuição das frequências dos isolados 34 Tabela 4: Origem dos isolados bacterianos em hemoculturas do HC-UFG 36 Tabela 6: Antibiograma dos isolados de BGN-NF 37 Tabela 7: MIC dos isolados de Enterobacteriaceae 38 Tabela 8: MIC dos isolados BGN-NF 39 Tabela 9: Frequência dos genes bla CTX-M cromossomal, bla CTX-M plasmidial, bla TEM, bla SHV e bla KPC 40 Tabela 10: Comparação entre os métodos fenotípicos e genotípicos 40 Figura 1: Estrutura geral de um antibimicrobiano β-lactâmico destacando a estrutura do anel β-lactâmico (círculo) 4 Figura 2: Estrutura dos antimicrobianos da classe das penicilinas - benzilpenicilinaprimeira penicilina. Amoxicilina e ampicilina foram derivadas da 5 benzilpenicilina Figura 3: Estrutura de antimicrobianos da classe de Cefalosporinas-cefalosporina de 2ª geração: cefuroxima e de 3ª geração: ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima 6 Figura 4: Estrutura de um antimicrobiano monobactâmico 6 Figura 5: Estrutura de antimicrobianos da classe de Carbapenêmicos 7 Figura 6: Distribuição de ESBL em Enterobactérias no Brasil 18 Figura 7: Região superior: antibiótico sem associação com o ácido clavulânico (MIC >32µg/mL). Região inferior cefalosporina associada ao ácido clavulânico 21 (MIC >0,25µg/mL) Figura 8: Resultado positivo para ESBL onde se observa uma zona fantasma entre o disco de amoxicilina/ácido clavulânico e cefotaxima 22 Figura 9: Lado direito: disco de cefotaxima e lado esquerdo: disco combinado de cefotaxima e ácido clavulânico. Teste positivo para ESBL 23 Figura 10:Teste modificado de Hodge para produção de KPC. Notar a distorção do 24 halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela vi

7 amostra de K. pneumoniae testada Figura 11: Resultado do teste de Hodge modificado para isolado 27 LJ Figura 12: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 45 LJ Figura 13: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae. Figura 14: Dendograma dos isolados de Escherichia coli vii

8 TABELAS, FIGURAS E ANEXOS Tabela 1: Tabela de classificação de β-lactamases de acordo com Bush et al e Ambler 11 Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho dos produtos e do PCR para detecção dos mecanismos de resistência 31 Tabela 3: Distribuição das frequências dos isolados 34 Tabela 4: Origem dos isolados bacterianos em hemoculturas do HC-UFG 36 Tabela 6: Antibiograma dos isolados de BGN-NF 37 Tabela 7: MIC dos isolados de Enterobacteriaceae 38 Tabela 8: MIC dos isolados BGN-NF 39 Tabela 9: Frequência dos genes bla CTX-M cromossomal, bla CTX-M plasmidial, bla TEM, bla SHV e bla KPC 40 Tabela 10: Comparação entre os métodos fenotípicos e genotípicos 40 Figura 1: Estrutura geral de um antibimicrobiano β-lactâmico destacando a estrutura do anel β-lactâmico (círculo) 4 Figura 2: Estrutura dos antimicrobianos da classe das penicilinas - benzilpenicilinaprimeira penicilina. Amoxicilina e ampicilina foram derivadas da 5 benzilpenicilina Figura 3: Estrutura de antimicrobianos da classe de Cefalosporinas-cefalosporina de 2ª geração: cefuroxima e de 3ª geração: ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima 6 Figura 4: Estrutura de um antimicrobiano monobactâmico 6 Figura 5: Estrutura de antimicrobianos da classe de Carbapenêmicos 7 Figura 6: Distribuição de ESBL em Enterobactérias no Brasil 18 Figura 7: Região superior: antibiótico sem associação com o ácido clavulânico (MIC >32µg/mL). Região inferior cefalosporina associada ao ácido clavulânico 21 (MIC >0,25µg/mL) Figura 8: Resultado positivo para ESBL onde se observa uma zona fantasma entre o disco de amoxicilina/ácido clavulânico e cefotaxima 22 Figura 9: Lado direito: disco de cefotaxima e lado esquerdo: disco combinado de cefotaxima e ácido clavulânico. Teste positivo para ESBL 23 Figura 10:Teste modificado de Hodge para produção de KPC. Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela 24 amostra de K. pneumoniae testada. viii

9 Figura 11: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 27LJ 42 Figura 12: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 45LJ 42 Figura 13: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae Figura 14: Dendograma dos isolados de Escherichia coli ix

10 SIGLAS ATP Adenosina Trifosfato BGN Bactérias Gram Negativas BGN-NF- Bactérias Gram Negativas Não fermentadoras bla CTX-M gene que codifica enzima não TEM e não SHV bla KPC gene que codifica a enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase bla SHV gene que codifica a enzima Sulfidril Variável bla TEM gene que codifica a enzima Temoniera CIM- Concentração Inibitória Mínima CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute CMT Enzima Mutante TEM CTX-M Enzima Cefotaximase EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético ESBL Extended Spectrum β Lactamase GES Enzima Espectro Estendido Guiana Gly- Glicina HC-UFG- Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás IMI- Enzima Imipenemase IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública IRT Enzima TEM resistente aos Inibidores IS Elemento de Inserção KPC- Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LACEN GO Laboratório Central de Saúde Pública Lys- Lisina MBL- Metalo β-lactamase x

11 NAM N-acetil Murâmico NAG - N acetilglucosamina Pb- Pares de bases PBP- Penicilin Bindings Proteins PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) SER Serina SHV- Enzima Variação Sulfidril SME-Enzima Serratia marcescens TEM Enzima Temoniera TSA- Tryptic Soy Agar (Ágar Tripcase Soja) TSB - Tryptic Soy Broth (Caldo Tripticase Soja) xi

12 RESUMO Recentemente, as Bactérias Gram Negativas (BGN) têm atraído a atenção do corpo clínico em todo o mundo, se tornando um problema de saúde pública. Isso se deve ao fato do crescente aumento da frequência de espécies desse grupo serem isoladas em amostras clínicas. As BGN tem sido apontadas como uma das principais causas de infecções nosocomiais na corrente sanguínea. Elas apresentam muitos mecanismos de resistência intrínsecos ou adquiridos. Dentre esses, do ponto de vista clínico, a produção de enzimas β-lactamases, tais como ESBL e carbapenemases, é o principal. Os genes responsáveis pela produção dessas enzimas são: bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC. O objetivo desse trabalho foi determinar a frequência desses genes nas BGN, isoladas em hemoculturas de pacientes hospitalizados no Hospital das Clínicas de Goiânia (HC-UFG), coletadas durante o período de 31 de janeiro de 2011 a 31 de janeiro de A identificação das espécies e análise da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram realizadas através do sistema automatizado Vitek 2, enquanto que, a análise molecular foi feita através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), com os respectivos oloigonucleotídeos iniciadores para os genes supracitados. A identidade entre o isolados de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli foi feita pelo Pulsed Field Gel Eletrophoresis. Nesse período, foram recuperadas 79 amostras positivas para Bactérias Gram Negativas. Dentre essas, as mais frequentes foram Klebsiella pneumoniae (n=24, 30,37%), Escherichia coli (n=16; 20,25%), Acinetobacter baumannii (n=13; 16,45%) e Enterobacter cloacae (n =9; 11,25%). Essas amostras foram provenientes de vários serviços do HC-UFG. Dentre esses, o Pronto Socorro (n=23; 29,11%), Clínica Médica (n=22; 27,85%) e UTI (n=10; 12,66%) foram as unidades que mais contribuíram com a amostra global. Klebsiella pneumoniae foi a espécie mais frequente dentre os diversos serviços do HC-UFG. Dentre os genes responsáveis pela resistência, o mais frequente foi bla CTX-M (n=30; 68,18%), localizado em plasmídeos seguido do bla SHV (N=18; 40,90%). Em relação ao Vitek 2, a técnica de PCR convencional foi a que mais detectou mecanismos de resistência nas espécies selecionadas. Finalmente, os dados desse trabalho mostraram que o HC-UFG tem muitas espécies de BGN espalhadas por vários serviços do mesmo e com a presença de importantes mecanismos de resistência. xii

13 ABSTRACT Recently, Gram Negative Bacilli have become a great problem of public health because it carries naturally many resistance mechanisms and the frequency in the clinical samples increased very much, especially in the blood. Among the resistance mechanisms, according to the physicians point of view, the main mechanism is production of enzymes called β- lacatamase, for example, Extended Spectrum β-lactamase (ESBL) and carbapenemase. The genes are more frequency bla TEM, bla SHV, bla CTX-M and bla KPC. The goal of this project was to calculate the frequency of these genes in the BGN from blood culture of the patients hospitalized at Hospital das Clínicas de Goiânia (HC-UFG) from January 31 th, 2011 to January 31 th, The identification and account of the MIC were done by Vitek 2 whereas the molecular analysis was done by conventional PCR. The identity between Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli was made by Pulsed Field Gel Electrophoresis. At this time were isolated 79 positive samples of BGN. The most frequent species was Klebsiella pneumoniae (n=24; 30,37%) followed by Escherichia coli (n=16; 20,25%), Acinetobacter baumannii (n=13; 16,45%) and Enterobacter cloacae (n =9; 11,25%). These samples came from many departments at HC UFG and the emergency room was the department that gave more samples (n=23; 29,11%), followed by the medical clinic (n=22; 27,85%) and ICU (n=10; 12,66%). The most frequent gene was bla CTX-M (N= 30; 68,18%) placed in plasmid followed by bla SHV (N=18; 40,90). The PCR technique was the one that detected the most resistance mechanisms. Finally, the datas of this work showed that it is necessary to take care of the dissemination of the BGN at the hospital and there are many species and resistance mechanisms distributed at HC-UFG in the differents departments. xiii

14 1 INTRODUÇÃO / REVISÃO DA LITERATURA Recentemente, as Bactérias Gram Negativas (BGN) tem atraído a atenção do corpo clínico em todo o mundo. Isso se deve ao fato do crescente aumento da frequência de espécies desse grupo apresentarem algum mecanismo de resistência antimicrobiana. As BGN são subdivididas em Bactérias Gram Negativas fermentadoras de glicose, compreendendo as enterobactérias, e Bactérias Gram Negativas não fermentadoras de glicose (BGN-NF) (Stelling et al.2005, Carattoli 2009). As enterobactérias compreendem um grupo heterogêneo de bacilos Gram-Negativos que estão amplamente distribuídas na natureza. Elas podem ser encontradas na água, solo, plantas e no trato gastrointestinal de seres humanos e animais. Algumas são consideradas enteropatogênicas por causarem preferencialmente infecções gastrointestinais, como a Salmonella sp, Shigella sp, Yersinia enterocolitica e vários sorotipos de Escherichia coli. No homem, podem causar infecção em vários sítios e são isoladas de diferentes amostras clínicas recebidas no laboratório. Com isso, sempre são espécies suspeitas em muitos processos infecciosos (Murray et al. 2006). De uma forma geral, as BGN causam com maior frequência infecções no trato respiratório inferior (31,5%), seguida do trato urinário (27,8%), sepse (23,1%) e por último, em sítios cirúrgicos (9,3%) (Bayram & Balci 2006). Já as bactérias Gram Negativas não fermentadoras (BGN-NF) são microrganismos aeróbios e incapazes de utilizar carboidratos como fonte de energia através da fermentação, degradando-os pela via oxidativa. A maioria é oxidase positiva e móvel. Elas apresentam baixa atividade metabólica em relação às enterobactérias. Representam um desafio para os laboratórios de microbiologia devido à sua difícil identificação. No entanto, apesar da baixa frequência, são de grande importância clínica nos casos de infecções relacionadas à assistência à saúde por apresentarem resistência intrínseca a alguns antibióticos e sere capazes de colonizar e causar infecções graves em pacientes oriundos de Unidade de Terapia Intensiva (UTI); submetidos a procedimentos invasivos; unidades de queimados e em infecções do trato respiratório de pacientes com fibrose cística (Stelling et al. 2005). Nas últimas décadas, o isolamento em amostras clínicas de BGN resistentes a duas ou mais classes de antibióticos (multirresistentes), tem aumentado rapidamente em hospitais de 1

