Importância da Utilização de Metodologias para a Detecção de ESBL em Espécies de Enterobactérias

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1 Artigo Importância da Utilização de Metodologias para a Detecção de ESBL em Espécies de Enterobactérias Pedro F. Del Peloso, Cassiana C. F. Leite, Henrique P. Silva, Helio M. T. Filho Laboratório Richet - Setor de Microbiologia - Rio de Janeiro Resumo O objetivo desse estudo foi enfatizar o uso de métodos fenotípicos para detectar as cepas produtoras de Beta Lactamases de Amplo Espectro (ESBLs) entre as espécies de Enterobacteriaceae. Um total de 615 espécies de Enterobacteriaceae isolados de amostras clínicas de 5 hospitais localizados no Rio de Janeiro foram estudados. Produtores de Beta Lactamases de Amplo Espectro ESBL foram detectados pelo método de screening (MicroScan Walkaway - Dade Behring) e confirmados pela metodologia de discos combinados. Resultados indicaram que espécies de