15 todo o mundo. D Agata (2004), durante nove anos, observou a prevalência de BGN multirresistentes em infecções nosocomiais e detectou que houve aumento na multirresistência de 1% para 16% em Pseudomonas aeruginosa, de 4% para 13% em Enterobacter sp., de 0,5% para 17% em Klebsiella pneumoniae, de 0% a 9% em Proteus sp. e de 0,2% para 4% em Escherichia coli. Diante desse quadro, o tratamento de infecções causadas pelas mesmas tem se tornado um grande desafio para os médicos e um problema de saúde pública, visto que, há associação entre resistência e altas taxas de mortalidade. As Bactérias Gram Negativas constituem umas das principais causas de infecções sanguíneas nosocomiais. Infecções causadas por bactérias multirresistentes desse grupo resultam em altas taxas de mortalidade, longas hospitalizações e altos custos de tratamento, comparado com as infecções sanguíneas causadas por Bactérias Gram Positivas. Beach et al. (1999), em estudo com amostras de BGN isoladas de amostras sanguíneas oriundas do Canadá, Estados Unidos (EUA) e América Latina no ano de 1997, mostraram que estas bactérias são predominantes na América Latina e são mais resistentes aos antibióticos testados do que as amostras oriundas do Canadá e EUA. As BGN causam principalmente, sepse e choque séptico em virtude da resposta inflamatória do hospedeiro à endotoxina (lipopolissacarídeo) componente da parede celular desse grupo bacteriano (Beach et al. 1999). A resistência antimicrobiana apresentada pelos BGN se dá principalmente contra os antibióticos β-lactâmicos, classe de antibióticos de escolha para o tratamento de infecções causadas por este grupo de bactérias. Esta resistência ocorre principalmente devido à presença de enzimas β-lactamases, capazes de hidrolisar o anel β-lactâmico de penicilinas, cefalosporinas e outros antimicrobianos relacionados, tornando-os inativos. No entanto, recentemente surgiu uma variação dessas enzimas, denominadas de β-lactamases de Espectro Estendido (ESBL Extended Spectrum β-lactamase) as quais são capazes de hidrolisar antibióticos β lactâmicos de terceira e quarta geração, restando apenas como opção terapêutica os carbapenêmicos (Paterson & Doi 2007). Uma rápida e acurada identificação da resistência a antimicrobianos é decisiva para se iniciar uma terapia apropriada. Os testes de resistência baseados no fenótipo são os mais usados por serem mais baratos e fáceis de realizar. No entanto, não fornecem informações sobre variantes genéticos. Esse fato limita o uso de informações sobre quais genes são responsáveis pelo mecanismo de resistência em inquéritos epidemiológicos. Um dos principais problemas causados pelas β-lactamases é o fato de sua produção ser induzida durante a terapêutica antimicrobiana. Com isso, muitos laudos podem ser falsos negativos decorrentes dessa peculiaridade e, essa é uma das principais causas de falha terapêutica. Com 2

16 o aumento da prevalência de isolados produtores dessas enzimas, a rápida e precisa identificação destes isolados tem se tornado cada vez mais clinicamente significante (Tumbarello et al. 2008) A frequência de ESBL varia em cada região e é alta principalmente em hospitais ou locais destinados a hospitalizações de longa duração, visto que, os pacientes nestas condições apresentam alguns fatores de risco, tais como, sistema imune debilitado, uso de catéteres, submissão a vários procedimentos invasivos, dentre outros (Ben-Ami et al. 2009). O conhecimento sobre as implicações dos mecanismos de resistência em infecções causadas por BGN multirresistentes e estudos da frequência são importantes em dois aspectos. Num primeiro momento, os dados ajudam os profissionais de saúde a criarem normas sobre isolamento e tomadas de decisões racionais sobre criação de programas para escolha de antibioticoterapia. Num segundo momento, ajuda os mesmos a tomarem iniciativas para prevenir a disseminação das mesmas (Cosgrove 2006). A detecção rápida e específica é essencial para o tratamento eficaz de infecções causadas por microrganismos multirresistentes. Kang et al. (2005) mostraram que o grupo de pacientes que apresentava infecção sanguínea causada por BGN multirresistentes, inicialmente tratado inadequadamente, apresentou uma taxa de mortalidade de 38,4%, enquanto que, um outro grupo de pacientes com a mesma condição clínica e tratado inicialmente com a terapia adequada tiveram taxa de mortalidade de 27,4%. Atualmente, as técnicas de biologia molecular constituem uma importante ferramenta para os microbiologistas a fim de detectar mecanismos de resistência nas BGN por apresentarem alto nível de especificidade e capacidade de identificação dos mecanismos genéticos de resistência. A rápida identificação dos mesmos é essencial para se evitar uma elevada disseminação dos genes de resistência entre as espécies (Kang et al. 2005). 1.1 ANTIBIÓTICOS Os antibióticos constituem uma das grandes contribuições da medicina moderna para o combate das doenças infecciosas, sendo introduzidos há mais de 60 anos. Desde então, cepas resistentes têm surgido em decorrência dessa nova pressão seletiva resultante do seu emprego clínico (humano e veterinário), industrial (conservação de alimentos), comercial (engorda de animais) e experimental. Até 1950, as infecções causadas por bactérias, principalmente enterobactérias, eram de difícil tratamento, visto que, só tínhamos como opções terapêuticas, a tetraciclina, cloranfenicol e estreptomicina (Bonono & Szabo 2006, Hawser et al. 2009). 3

17 Os antibióticos constituem substâncias químicas específicas produzidas em geral por organismos vivos, bem como seus análogos estruturais obtidos por síntese ou semi-síntese. São capazes de inibir, em concentrações baixas, processos vitais de uma ou mais espécies de microrganismos. A descoberta do primeiro β-lactâmico, a penicilina, oriunda do fungo Penicillium notatum por Alexander Fleming, em 1928, revolucionou o tratamento das infecções bacterianas. A presença do anel β-lactâmico intacto em sua estrutura química é essencial para a atividade biológica, ao passo que, sua cadeia lateral determina o espectro antibacteriano, a sensibilidade aos ácidos e β-lactamases e as propriedades farmacocinéticas (Figura 1) (Korolkovas 2007). Figura 1: Estrutura geral de um antimicrobiano β lactâmico destacando a estrutura do anel β- lactâmico (círculo). Fonte: Grumach & Rosário (2006). As penicilinas são substâncias derivadas do ácido β aminopenicilânico. Sua hidrólise permitiu a síntese de diversos β-lactâmicos por adição e/ou substituição de radicais. Por apresentarem o anel β lactâmico (fundido com o anel tiazolidínico), são conhecidas também, junto com as cefalosporinas, como antibióticos β-lactâmicos. As penicilinas apresentam duas características fundamentais que fazem dela o antibiótico mais utilizado: alta eficácia e baixa toxicidade. Sua ação antibacteriana se deve à inibição da enzima transpeptidase que catalisa a biossíntese da última etapa da formação da parede celular. Dentre as penicilinas mais usadas se destacam a benzilpenicilina, ampicilina e amoxicilina, conforme ilustrados na figura 2 (Goodman, 2010). 4

18 Figura 2: Estrutura dos antimicrobianos da classe de penicilinas benzilpenicilina primeira penicilina - amoxicilina e ampicilina foram derivadas da benzilpenicilina. Fonte: Grumach & Rosário (2006). A classe de antibiótico mais utilizada para tratar infecções causadas pelas BGN é a classe dos β-lactâmicos os quais compreendem as penicilinas associadas aos inibidores de β-lactamases (Ácido Clavulânico, Tazobactam e Sulbactam), as cefalosporinas e os carbapenêmicos, juntamente com os monobactâmicos. Estes exibem seu efeito bactericida através da inibição de enzimas envolvidas na síntese da parede celular através da inibição da biossíntese do peptídeoglicano na sua fase terminal impedindo a transpeptidação, ou seja, a formação de ligações cruzadas entre cadeias peptídicas vizinhas recém sintetizadas. O peptídeoglicano é um dos principais constituintes da parede celular bacteriana cujas funções são conferir rigidez à célula e proteção contra ambientes hostis e variações osmóticas. A biossíntese do peptídeoglicano ocorre em três fases: Fase citoplasmática onde ocorre a formação dos precursores UDP NAG (uridinodifosfato N-acetilglucosamina) e UDP-NAM (uridinodifosfato N-acetilmurâmico). Na segunda fase, conhecida como fase membranar ocorre o transporte desses precursores através da membrana citoplasmática para o espaço periplasmático com o auxílio do lipídio membranar bactoprenol, formando as cadeias NAG- NAM. Na última fase, ocorrem as ligações cruzadas D-alanina D-alanina NAM entre as cadeias catalisadas pelas enzimas transpeptidases localizadas na região externa da membrana plasmática. Esse grupo enzimático é chamado de PBP (Penicilin Binding Protein) devido à sua grande afinidade com as penicilinas (Murray et al. 2006). Outros grupos de β-lactâmicos foram descobertos devido à pesquisa ativa por fungos ou actinomicetos que produzissem substâncias com ação antimicrobiana. Com isso, foi descoberta a classe das cefalosporinas. A primeira cefalosporina descoberta foi isolada de Cephasloporium acremonium, em As cefalosporinas são derivadas do ácido 7- aminocefalosporânico. Seu mecanismo de ação e demais propriedades são semelhantes aos das penicilinas. As cefalosporinas são subdivididas em primeira, segunda, terceira e quarta geração de acordo com o espectro bacteriano. À medida que o antibiótico progride sua classificação da primeira para a quarta geração, aumenta-se o espectro contra BGN e ocorre 5

19 perda de eficácia contra as Bactérias Gram Positivas, aumenta a eficácia contra bactérias resistentes e aumenta o custo do tratamento (Figura 3) (korolkolvas 2007). Figura 3: Estrutura de antimicrobianos da classe de Cefalosporina cefalosporina de 2ª geração: cefuroxima e de 3ª geração: ceftazidima, ceftriaxona e cefotaxima. Fonte: Grumach & Rosário (2006). Os monobactâmicos pertencem também à classe dos antibióticos β-lactâmicos (Figura 4). O aztreonam é o único dessa classe disponível no Brasil. Eles são altamente resistentes à inativação pelas β-lactamases tendo sua principal indicação nas falências terapêuticas com cefalosporinas de terceira geração nas infecções causadas por BGN (Goodman 2010). Monobactâmicos Figura 4: Estrutura de um antimicrobiano monobactâmicos. Fonte: Willian (1999). A introdução das penicilinas sintéticas, com a presença natural do anel β-lactâmico em sua estrutura, proporcionou um melhor tratamento das BGN, principalmente enterobactérias, visto que, até então, os agentes disponíveis não eram tão eficazes. No entanto, em 1960, já havia relatos de cepas resistentes a estes antibióticos devido às mutações que ocorrem em plasmídeos, que são elementos genéticos extra cromossomais capazes de se auto replicar e apresentar mecanismos que controlam o número de cópias e estabilidade celular. Eles também 6

20 promovem a transferência lateral entre bactérias de diferentes espécies, ocasionando alta disseminação de genes, e consequentemente, da resistência (Goodman 2010). Um dos mecanismos responsáveis pela resistência bacteriana aos antimicrobianos é a produção de enzimas β-lactamases. A primeira descoberta foi a enzima TEM, codificada por um gene plasmideal. Esse problema foi solucionado com o desenvolvimento das cefalosporinas de 3ª geração, como a ceftriaxona. Logo surgiram as cepas produtoras de ESBL as quais apresentavam resistência também àqueles novos grupos de antibióticos. A fim de superar as ESBL, em 1990, a indústria disponibilizou os carbapenêmicos, os quais também se tornaram importantes no combate a infecções nosocomiais causadas por bactérias produtoras destas enzimas (Landman et al. 2007, Hawser 2009). A classe de antibióticos carbapenêmicos contém um anel β-lactâmico, às vezes, fundido com anel de cinco ou seis membros, mas diferindo estruturalmente das penicilinas e/ou cefalosporinas. Essa classe compreende o imipenem, meropenem e ertapenem. Alguns destes antibióticos são obtidos por fermentação, enquanto que, outros são preparados por síntese parcial ou total. O imipenem tem como produtor natural Streptomyces cattleya, uma bactéria encontrada naturalmente no solo. Seu mecanismo de ação consiste em inibir a síntese da parede celular através de sua ligação às proteínas ligadoras de penicilina (PBP). Essa classe é estável à hidrólise causada pelas enzimas do tipo ESBL (Figura 5) (Silva & Lincopan 2012). Carbapenêmicos Figura 5: Estrutura de antimicrobianos da classe de Carbapenêmicos. Fonte: Grumach & Rosário (2006) MECANISMOS DE RESISTÊNCIA Antes do advento dos antibióticos da quimioterapia e das medidas imunossupressoras as doenças infecciosas causadas por enterobactérias eram relativamente bem definidas Logo após a introdução dessa conduta terapêutica na prática clínica, cepas resistentes foram 7

21 selecionadas, o que ocasionou o aumento de sua frequência em isolados clínicos (Murray et al. 2006). A resistência aos antimicrobianos apresentadas pelas bactérias ocorre devido às características codificadas geneticamente, podendo ser intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca é aquela resultante da genética, estrutura e fisiologia natural do microrganismo e ocorre em grupos específicos sendo útil na escolha dos antibióticos para o teste de sensibilidade. Já a resistência adquirida resulta da alteração da estrutura e fisiologia celular, causada por mudanças no código genético do microrganismo. Pode ser adquirida por mutação genética, aquisição de genes de outros organismos, ou uma associação de ambas (Rasmussen & Høiby 2007). Os principais mecanismos de resistência apresentados pelas BGN são: alteração de porinas; sistemas de efluxo; alteração do sítio alvo e, por último; produção de enzimas capazes de degradarem classes de antibióticos específicas, tais como, as enzimas β lactamases e carbapenemases. A redução da expressão dos canais de porina resulta na redução da permeabilidade bacteriana, reduzindo a entrada de antibiótico na mesma. As alterações de permeabilidade tem alto custo metabólico para a célula bacteriana, visto que, os nutrientes são transportados para o citoplasma por essa via. É um mecanismo regulado por genes cromossomais, e, portanto, difícil de disseminar. Com isso, esse mecanismo não explicaria a alta disseminação de resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos (Heritage et al. 1999). O sistema de efluxo é utilizado pela célula bacteriana para transportar substâncias do citoplasma para o meio externo. É um sistema dependente de ATP, resultando em gasto energético. Quando hiperexpresso, este sistema ocasiona a resistência às quinolonas, penicilinas e cefalosporinas. No entanto, não é um sistema eficaz para a bactéria devido à demanda de gasto energético. Portanto, não é o principal mecanismo de resistência aos antimicrobianos (Woodford et al. 2004). As Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBP- Penicillin Binding Proteins) são enzimas importantes para a célula bacteriana, já que são essenciais na estruturação do peptídeoglicano da parede celular da mesma. Com isso, constituem importantes alvos terapêuticos dos antibióticos. Algumas bactérias produzem PBP mutantes que conservam a sua função na célula bacteriana, porém apresentam afinidade reduzida aos β-lactâmicos. No entanto, esse mecanismo de ação em BGN é codificado por gene cromossomal, com isso, sua disseminação horizontal não é significativa e, portanto, também não constitui o principal mecanismo de resistência antimicrobiana (Goodman 2010). 8

22 A produção de enzimas β-lactamases, do ponto de vista clínico, é o mecanismo de resistência adquirido mais importante, devido à alta prevalência e por ocasionarem uma alta taxa de falha terapêutica, já que, são capazes de hidrolisar os antibióticos β-lactâmicos, inativando-os. A detecção das β-lactamases, tanto em Bactérias Gram Positivas quanto em BGN, remonta-se ao início dos anos 40, antes do uso generalizado das penicilinas na prática clínica. A primeira β-lactamase foi descoberta em Escherichia coli. Essas enzimas inativam os β-lactâmicos através da quebra da ligação amida, perdendo assim a capacidade de inibir a síntese da parede celular bacteriana. As β-lactamases podem ser encontradas em Enterobacteriaceae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Moraxella sp e anaeróbios, como as espécies do grupo Bacteroides fragilis, cepas de Prevotella, Porphyromonas sp, Bilophila wadsworthia, Fusobacterium sp e Clostridium sp. Os mecanismos de resistência aos antibióticos β lactâmicos e carbapenêmicos surgiram antes da introdução da primeira penicilina na prática médica. A primeira β lactamase foi descoberta em Escherichia coli e algumas espécies de Bactérias Gram Negativas possuem naturalmente, em seu DNA cromossômico, genes que codificam enzimas β lactamases, as quais são enzimas bacterianas que protegem os microorganismos contra a ação letal dos antibióticos β lactâmicos. Essas surgiram devido às diferentes pressões seletivas encontradas no ambiente (Summanen et al. 1993, Bradford 2001). As β-lactamases clássicas são TEM-1, TEM-2 e SHV-1. Elas eram capazes apenas de hidrolisar penicilinas e cefalosporinas de primeira e segunda geração. No entanto, mutações genéticas nos genes responsáveis pela produção das mesmas ocasionaram a produção de enzimas com aumento do espectro de atividade, sendo capazes de hidrolisarem cefalosporinas de terceira e quarta geração, como cefotaxima e ceftazidima, e os monobactâmicos, como o aztreonam. Essas enzimas foram denominadas de β lactamases de espectro estendido (ESBL). Estudos comprovam que a pressão seletiva causada pelo uso constante de cefalosporinas nos centros de saúde contribui para o aumento da freqüência e disseminação de microrganismos resistentes. Monnet et al observaram que a resistência bacteriana causada pela produção de ESBL pode aumentar num período de 2 anos em até 57% em um único hospital. Devido à grande importância das β-lactamases e à grande variedade das mesmas, surgiram métodos de classificação a fim de facilitar os estudos dessas enzimas. A atividade bioquímica e modelo de substrato de diferentes enzimas formam a base de esquemas dos principais sistemas de classificação. Os mais utilizados são o de Ambler e o de Bush (Tabela 1). A classificação de Ambler se baseia na estrutura molecular e na homologia na sequência 9

23 de aminoácidos, resultando em quatro grandes grupos A, B, C e D, onde as classes A, C e D agrupam as β-lactamases que usam o sítio catalítico serina para inativação dos β-lactâmicos, enquanto que, a classe B agrupa as metalo enzimas que usam o zinco como cofator para a sua atividade catalítica. Já a classificação de Bush (1989), foi a primeira a correlacionar o substrato preferencial e propriedades inibitórias à estrutura molecular da enzima e nesta classificação as β-lactamases se dividem em quatro grupos (1, 2, 3 e 4) e vários subgrupos. Atualmente, novas tabelas de classificação estão sendo criadas englobando determinantes genéticos, tais como, mediados por plasmídeos ou cromossomos, dados de estudos de foco isoelétrico e cinética enzimática (Bush et al. 1995, Heritage et al.1999). 10

24 Tabela 1: Tabela de classifição das β lactamases de acordo com Bush, Jacoby, Medeiros e Ambler Bush et al Ambler 1980 Classificação Grupo funciona Subgrupo s maiores Classe Molecular 1 C Enzimas cromossômicas e plasmidiais produzidas por BGN. Conferem resistência a todos os β lactâmicos,exceto carbapenêmicos. Não são inibidas pelo ácido clavulânico. 2 2a A Penicilinases produzidas por Staphylococcus sp. e Enterococcus sp. Conferem alto nível de resistência às penicilinas. 2b A β-lactamases de amplo espectro de BGN. Inclui TEM 1 e SHV 1. 2be A β lactamases de espectro estendido. Conferem resistência às penicilinas, cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos (ESBL). 2br A β lactamases resistentes aos inibidores de β lactamases derivadas de TEM (IRT) e uma enzima derivada de SHV. 2c A Enzimas que hidrolisam carbenicilina. 2d D Enzimas que hidrolisam a cloxacilina (oxacilina). São levemente inibidas pelo ácido clavulânico 2e A Cefalosporinases inibidas pelo ácido clavulânico 2f A Enzimas que hidrolisam carbapenêmicos. Possuem uma serina no seu sítio ativo e são inibidas pelo ácido clavulânico 3 3a,3b,3c B Metalo β lactamase. 4 ND Penicilinases miscelâneas não sequenciadas, não categorizadas em nenhum dos grupos detalhados. 11

25 1.2.1 β-lactamase de Espectro Estendido Em 1980, na Alemanha, foi descrito pela primeira vez uma ESBL, logo após a introdução de cefalosporinas de terceira geração, em um isolado de Klebsiella pneumoniae (Paterson 2000). Em 1984, uma nova ESBL foi isolada na França e, posteriormente, em todo o mundo. Desde então, a produção de ESBL entre as BGN tem crescido muito e se tornado um problema mundial. O aumento da frequência dessas enzimas em isolados clínicos se dá logo após a introdução de cefalosporinas de terceira geração, no uso clínico (Saladin et al. 2002). As β-lactamases de espectro estendido (ESBL) são enzimas que podem hidrolisar oximino β lactâmicos (cefotaxime, ceftazidime e ceftriaxona) e aztreonam, inativando - os. As ESBL são enzimas geralmente codificadas por genes localizados em plasmídeos, cujos principais são bla TEM, bla SHV e bla CTX-M. Esses são mais facilmente encontrados em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli (Gutmann et al. 1989). As enzimas ESBL são assim chamadas porque são capazes de hidrolisar antibióticos β-lactâmicos de espectro estendido, incluindo cefalosporinas e monobactâmicos. De acordo com o Comitê Europeu Antimicrobiano, um isolado é considerado produtor de enzima ESBL quando apresenta resistência, a pelo menos uma cefalosporina de terceira geração, como a ceftriaxona. Algumas ESBL conferem alto nível de resistência para todas as classes de cefalosporinas, enquanto que, outras conferem resistência sutil ou aumenta seletivamente dentro dos subgrupos de β-lactâmicos, como a enzima TEM que hidrolisa melhor a ceftadizima, enquanto a enzima CTX-M a cefotaxima (Bush 2008). As BGN são responsáveis pela maioria das infecções clínicas, tais como, infecções do trato respiratório inferior, trato urinário e septicemia. As resistências apresentadas por elas aos antibióticos β lactâmicos resultam da produção das enzimas penicilinases (β-lactamases que hidrolisam penicilinas) TEM -1 e SHV-1 e cefalosporinases de espectro estendido (β-lactamases que hidrolisam cefalosporinas), tais como, algumas variantes derivadas de mutações plasmidiais das enzimas TEM, SHV e CTX-M (Hujer et al. 2008, Schoevaerdts et al. 2011) O número de espécies de BGN produtoras de ESBL é provavelmente mais prevalente do que os dados mostram. Pois, geralmente, passam despercebidas pelos testes convencionais de rotina de identificação de bactérias, tais como, disco difusão, MIC e os automatizados. Isso ocorre porque alguns testes só utilizam uma cefalosporina de terceira geração, o inóculo está em quantidade insuficiente, apenas um clone está presente na análise ou variantes genotípicos apresentam variações discretas no fenótipo (Rasheed et al. 2000). 12

26 Algumas estratégias têm sido adotadas a fim de conter a disseminação das enzimas ESBL. São elas: desenvolvimento de novos antibióticos e utilização de penicilinas associadas a inibidores de β lactamases, tais como, ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Chaibi et al. 1999). As principais características de mediadores de ESBL em espécies de BGN são: 1- Resistência para amino e carboxi penicilinas, assim como às cefalosporinas de segunda geração e poucos de terceira geração; 2- Sinergia entre antibióticos β-lactâmicos e inibidores de β-lactamase, particularmente ácido clavulânico. Nos testes de sensibilidade, tais como, disco difusão em ágar, determinação do MIC ou testes automatizados, alguns mecanismos de resistência são percebidos através da redução dos valores de ponto de corte. A maioria desses testes usa uma cefalosporina de terceira geração e um inibidor de β lactamase, com isso, o sinergismo é percebido quando ocorre redução de MIC do antibiótico anterior na presença do inibidor (Drieux et al. 2008). Infecções causadas por BGN produtoras de ESBL, tais como, alguns isolados de Escherichia coli ou Klebsiella pneumoniae implicam em maior tempo de hospitalização, alta taxa de mortalidade e custos para o sistema financeiro de saúde. Esses pacientes custam em torno de a dólares a mais do que pacientes infectados pelos mesmos isolados não produtores de ESBL (Cosgrove & Carmelli 2007). Alguns fatores de risco podem contribuir para o aparecimento de infecções no ambiente hospitalar, principalmente por microrganismos resistentes. Entre eles, podemos citar o uso indiscriminado de antibióticos de amplo espectro, internações prolongadas (principalmente na UTI), aumento do número de transferências entre unidades hospitalares, gravidade da doença, intubação e ventilação mecânica, uso de catéteres em geral e exposição prévia a qualquer classe de antibióticos (Bradford 2004) Enzima TEM Em 1960, foi descoberta a primeira β-lactamase mediada por plasmídeo. Essa foi encontrada em isolado de Escherichia coli e foi denominada de TEM-1, proveniente de uma paciente da Grécia, cujo nome era Temoniera. Essa enzima é codificada pelo gene bla TEM e atualmente pode ser encontrada em várias espécies além das BGN, como Haemophillus influenzae, Neisseria gonorrhoeae, entre outras em todo o mundo (Zeba 2005). Essa enzima é capaz de hidrolisar penicilinas e cefalosporinas, como cefalotina e cefaloridina e 13

27 monobactâmicos. Geralmente, os plasmídeos que transportam o gene bla TEM também apresentam genes de resistência para gentamicina e tobramicina (Bradford 2001, Coque 2002). No início de 1990, o uso clínico de combinações de penicilinas e inibidores de β- lactamases foi seguido da emergência de enzimas mutantes da TEM resistentes aos inbibidores, as quais foram chamadas de IRT (Guibout et al 2000, Robin et al. 2007). Os inibidores de enzimas β-lactamases também foram usados exaustivamente, especialmente na França, por cirurgiões da cavidade abdominal a fim de prevenir infecções intra- abdominais, visto que, possuem atividades contra enterobactérias e anaeróbios. Já em meados de 1990, um terceiro sub-grupo de enzimas TEM surgiu, combinando características de IRT e ESBL, ou seja, uma enzima TEM resistente aos antibióticos β lactâmicos e aos inibidores de β- lactamases, tais como, o ácido clavulânico naturalmente encontrado em uma Bactéria Gram Positiva que vive no solo denominada de Streptomyces clavuligerus. Essa nova enzima β- lactamase foi denominada de complexo mutante TEM (CMT). Uma delas a enzima TEM -50 tem sido encontrada em diferentes espécies de Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae e Enterobacter aerogenes (Yang 2010, Petrosino et al. 1999). As mutações são responsáveis pelas variações das enzimas β-lactamases. A sequência Ser-X-X-Lys, na posição 67, é essencial para a atividade catalítica dessa enzima. Com isso, as mutações ocorrem em posições limitadas. Essas mutações resultam em alterações fenotípicas que tornam as enzimas desse grupo mais capazes de hidrolisarem os substratos habituais ou mesmo aquisição da capacidade de hidrolisar outros antibióticos da mesma classe ou de classes diferentes. Mutações que resultam em substituição do aminoácido arginina para o aminoácido serina, na posição 164, juntamente com a mutação do tipo substituição do aminoácido arginina pelo aminoácido serina ou cisteína na posição 244, inativa a capacidade da enzima TEM de hidrolisar ceftazidima e retém a hidrólise dos inibidores de β-lactamases (Bradford 2001, Schroeder 2002). O grupo de enzimas TEM, especialmente TEM-1 e TEM-2, está entre as β-lactamases de amplo espectro mais encontradas em todo o mundo. A maioria das enzimas TEM são encontradas em espécies de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli (Coque 2002). 14

28 Enzima SHV Em 1972 foi descrita uma nova enzima β-lactamase denominada de PIT-2, que mais tarde foi chamada de SHV (Sulphydryl Variable), a qual é codificada pelo gene bla SHV. Esta enzima apresenta ação apenas contra as penicilinas, ou seja, era uma β-lactamase de espectro estreito. Foi primeiramente descrita em genes cromossomais do gênero Klebsiella (Poirel & Nordmann 2002). Apesar do gene bla SHV ter sido descrito, a princípio, como cromossomal, em 1979, foi demonstrada a presença do mesmo em plasmídeos em isolados de Klebsiella pneumoniae. É possível que, pressões de antibióticos do ambiente selecionaram alguns clusters de mutação e isolados com esse gene no cromossomo. A fim de superar as pressões seletivas, houve a transferência desse gene para dentro de elementos móveis (plasmídeo e transposons), onde adquiriu potencial para disseminação entre as espécies (Chaves et al. 2001). Em 1983, logo após a introdução das cefalosporinas de terceira geração na prática clínica, foram identificadas variantes de β-lactamases SHV com atividade hidrolítica estendida, ou seja, contra cefalosporinas de terceira geração, especialmente em isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae e Serratia marcescens (Heritage et al. 1999). Novos genes têm surgido, através de mutações, derivados dos genes clássicos. Esses podem ocasionar a substituição de apenas um aminoácido, fato suficiente para tornar a enzima mais eficiente, ou até mesmo, aumentando seu perfil de hidrólise, ampliando seu espectro de atividade. A substituição do aminoácido glicina pelo aminoácido serina, na posição 238, dá origem à enzima SHV 2 de espectro estendido. Já uma substituição adicional na posição 240 confere à essa enzima uma hidrólise mais ativa ao ceftazidime, enquanto que, a substituição do aminoácido serina pela glicina na posição 130 é essencial para inativar ampicilina e ácido clavulânico (Coque 2002). Alguns estudos tem documentado que o aumento da frequência de isolados portadores de enzimas β-lactamases não ocorre devido apenas à expansão clonal, mas também através da disseminação plasmidial. A sequência de inserção IS 26 também foi encontrada associada ao gene bla SHV -12 juntamente com a estrutura DEOR um regulador transcricional. A diversidade do contexto genético encontrado, em particular, nos genes bla localizados especificamente em plasmídeos sugere a evolução desses através de diferentes eventos recombinantes (Diestra et al. 2008). 15

29 Enzima CTX-M Em 1986, no Japão, foi descoberto uma enzima ESBL não TEM e não SHV a qual foi designada de FEC -1. Essa foi isolada de Escherichia coli resistente ao cefotaxime. Na Alemanha, início de 1989, uma enzima com as mesmas características da FEC-1 foi isolada em Escherichia coli a qual foi denominada de CTX-M1. Essa é responsável por hidrolisar mais cefotaxima do que ceftadizime e apresenta ponto isoelétrico alcalino. A alta atividade cefotaximase está relacionada com a geometria única do sítio de ligação dessa β-lactamase que se adapta melhor à estrutura química da cefotaxima do que aos demais β-lactâmicos. A enzima CTX-M é inibida pelo ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam (Bonnet 2004, Eckert et al. 2004). Novos grupos com fenótipo típico de resistência ESBL não TEM e não SHV tem sido descritos recentemente. Esses incluem as enzimas PER -1, PER-2, VEB-1, GES-1 e BES -1. Porém, a enzima CTX-M é a de maior destaque por apresentar uma alta frequência em isolados clínicos. Ela apresenta identidade <40% com a enzima TEM e SHV. A enzima CTX- M tem sido encontrada em maior quantidade nos isolados de Salmonella typhimurium, Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae (Sabaté et al. 2000). A enzima CTX-M é codificada pelo gene bla CTX-M, o qual foi descrito primeiramente como mediado por cromossomo em espécies de Klebsiella cryocrescens, Klebsiella ascorbata e Klebsiella georgiana. No entanto, em isolados clínicos, o gene bla CTX-M tem sido mais encontrado em plasmídeos que variam de 7 Kb a 160 Kb. O gene bla TEM-1 geralmente é encontrado no mesmo plasmídeo. Esses plasmídeos podem também transportar genes de resistência a antibióticos de classes diferentes, tais como, aminoglicosídeos, cloranfenicol, sulfonamida, trimetoprim e tetraciclinas (Livermore et al. 2008). Após a descoberta do gene bla CTX-M, na década de 80, novas variantes do mesmo tem sido descritos. Eles apresentam mais de 50 variantes alélicos, subdivididos em 6 subgrupos, os quais agrupam os genes que apresentam menor variação alélica entre si, cujos produtos variam de 1 a poucos aminoácidos (Rossolini et al. 2008). Com isso, os membros de um mesmo subgrupo apresentam mais que 94 % de identidade, enquanto que foi observado entre os demais grupos similaridade menor que 90 %. De acordo com estudos filogenéticos, os subgrupos são os seguintes: CTX-M 1 (6 enzimas); CTX-M-2 (8 enzimas); CTX-M 8(1enzima); CTX-M 9(9 enzimas) e CTX-M 25 que inclui CTX-M 26 (Bonnet 2004). 16

30 O gene bla CTX-M tem sido observado em diferentes isolados de BGN, principalmente, nas enterobactérias, tais como, Escherichia coli, Shigella sonei, Proteus mirabillis, Morganella morganii, Citrobacter freundii, Serratia marcenses e Enterobacter aerogenes. A forma de disseminação mais prevalente desse gene entre mesmas espécies ou entre espécies diferentes é a horizontal, via plasmídeo (Rossolini et al. 2008). Os genes bla estão frequentemente associados a plasmídeos. Muitos desses codificam marcadores de resistência a medicamentos e fazem parte de transposons, os quais são frequentemente flanqueados por elementos de inserção (IS) que conferem capacidade de mobilizar os genes. Os integrons também podem fazer parte de estruturas cassete, as quais são capazes de captar os genes através de um evento de recombinação sítio específico entre dois sítios de DNA. Algumas sequências de inserção têm sido associadas à mobilização de codificadores de β-lactamases, tais com o bla CTX-M, são elas: ISE cp 1, IS 26 e IS 503 (Eldestein et al. 2003, Livermore et al. 2007). Devido ao elevado uso de ceftazidima na prática clínica, houve a seleção de mutantes no gene bla CTX-M com o aumento da atividade de ceftazidimase. A mutação ocorre em dois dos elementos estruturais que delimitam o sítio de ligação β-lactâmico, chamado de parte terminal da folha β-3, tornando o sítio ativo da enzima mais acessível à ceftadizima. A substituição, no Ω loop (na posição 167) aparentemente modifica a forma de interação dos antibióticos β-lactâmicos com o sítio de ligação. A substituição do aminoácido Asp 240 por Gy tem sido associada com o aumento da atividade catalítica para a ceftazidima (Woodford et al. 2004). Dentre as enzimas CTX-M, a CTX-M 2 está entre os exemplares mais disseminados. Ela tem sido isolada em humanos e animais saudáveis os quais podem ser reservatórios de isolados produtores de enzimas CTX-M. A maioria desses isolados está associada a infecções nosocomiais. Entretanto, em contraste com as enzimas TEM e SHV, a enzima CTX-M emerge em isolados da comunidade, como Salmonella não tifóide e Shigella sp e Escherichia coli. A epidemia dessa enzima está mudando a epidemiologia das ESBL e, em alguns lugares a enzima CTX-M é a mais prevalente em isolados de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. A propensão dessa enzima se disseminar rapidamente em E. coli, se dá principalmente porque essa é a espécie mais comumente isolada em amostras clínicas (Dutour et al. 2002, Bonnet 2004, Livemore et al. 2007). A disseminação do gene bla CTX-M tem sido massiva e mundial, a qual tem sido chamada de pandemia CTX-M. Ela é um bom exemplo da rápida e global disseminação de resistência mediada por plasmídeo através de bactérias patogênicas. Temos como principais 17

31 causas para a alta disseminação o carreamento por plasmídeos com alta e eficiente transferência por conjugação entre bactérias de mesma espécie ou de espécies diferentes e/ou baixo custo do fitness imposto pelo gene bla CTX-M a elementos genéticos nos hospedeiros bacterianos comparados a outros genes (Rossolini et al. 2008). Na prática, a resistência à ceftazidima é usada como indicadora para enzimas TEM e SHV. No entanto, não é um bom indicador para enzima CTX-M, visto que, essas são sensíveis à mesma. No entanto, algumas enzimas CTX-M surgem resistentes a esse substrato, causando resultados interpretativos contraditórios. Daí, a importância de associar mais de uma cefalosporina de terceira geração nos testes de sensibilidade. Essa prática não é feita na maioria dos laboratórios. Com isso, ela constitui a maior fonte de resistência às cefalosporinas de terceira geração (Eldestein et al. 2003). A distribuição das enzimas ESBL em alguns estados do Brasil está representada na Figura 6. Figura 6: Distribuição de ESBL em Enterobactérias no Brasil. Fonte: Silva &Lincopan (2012) Carbapenemases Os carbapenêmicos (imipenem, meropenem e ertapenem) frequentemente são usados como agentes mais apropriados para o tratamento de infecções causadas por BGN produtoras de ESBL. Após a sua introdução em 1980, relatos de que tem sido crescente a frequência de isolados clínicos produtores de enzimas carbapenemases, capazes de hidrolisar os carbapenêmicos, tem crescido gradativamente. Essas também são codificadas por genes 18

32 localizados em plasmídeos. A carbapenemase que cresce em importância é a Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) codificada pelo gene bla KPC, a qual foi descrita primeiramente nos EUA, em 2001, e confere resistência a todos os agentes β-lactâmicos, incluindo penicilinas, cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenêmicos (Anderson et al. 2007, Shen et al. 2009). Antes da introdução dos carbapenêmicos na prática clínica, a resistência aos mesmos através das carbapenemases, era limitada a patógenos que apresentavam resistência intrínseca aos mesmos, tais como, Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas sp, Flavobacterium sp, Legionella gormanii, Bacillus cereus e Bacterioides fragillis. No entanto, a produção de carbapenemases entre as espécies de BGN tem aumentado gradativamente, principalmente em Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Enterobacter sp, Citrobacter freudii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Proteus mirabillis e Salmonella enterica (Gumez et al. 2008, Wallace et al. 2010). A resistência aos carbapenêmicos pode ser mediada por três mecanismos: produção de alta quantidade de enzima Amp C combinada com a redução da permeabilidade da droga; modificação da afinidade do sítio alvo pelas enzimas PBL e, por último, produção de carbapenemases, enzimas capazes de hidrolisar os antibióticos carbapenêmicos. Dentre esses mecanismos, o principal é a produção de carbapenemase (Petrella et al. 2008, Tsakris 2010). As carbapenemases estão divididas em três grandes grupos: Classe A serina carbapenemase IMI, SME GES e KPC; Classe B metalo β-lactamase é composta pelas enzimas MBL VIM e IMP, e a Classe D oxacilinases, essa aparece em menor frequência. A enzima Serratia marcescens (SME) é codificada pelo gene cromossomal bla SME, fato que dificulta sua disseminação. Ela tem sido encontrada exclusivamente em espécies de Serratia marcescens apresentando três variantes, as quais diferem entre si em apenas um ou dois aminoácidos. Já a enzima Espectro Estendido Guiana (GES) foi encontrada primeiramente em um paciente da Guiana em isolado de Klebsiella pneumoniae. Essa família possui nove diferentes membros, dos quais, apenas 1, 2, 4 e 5 apresentam atividade carbapenemase. Essa enzima tem sido encontrada em espécies de Pseudomonas aeruginosa e em outros membros de enterobactérias. Já a enzima Imipenemase/ Não Metalocarbapenemase (IMI/NMC) forma dois sub grupos IMI e NMC-A ( Rasmussen & Høiby 2007, Gulmez et al. 2008). As enzimas MBL hidrolisam todos os β-lactâmicos, com exceção dos monobactâmicos. Elas não são inibidas pelos inibidores de β-lactamases, mas são inibidas por agentes quelantes como EDTA. Elas são produzidas intrinsecamente pelas bactérias Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Chryseobacterium meningosepticum, 19

33 Legionella gormaniie e Aeromonas sp. Ao contrário das MBL codificadas por cromossomos, cuja frequência está ligada à frequência da espécie, a detecção e frequência de MBL transferíveis ou adquiridas têm aumentado ultimamente (Giakkoupi et al. 2005, Cavalcanti et al. 2012) A carbapenemase de maior importância clínica é a KPC, devido à sua alta frequência e associação com altas taxas de morbimortalidade. Essa é codificada pelo gene bla KPC, o qual é carreado por plasmídeos de vários tamanhos. Estudos demonstraram que esse gene é transponível entre diferentes elementos genéticos. Estudos sugerem a presença de um transposon Tn 4401, o qual é responsável por intermediar a mobilização e rápida disseminação da enzima KPC entre as diferentes espécies. Esse transposon contém uma enzima transposase, uma resolvase, o gene bla KPC e duas sequências de inserção (IS) ISK pn 6 e ISK pn 7 ( Shen et al. 2009, Gootz et al. 2009). As carbapenemases do tipo KPC apresentam 10 variantes (KPC -2 a KPC 11). Elas diferem entre si em 1 ou 2 pontos de mutação. Múltiplos sequenciamentos mostraram que a enzima possui três sítios ativos altamente conservados entre si. O primeiro elemento é a tríade Ser X-X-Lys, onde X representa um resíduo variável, Ser é serina e Lys - lisina. O segundo motivo seria Ser Asp-Arn, na posição 130. O terceiro resíduo é o aminoácido glicina na posição 166 (Rasmussen & Høiby 2007). Os plasmídeos que transportam o gene bla KPC também transportam genes de resistências para várias classes de antibióticos. Isso se deve a múltiplos pontos de pressão seletiva, principalmente no ambiente clínico, onde isolados são expostos às penicilinas, cefalosporinas dentre outros antibióticos. Essa pressão constante favorece uma relação endêmica com esses isolados durante muito tempo e contribui para a disseminação de plasmídeos entre as espécies. Um estudo recente mostrou que um isolado continha o gene bla KPC em dois diferentes plasmídeos, refletindo a habilidade do gene em se mobilizar mesmo dentro da mesma célula (Rasmussen 1997, Gootz 2009). Os isolados produtores de enzima KPC podem ser difíceis de detectar, visto que, a elevação do MIC acima do valor preconizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI 2011 nem sempre é evidente, ou os laboratórios usam testes rápidos cujo procedimento implica em pequena quantidade de inóculo bacteriano, gerando um MIC dentro da faixa de susceptibilidade. Esse fato constitui um desafio terapêutico, pois o tratamento inadequado contribui significativamente com o aumento de mortalidade e morbidade nos pacientes (Gaibani et al. 2011, Robledo et al. 2011). 20

34 1.3- MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS PRODUTORAS DE β-lactamase Como técnicas para detectar bactérias produtoras de ESBL os laboratórios de microbiologia utilizam dois tipos de testes. Os primeiros são chamados de teste de triagem, onde a presença de certas características faz com que o microbiologista suspeite da bactéria ser produtora dessa enzima. O antibiograma tradicional, cuja interpretação segue critérios estabelecidos pelo CLSI, o teste de diluição em caldo e os métodos de automação, como o Vitek e MicroScan são os mais usados na rotina laboratorial. Os outros testes são chamados de testes confirmatórios, os quais são baseados no uso de substâncias inibidoras de β- lactamases, como o ácido clavulânico. Caso a zona de inibição sofra aumento pela adição do inibidor de β-lactamase trata-se da presença de ESBL. Como testes confirmatórios os laboratórios de microbiologia se utilizam do método E-Test, método da dupla difusão ou método de aproximação de discos e método da adição do ácido clavulânico (Santos 2009). O método E-test utiliza uma fita plástica que contém concentrações crescentes do agente em estudo e é colocada sobre uma placa de ágar Müeller-Hinton semeado com o inóculo bacteriano padronizado na escala 0,5 de Mac Farland. De um lado da fita há uma cefalosporina (como a ceftazidima) e do outro lado a cefalosporina associada ao ácido clavulânico numa concentração fixa. Caso haja uma diminuição da CIM em pelo menos 3 diluições o teste confirma presença de ESBL, conforme ilustrado na figura 7 (Júnior et al. 2004). Figura 7: Região superior: antibiótico sem associação com o ácido clavulânico (MIC > 32µg/mL). Região inferior cefalosporina associada ao ácido clavulânico (MIC > 0,25µg/mL). Fonte: Swanston & Akpaka (2008) 21

35 O método da dupla difusão ou método de aproximação do disco é feito mediante a sinergia de duplo disco. Realiza-se a difusão em ágar Müeller-Hinton inoculado com uma suspensão bacteriana ajustada com o padrão de 0,5 de Mac Farland, logo após coloca se os discos de antibióticos com carga padronizada de cefalosporinas de terceira geração, como cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona dispostos a uma distância de 20 mm de discos de amoxicilina/ácido clavulânico. É considerada sinergia positiva (ESBL positiva) quando se observa uma ampliação do halo de inibição em algumas das cefalosporinas ou o aparecimento de uma terceira zona irregular (ghost zone) entre os discos compostos e o disco de um dos antibióticos β-lactâmicos. É a técnica mais usada nos laboratórios de microbiologia devido à fácil execução e baixo custo, a qual está ilustrada na figura 8 (Murray et al. 2006). Figura 8: Resultado positivo para ESBL onde se observa uma zona fantasma entre o disco de amoxicinlina/ácido clavulânico e cefoxitina. Legenda: AMC-amoxicilina/ácido clavulânico, CAZceftazidima, ATM-aztreonam, CTX-cefotaxima, CFO-cefoxitina. Fonte: Corção et al. (2009). O método de adição do ácido clavulânico ao disco de ceftazidima baseia-se na comparação do tamanho do halo formado em torno dos discos de ceftazidima (30µg) com o halo do disco de ácido clavulânico/cefotaxima (10µg/30µg). Um aumento maior ou igual a 5 mm no halo de inibição do disco composto comparado ao simples indica bactéria produtora de ESBL ( Figura 9) (Silva & Lincopan 2012). 22

36 Figura 9: Lado direito da figura disco de cefotaxima e lado esquerdo disco combinado de cefotaxima e ácido clavulânico. Teste positivo para ESBL. Fonte: Corção et al. (2009). Como alternativas aos métodos citados anteriormente, surgiram os métodos automatizados, os quais se baseiam em painéis de microdiluição disponíveis para comercialização, principalmente para os sistemas MicroScan e Vitek. A análise fenotípica da bactéria por este método proporciona uma padronização e rapidez, o que garante boa consistência dos resultados em detrimento dos testes baseados em disco com resultados após horas. No entanto, o método automatizado apresenta algumas desvantagens quando comparado aos de difusão em ágar, pois, certas bactérias não crescem ou o fazem pobremente após 4-5 horas de incubação, como Proteus sp, Morganella sp, Providencia sp, Yersinia sp dentre outras ( Júnior et al. 2004). É de suma importância mensurar a frequência de bactérias produtoras de β-lactamases, especialmente as ESBL, para que se possa estabelecer como rotina no laboratório de microbiologia clínica a inclusão de antibióticos específicos nos testes de suscetibilidade. A rápida e correta identificação de bactérias produtoras de β-lactamases é essencial para o sucesso no tratamento terapêutico do paciente. A fim de superar as limitações dos testes supracitados, os quais estão sujeitos à variáveis como concentração do inóculo, clones diferentes em uma mesma colônia que dificulta a interpretação dos resultados dos testes e induz a laudos falsos negativos, as técnicas de biologia molecular surgem como uma ferramenta importante por não estarem sujeitas a essas variáveis. 1.4 MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO DE CARBAPENEMASE Os testes de triagem para identificação de espécies produtoras de enzimas KPC são os mesmos utilizados na triagem de espécies produtoras de ESBL. No entanto, como teste confirmatório é utilizado o teste de Hodge modificado. Ele é feito em uma placa com ágar 23

37 Müller Hinton previamente semeada com Escherichia coli (ATCC 25922) cepa sensível a todas as classes de antibióticos, ajustada na escala 0,5 de Mac Farland. No centro da placa é colocado um disco de antibiótico carbapenêmico, geralmente o ertapenem. Em seguida, a placa é semeada no sentido ponta da placa até o disco de antibiótico com o isolado que se deseja confirmar a presença de KPC e em outra reta é semeada a cepa padrão controle positivo para KPC ATCC BAA 1705 (Figura 10). Em volta do ertapenem é formado um halo de inibição, visto que, a Escherichia coli previamente semeada é sensível ao mesmo. Caso a espécie a ser testada quanto à presença de KPC seja positiva, o halo de inibição sofre alteração formando uma seta, visto que, o ertapenem é inibido pela enzima KPC e a Escherichia coli consegue crescer junto com a espécie teste confirmando o resultado como KPC positiva (Figura 10) ( Rossi et al. 2009). Figura 10: Teste modificado de Hodge para produção de KPC. Notar a distorção do halo de inibição, que é indicativa da produção de carbapenemase pela amostra de K. pneumoniae testada. Fonte: Rossi et al (2009). 24

38 2- JUSTIFICATIVA A emergência e disseminação de enzimas β-lactamases, especialmente as ESBL nas Bactérias Gram Negativas tem sido descritas mundialmente como emergência clínica devido à grande frequência desses isolados em infecções relacionadas com a assistência em saúde, principalmente no tecido sanguíneo em pacientes hospitalizados. As frequências entre os genes responsáveis pela produção de ESBL e carbapenemase variam entre si e entre as espécies bacterianas. Essas variações fazem com que cada região tenha características próprias, com algumas espécies bacterianas prevalecendo juntamente com um determinante genético (Bayran & Balci, 2006). Com isso, cabe a cada região fazer estudos epidemiológicos a fim de saber quais espécies de BGN são mais frequentes quanto à presença de ESBL e KPC e dentre os genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC qual é o mais responsável pela presença desses mecanismos. Os dados epidemiológicos são importantes na criação de guias que auxiliem os médicos na tomada de decisões acerca da melhor terapia a ser usada em cada paciente. Para isso, a biologia molecular apresenta-se como uma ótima ferramenta, visto que, apresenta alta sensibilidade e especificidade na detecção de mecanismos genéticos. O laboratório de microbiologia do Hospital das Clínicas de Goiânia tem detectado um número crescente de BGN produtoras de ESBL e carbapenemases. No entanto, a frequência dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC e de espécies produtoras das mesmas em amostras sanguíneas não está bem caracterizada neste serviço. Portanto, o estudo vem contribuir para um melhor entendimento desta problemática na realidade local. 25

39 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Determinar a frequência dos genes de resistência à ESBL bla TEM, bla SHV, bla TEM e carbapenemase bla KPC em Bactérias Gram Negativas isoladas de hemoculturas de pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás durante o período de 31 de janeiro de 2011 a 31 de janeiro de OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar o perfil de suscetibilidade dos isolados no estudo; Determinar a frequência de ESBL e carbapenemase nas diferentes espécies de Bactérias Gram Negativas; Comparar a detecção de ESBL e Carbapenemase por métodos fenotípicos e moleculares; Avaliar a distribuição dos genes bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC entre as espécies de Bactérias Gram Negativas. Caracterizar molecularmente os isolados bacterianos através da PFGE; Investigar possíveis clusters responsáveis pela infecção por isolados ESBL e KPC positivos. 26

40 4 MÉTODOS 4.1 AMOSTRAS BACTERIANAS Esse estudo faz parte do Projeto intitulado de Epidemiologia, prevenção e controle de infecções em hospital universitário de Goiânia aprovado no Comitê de Ética do HC-UFG, apresentando como número de registro As amostras bacterianas utilizadas nesse projeto foram obtidas de hemoculturas, coletadas em pacientes hospitalizados no Hospital das Clínicas de Goiânia (HC-UFGhospital de cuidados terciários, com admissões/ano e 300 leitos). Foram utilizadas apenas as amostras que foram positivas para a presença de BGN. As amostras de sangue foram coletadas mediante pedido médico devido à suspeita clínica de infecção sanguínea, no período de 31 de janeiro de 2011 a 31 de janeiro de 2012 Os controles de qualidade das reações de PCR para o gene bla KPC foram feitos utilizando as cepas padrão Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1705, como controle positivo e Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 1706, como controle negativo. Já nas reações de PCR, a fim de identificar os genes ESBL bla TEM, bla SHV e bla CTX-M, como controle positivo foi utilizada a cepa Klebsiella pneumoniae ATCC , obtidas no LACEN GO ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA As hemoculturas foram coletadas mediante critério médico e processadas no sistema automatizado Bactec (Biomerieux) utilizando frascos Bactec Plus Aerobic, Bactec Plus Anaerobic e Bactec Plus F. Os frascos permaneceram incubados à 37 C sob agitação e monitorização contínua por 5 dias. As amostras que apresentaram crescimento tiveram uma alíquota retirada para proceder à coloração de Gram e análise no microscópio óptico. As culturas positivas para bactérias Gram negativas foram semeadas em ágar Mac Conkey e colocadas em estufa à 37 C durante 24 horas. Após o período de incubação, a cultura foi preparada para análise pelo sistema automatizado Vitek 2 (biomérieux ) que baseia-se em dois testes simultâneos o de identificação e suscetibilidade aos antimicrobianos. Para isso, foram feitas duas diluições seriadas, onde a primeira foi feita da seguinte forma: em um tubo é colocado solução salina estéril e uma quantidade de bactérias suficientes para atingir a concentração de 0,5 de Mac Farland para avaliação do MIC e uma segunda diluição para os testes bioquímicos e posterior 27

41 identificação da espécie bacteriana. Após três horas, o teste de identificação é determinado pelo aparelho Teste de Suscetibilidade aos antimicrobianos Os painéis utilizados no VITEK 2 contêm os antibióticos preconizados pelo CLSI para pesquisa de mecanismos de resistência nas espécies presentes nas amostras, assim como também, os pontos de corte utilizados para determinar o perfil de sensibilidade aos mesmos. Para os testes fenotípicos das BGN foram utilizados os seguintes antibióticos: Ceftriaxone, Cefepime, Ceftadizime, Cefoxitina, Aztreonam, Amoxacilina com Ácido Clavulânico, Imipenem, Meropenem, Ertapenem. Os testes de identificação primária foram feitos no laboratório de microbiologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás Condições de armazenamento Após identificação e determinação do perfil de suscetibilidade, as amostras foram enviadas ao Laboratório de Bacteriologia Molecular do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP-UFG). Todos os isolados, assim como as cepas padrões, foram re-semeadas em ágar Mac Conkey no Laboratório de Bacteriologia Molecular do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP-UFG) e colocadas em estufa a 37 C, durante 24 horas. Em seguida, toda a massa bacteriana foi removida com swab estéril e armazenada em solução de (Trypitic Soy Broth- caldo tripticaseina de soja) TSB acrescido de 20% de glicerol e estocadas em freezer 70 C para preservação das mesmas. A partir desses congelados foram feitas as extrações de DNA Extração de DNA Bacteriano As amostras congeladas em TSB a 20 % de glicerol, foram reativadas em 3 ml de caldo TSB, o qual foi incubado em estufa a 37 C, durante 24 horas. Foram feitas extrações de DNA cromossomal e plasmidial. Para a extração de DNA cromossomal 1mL de cultura crescida do TSB foi transferido para tubos de microcentrífuga (tipo eppendorf) centrifugado à 5000g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento re-ssuspendido em 400µL de tampão TE (10 mm TrisHCl, 0,1 mm EDTA ph 8,0) contendo de 3µL de lisozima e a suspensão foi incubada em banho maria à 37ºC por 1h30min. Posteriormente, foi 28

42 acrescentado 70µL de SDS (10%) e 12µL de proteinase K (20mg/mL) e incubado a 56ºC por 10 min. Em seguida, foi adicionado 100µL de NaCl (5,0M) e 80mL de solução CTAB/NaCl (10 % CTAB e 0.73M NaCl), agitado lentamente até atingir aspecto leitoso e incubado a 65ºC por 10 minutos. 650µL de clorofil (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1, v/v) foi acrescentado, seguido de agitação por 30 segundos. A solução foi centrifugada a 12000g por 5 min. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, onde houve a adição de 400µL de isopropanol gelado e o sistema foi homogeneizado. Após homogeneização, foi incubado a -20ºC por 24 horas, centrifugado a 18000g a 4ºC por 20 minutos e o sedimento foi lavado com 1mL de álcool etílico a 70% gelado. O DNA foi re-ssuspendido em 50µL de água miliq. Uma alíquota do DNA foi analisada em gel de agarose a 0,8% e corada com brometo de etídeo após corrida eletroforética; A extração de DNA plasmidial foi feita pelo método de lise alcalina. Um ml da cultura crescida em TSB foi transferido para cada tubo do tipo eppendorf e centrifugado a 5000g por 10 min. O sobrenadante foi descartado. O sedimento foi re-ssuspendido completamente com 210µL de solução I (150mM TrisHCl, 10 mm EDTA ph 8,0- contendo 10µg de RNAse em cada amostra). Em seguida, foram acrescentados 210µL da solução alcalina II (200mM NaOH, 1% de SDS). O tubo foi misturado lentamente por inversão de tubos e incubado a temperatura ambiente por 5 min. Depois foram adicionados 280µL da solução III (acetato de sódio 3M, ácido acético 2M, ph 4,8-5,0 ) e misturado imediatamente por inversão por 10 vezes e centrifugado por 10 minutos a g. O sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf e foram adicionados 560µL de isopropanol gelado, homogeneizado por inversão e incubado por 10 min a temperatura ambiente. Em seguida, foi centrifugado por 15 min a g. O sedimento foi lavado com 500µL de etanol a 70% gelado e deixado secar. O mesmo foi re-ssuspendido com 30µL de água miliq Condições de amplificação do DNA As amplificações do DNA foram realizadas para os seguintes genes: bla TEM, bla SHV, bla CTX-M e bla KPC. Os oligonucleotídeos iniciadores para cada alvo estão descritos na tabela 2. O método de PCR utilizado foi o convencional. 29

43 As condições para amplificação dos genes bla: Desnaturação inicial: 94 C por 3 minutos, seguidos de 30 ciclos de: ü Desnaturação a 95 C por 30 segundos; ü Anelamento de acordo com o alvo descrito na tabela 2, 1 minuto; ü Extensão a 72 C por 1 minuto; extensão final a 72 C final por 4 minutos Tabela 2: Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores, tamanho dos produtos e do PCR para detecção de mecanismos de resistência. Oligonucleotídeos TEM Fw TEM Rv SHV Fw SHV Rv CTX-M Fw CTX-M Rv KPC Fw KPC Rv Gene alvo bla TEM bla SHV bla CTX-M bla KPC Sequências dos oligonucleotídeos (sentido 5-3 ) ESBL GGGGAGCTCATAAAATTCTTGAAGAC GGGGGATCCTTACCAATGCTT ATGCGTTATATTCGCCTGTG GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG CGCTTTGCGATGTGCAG ACCGCGATATCGTTGGT Carbapenemase TGTCACTGTATCGCCGTC CTCAGTGCTCTACAGAAAACC Tamanho dos produtos em pares de bases Temperatura de Anelamento 861 pb pb pb bp 58 Fonte: gene bla TEM, bla SHV e bla CTX-M Jiang et al, 2006 e bla KPC. Fonte: Tenover et al Os reagentes do mix e devidas quantidades utilizadas estão descritas a seguir: ü Água mili Q: 7,8µL ü Primer forward: 2µL ü Primer reverse: 2µL ü Tampão concentração 5X: 4µL ü dntps: 2µL ü Enzima Taq polymerase: 0,2µL ü DNA: 2µL 30

44 4.2.5 Eletroforese em Gel de Agarose Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5 %, contendo 0,5 µg/ ml de brometo de etídeo, durante aproximadamente 2 horas a 120 volts. No gel foi aplicado marcador de peso molecular de DNA 1KB plus (Invitrogen) para ser usado de padrão de comparação dos tamanhos esperados das amplificações. Em seguida, o gel foi fotografado no fotodocumentador (Biorad) para posterior análise. 4.3PULSED FIELD GEL ELETROPHORESIS (Ribot et al. 2006) A bactéria foi inoculada em placas com meio de cultura TSA durante horas. Em seguida, com auxílio de swab umedecido com Tampão de Suspensão (100mM Tris, 100mM EDTA ph 8.0),as colônias foram transferidas para tubos do tipo Falcon contendo 2mL de tampão de suspensão. A concentração de células foi ajustada para em comprimento de onda de 610nm em espectrofotômetro. A suspensão de bactérias foi então utilizada para confecção dos blocos de agarose (plugs). Os plugs foram preparados com 200µL da suspensão de bactérias, 10µL de proteinase K (20mg/mL) e 200µL de agarose de corrida para PFGE 1,0% preparada em tampão TE (10mM Tris, 1mM EDTA, ph 8.0) e 1,0% de SDS. Os plugs foram submetidos à lise e desproteinização em 5mL de tampão de lise [50mM Tris, 50mM EDTA ph 8,0; 1,0% sarcosil] e 0,1mg/mL de proteinase K com incubação a 54 C durante 1,5 a 2 horas em banhomaria com agitação ou shaker ( rpm). Após incubação, os plugs foram lavados inicialmente com 10-15mL de água Tipo I esterilizada pré aquecida a 50 o C em banho-maria com agitação ou shaker por /50 o C. Depois, foram lavados quatro vezes com 10-15mL de tampão TE (10mMTris, 1mM EDTA, ph 8.0) esterilizado e pré-aquecido a 50 o C, em banho-maria com agitação ou shaker por /50 o C. Após a última lavagem, os plugs foram estocados em Tampão TE sob refrigeração. O DNA contido no plug foi digerido com 40-50U de enzima de restrição XbaI (Invitrogen ) a 37 o C durante 2h e a separação dos fragmentos de DNA foi feita em gel de agarose 1,0% em 2L de tampão TBE 0,5X (Tris 90mM, ácido bórico 90mM e EDTA 2mM), por eletroforese em gel em campo pulsado no sistema CHEF DRII (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA) nas seguintes condições: 31

45 - E. coli: 19h; 6,0V/cm; 14 o C; switch s; - K. pneumoniae: 20h; 6,0 V/cm; 14 o C; switch 5 55s. Em seguida o gel foi corado com brometo de etídeo (0,5mg/mL) durante 30minutos), descorado em H 2 O destilada durante 15minutos, visualizado em fotodocumentador sob iluminação ultravioleta e capturados com o sistema Molecular Imager GelDoc XR (Bio- Rad ). As fotos foram digitalizadas e salvas como arquivo TIF para análise posterior. Foi utilizado como padrão de peso molecular Lambda DNA ladder PFGE (Bio-Rad ) posicionado na primeira e última coluna de cada gel. Os isolados bacterianos que apresentaram semelhança de 100% foram consideradas como clones bacterianos, enquanto que, aqueles que apresentaram entre 80 % e 99% foram considerados do mesmo cluster Teste de Hodge Modificado O teste de Hodge modificado foi realizado da seguinte forma: uma placa de com ágar Müller Hinton previamente semeada com Escherichia coli (ATCC 25922) cepa sensível a todas as classes de antibióticos, ajustada na escala 0,5 de Mac Farland. No centro da placa foi colocado um disco de meropenem. Em seguida, a placa foi semeada no sentido ponta da placa até o disco de antibiótico com o isolado 27LJ e em outra placa foi feito o mesmo procedimento para o isolado 45LJ. 4.8-Análise de Dados A análise de dados foi feita de forma prospectiva a fim de calcular a frequência de genes responsáveis pela produção de β-lactamases e frequência de Bactérias Gram Negativas. A análise do perfil dos fragmentos de macrorrestricção resultantes do PFGE foi inicialmente realizada por inspeção visual segundo os critérios sistematizados por Tenover et al. (1995). Adicionalmente, os géis de PFGE foram utilizados como imagens preto e branco invertidas de 8 bits e processados pelo programa BioNumerics (versão 5.0; Applied Maths, Ghent, Belgium). O processo de normalização intra e inter géis foi padronizado com o marcador de peso molecular Lambda DNA ladder PFGE (Bio-Rad ). A construção do dendrograma, para avaliar a relação genética entre as cepas foi realizada utilizando-se o coeficiente de similaridade de Dice, baseado na posição e presença das bandas e no algoritmo de análise filogenética UPGMA (Unweighted Pair-Groups Method). Os parâmetros de otimização e tolerância foram utilizados com os respecticos valores, 0,7 e 1,0%. Cada cluster 32

46 de isolados foi definido como um grupamento de perfis (n 2) apresentando um coeficiente de similaridade acima de 80% (Carriço et al. 2005). 33

47 5 RESULTADOS 5.1-Caracterização dos isolados Foram obtidos 79 isolados de Bactérias Gram Negativas, a partir de hemoculturas, no período proposto. Essas foram provenientes de vários serviços do Hospital das Clínicas de Goiânia, tais como, clínica médica, UTI e pronto socorro. Desses, a espécie mais frequente foi a Klebsiella pneumoniae (n=24), seguida de Escherichia coli (n=16) e Acinetobacter baumannii (n=13). Do total de isolados analisados, 57 isolados foram de enterobactérias e 22 foram BGN-NF. Esses estão descritos na tabela 3. Tabela 3: Distribuição das frequências de Bactérias Gram Negativas a partir de hemocultura. Espécies Número de Frequência Isolados k. pneumoniae 24 30,38% E. coli 16 20,25% A.baumannii 13 16,45% E. cloacae 9 11,39% P. aeruginosa 8 10,13% S. marcescens 3 3,80% C. freundii 2 2,53% E. aerogenes 1 1,26% E. asburiae 1 1,26% P. mirabilis 1 1,26% S. maltophila 1 1,26% Total ,00% Com relação à origem das amostras, foi verificado que o serviço de pronto socorro (n= 23), foi o que mais contribuiu com isolados na amostra geral seguida pela clínica médica (n=22) e UTI (n=10) como descritos na tabela 4. Dentre as espécies de BGN, as mais bem distribuídas entre os serviços foram Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii e Enterobacter cloacae. 34

48 Tabela 4: Origem dos isolados bacterianos em hemoculturas do HC-UFG Espécies P S C M UTI UTI Neo PED C G UTI C TRS MO ORT k. pneumoniae E. coli A.Baumanii E. cloacae P. aeruginosa S. marcensens C. freundii E. aerogenes E. asburinae P. mirabilis S. maltophilia Total Legenda:OS: Pronto Socorro; CM: Clínica Médica; UTI- C: UTI cirúrgica, UTI neo: UTI Neonatal; PED: Pediatria; CG: Cirurgia Geral; TRS: Terapia Renal Substitutiva, MO: Maternidade e Obstetrícia; ORT- Ortopedia Avaliação da suscetibilidade antimicrobiana Os isolados do grupo das Enterobactérias foram avaliados quanto à sua suscetibilidade aos antimicrobianos, de acordo com o CLSI (2011). De acordo com o suplemento M100-S21, dentre as enterobactérias são consideradas suspeitas de ESBL aquelas que apresentam resistência a um dos seguintes antibióticos ou mais de um: cefpodoxime, ceftaxima, ceftazidima, aztreonam e ceftriaxona. Dos 59 isolados obtidos, o Vitek 2 identificou 18 isolados (31,57%). Esses apresentaram resistência a mais de uma classe de antibióticos em relação aos isolados não ESBL, apresentando 44,44% (n=8) de resistência à gentamicina e 44,44% (n=8) ciprofloxacina, enquanto que, dentre os isolados não ESBL apenas dois isolados eram resistentes à ciprofloxacina e à gentamicina. Entre as amostras consideradas ESBL, 94,44% (n=17) eram resistentes à cefotaxima, ceftazidima, cefepime e aztreonam. Todos esses isolados eram sensíveis à colistina e tigeciclina. Considerando o Aztreonam, entre as ESBL 100% dos isolados eram resistentes ao mesmo. Em relação aos carbapenêmicos, apenas uma amostra mostrou resistência ao mesmo. Na tabela 5 estão apresentados os dados do antibiograma para os isolados de enterobactérias ESBL. O isolado que está em destaque na tabela também é KPC. 35

49 Tabela 5: Antibiograma dos isolados de Enterobacteriaceae Antibiótic os/ Isolados AM P/ SUB CF X CT X CF Z CE P AT Z 01 LJ R S R R R R S S S S S R S S 04 LJ R S R R R R S S S S R R S S 12 LJ R I - R R R S S S S S S S S 19 LJ R S R R R R S S S S R R S S 21 LJ R R R R R R S S S S R S S S 22 LJ R S R R R R S S S S S S S S 24 LJ R S R R R R S S S S S R S S 25 LJ R I R R R R S S S S S R S S 27 LJ R R R R R R R R R R R R S S 28 LJ R R R R R R S S S S R S S S 30 LJ R S R R R R S S S S R R S S 33 LJ - S R - R R S S S S R R S S 36 LJ R S R R R R S S S S S S S S 39 LJ R S R R R R S S S S S S S S 46 LJ R S R R R R S S S S S S S S 48 LJ R S R R R R S S S S I S S S 56 LJ R S R R R R S S S R R S S S 58 LJ R S R R R R S S S S S R S S Legenda: AMP/SUB Ampicilina/Sulbactam, CFX-Cefoxitina, CTX-Cefotaxima, CFZ-Ceftazidima, CEP- Cefepime, ATZ-Aztreonam, ERT- Ertapenem, IMI-Imipenem, MER-Meropenem, AMK Amicacina, GNT- Gentamicina, CPR- Ciprofloxacina, TIG-Tigeciclina e Col-Colistina. Ífen significa que o antibiótico não foi testado para aquele antibiótico. ER T IM I ME R AM K GN T CP R TI G CO L No grupo das BGN-NF (22 isolados), 54,54% (n=12) eram resistentes à ciprofloxacina, ceftazidima, cefepime, imipenem e meropenem, enquanto que, 31,81 (n=7) isolados apresentaram resistência à ciprofloxacina, ceftazidima, cefepime, imipenem, meropenem e ao aztreonam. 22,72% (n=5) eram resistentes à amicacina. Na tabela 6 estão apresentados os dados do antibiograma dos 22 isolados de BGN-NF. 36

50 Tabela 6: Antibiograma dos isolados BGN-NF. Amostras/An tibióticos CFZ CE P ATZ IMI ME R AM K GNT CPR COL 01 FM S R I S S S R S S 02 FM S S S S S S S S S 08 FM S S S S S S S S S 14 FM S S S S S S S S S 16 FM S S S S S S S S S 21 FM S S S S S S S S S 05 FM R R R R R S S R S 07 FM S S R S S S S S S 09 FM R R R R R R R R S 10 FM R R R R R R R R S 11 FM R R R R R R R R S 12 FM R R R R R R R R S 13 FM R R R R R S S R S 15 FM R R R R R R R R S 17 FM FM R R - R R S S R S 19 FM R R - R R S S R S 20 FM R R - R R S S R S 22 FM R R - R R I R R S 23 FM R R - R R S I R S 24 FM I S - S S S S S S Legenda:CFZ-Ceftazidima, CEP-Cefepime, ATZ-Aztreonam, IMI-Imipenem, MER -Meropenem,AMK Amicacina, GNT-Gentamicina, CPR - Ciprofloxacina e Col-Colistina.R- resistente; I-intermediário e S sensível; Ífen significa que o antibiótico não foi testado paraaquele antibiótico Concentração Inibitória Mínima (CIM) De acordo com o Vitek 2, dos 57 isolados de enterobactérias, apenas 18 (31,58%) foram considerados produtores de ESBL. Dentre esses, três isolados não apresentaram nenhum dos genes pesquisados. Dentre as cefalosporinas usadas no teste, considerando o MIC da cefoxitina, apenas 3 (16,67%) amostras apresentaram perfil de resistência com CIM maior ou igual a 32. Em relação à cefotaxima, 14 (77,78%) amostras apresentaram perfil de resistência com CIM maior ou igual a 4. No entanto, a CIM das BGN-NF foi variável entre 8 e 64 µg/ml. Na tabela 7 estão apresentados os dados do MIC dos 18 isolados de enterobactérias ESBL. 37

51 Avaliando o ponto de corte preconizado pelo CLSI (2011) dos antibióticos utilizados no teste confirmatório fenotípico, a cefotaxima foi o substrato que mais detectou isolados produtores de ESBL. O fato do perfil da CIM ser variável para um mesmo antibiótico frente aos isolados ESBL sugere a ocorrência de variações enzimáticas dentro do mesmo grupo. O isolado que está em destaque na tabela também é KPC. Tabela 7: MIC dos isolados Enterobacteriaceae Número Isolados S 8/4; R 32/16 AMP/ SUB S 8; R 32 CFX S 1; R 4 CT X S 4; R 16 S 8; R 32 S 4; R 16 S 0,2 5; R 1 S 1; R 4 S 1; R 4 CFZ CEP ATZ ERT IMI ME R S 16; R 64 S 4; R 16 S 1; R 4 AMK GNT CP R 01 LJ ,5 1 0, LJ ,5 1 0, LJ ,5 1 0, ,25 19 LJ LJ ,5 1 0, ,25 22 LJ ,5 1 0, ,25 24 LJ ,5 1 0, LJ ,25 1 0, LJ LJ ,5 1 0, ,5 30 LJ ,5 1 0, LJ ,5 1 0, LJ ,5 1 0, ,25 39 LJ ,5 1 0, ,25 46 LJ ,5 2 0, ,25 48 LJ ,5 1 0, LJ ,5 1 0, LJ ,5 1 0, Legenda: AMP/SUB: Ampicilina/Sulbactam; CFX: cefoxitina; CTX: cefotaxima; CFZ: ceftazidima; CEP: cefepime; ERT: ertapenem; IMI: imipenem; MER: meropenem; AMK: amicacina; GNT: gentamicina; TIG: Tigeciclina e COL: colistina. Ífen significa que o antibiótico não foi testado para aquele antibiótico. Em relação à CIM das BGN-NF foi constatada uma alta frequência de resistência às múltiplas classes de antibióticos. A maioria dos isolados era resistente à ceftazidima, cefepime, aztreonam, imipenem, meropenem e ciprofloxacina. No entanto, todos os isolados eram sensíveis à colistina (Tabela 8). O isolado 17 FM, uma Stenotrophomona maltophilia foi testado apenas para os antibióticos levofloxacina, trimetoprim e sulfametoxazol, sendo sensível a todos eles. 38

52 Tabela 8 MIC dos isolados BGN-NF. Ponto de Corte Isolado S 8; R 32 CF Z S 8; R 32 S 8; R 32 S 4; R 16 S 4; R 16 S 16; R 64 S 4; R 16 S 1; R 4 S 2; R 8 CEP ATZ IMI MER AMK GNT CPR COL 01 FM , FM , FM , ,25-05 FM ,5 07 FM , FM FM ,5 10 FM ,5 11 FM ,5 12 FM ,5 13 FM ,5 14FM , ,25 0,5 15 FM FM , FM FM ,5 19 FM ,5 20 FM ,5 21 FM FM ,5 23 FM ,5 24 FM ,5 LEGENDA: CFZ-Ceftazidima; CEP-Cefepime; ATZ-Aztreonam; IMI-Imipenem; MER-Meropenem; AMK-Amicacina; GNT- Gencitabina; TIG- Tigeciclina e COL-colistina. I-intermediário, R resistente e S- sensível; Ífen significa que o antibiótico não foi testado paraaquele antibiótico Detecção Genética de ESBL A produção de ESBL foi confirmada através da PCR convencional na maioria dos isolados das enterobactérias. Dentre as enterobactérias, a espécie mais frequente foi a Klebsiella pneumoniae (n=24; 42,10%), seguida de Escherichia coli (n=16; 28,07%) e Enterobacter cloacae (n=9; 15,78%). Além de K. pneumoniae ser a espécie mais frequente dente as enterobactérias foi também a que mais apresentou diversidade genética entre os mecanismos de resitência pesquisados. A tabela 9 apresenta as frequências de cada espécie de enterobactérias para a produção de ESBL e as respectivas frequências de cada gene bla pesquisado. 39

53 Tabela 9: Frequência dos genes bla CTX-M cromossomal, bla CTX-M plasmideais, bla TEM, bla SHV e bla KPC Espécies Frequência ESBL CTX- M p CTX- M c TEM SHV KPC k. pneumoniae E. coli E. cloacae S. marcensens C. freundii E. asburinae P. mirabilis Legenda: CTX-Mc gene bla CTX-M cromossomal, CTX-Mp: gene bla CTX-M plasmidial, TEM: gene bla TEM, SHV: gene bla SHV e KPC: gene bla KPC Dentre os principais genes que codificam as enzimas ESBL, o mais frequente foi o gene bla CTX-M (n=35; 79,54%). Esse pode ser encontrado no gene cromossomal ou plasmidial. No entanto, foi mais encontrado em plasmídeo (n= 30; 68,18%) que cromossomal (n=5; 11,36%). Esse gene também foi o mais encontrado nas diferentes espécies isoladas, seguido pelo gene bla SHV (N= 18, 40,90%) e bla TEM (n=14, 31,81) conforme descritos na tabela 9. Dentre as espécies de Klebsiella pneumoniae, seis apresentaram os genes bla CTX-M plasmideal e bla SHV, um apresentou o gene bla CTX-M cromossomal e bla SHV e um apresentou o gene bla CTX-M plasmideal o bla SHV e bla KPC. Dentre as espécies de Escherichia coli, três apresentaram os genes bla CTX-M plasmidias e bla TEM, dois apresentaram o gene bla CTX-M cromossomal e plasmideal e um apresentou gene bla CTX-M cromossomal e plasmideal e bla TEM. Um isolado de Enterobacter cloacae apresentou os genes bla CTX-M plasmideal e bla KPC Carbapenemase Em relação ao gene bla KPC, apenas dois isolados o apresentaram. Um deles foi Klebsiella pneumoniae (27LJ), cujo teste de Hodge modificado está demonstrado na figura 14. Esse isolado também apresentou os genes bla SHV e bla CTX-M plasmidial. O segundo isolado foi Enterobacter cloacae (45LJ), além de apresentar o gene bla KPC, também apresentou o gene bla CTX-M plasmidial. O teste de Hodge modificado para esse isolado foi negativo assim como também o Vtek 2 também não detectou presença de carbapenemase. O teste de Hodge para esse isolado está demonstrado na figura

54 Figura 11: Resultado do teste de Hodge modificado para isolado 27 LJ. Figura 12: Resultado do teste de Hodge modificado para o isolado 45LJ Diferenças entre os resultados do Vitek 2 e o PCR O Vitek 2 conseguiu identificar apenas 18 isolados como ESBL, enquanto que, a técnica de PCR tradicional identificou 44. Dentre os isolados identificados pelo Vitek 2 três não apresentaram os mecanismos estudados os quais estão descritos na tabela

55 Tabela 10: Comparação entre os métodos fenotípicos e genotípicos Isolados VITEK Positivo PCR positivo k. pneumoniae 8 23 E. coli 9 10 E. cloacae 0 6 S. marcescens 0 2 C. freundii 0 1 E. aerogenes 1 0 E. asburiae 0 1 P. mirabilis 0 1 Total Análise da Relação Genética entre as Espécies Bacterianas A técnica de Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE) foi realizada a fim de avaliar a relação entre as espécies isoladas nos diferentes serviços. Essa técnica foi aplicada para comparar os isolados de Klebsiella pneumoniae (Figura 12) e Escherichia coli (Figura 13) por serem as espécies mais frequentes nesse estudo. Dentre os isolados de K. pneumoniae, observamos alta diversidade genética entre os mesmos. Somente três clusters (>80% de similaridade) agruparam dois isolados com 100% de similaridade entre si (isolados 02 e 03; 06 e 10; 48 e 56). Os quatro primeiros são provenientes da clínica médica, enquanto que o isolado 48 é oriundo do pronto socorro e o isolado 56 da UTI Neo Natal. 42

56 Figura 13: Dendograma dos isolados de Klebsiella pneumoniae Dentre os isolados de Escherichia coli a diversidade genética foi ainda maior. Nenhum isolado apresentou identidade de 100% com outro. No entanto, os isolados 25 e 26 e os isolados 7 e 43 foram agrupados em dois clusters (>80% de similaridade), mostrando-se relacionados. O isolado 25 é proveniente da clínica cirúrgica e o 26 do pronto socorro e os isolados 07 e 43 foram oriundos do pronto socorro. 43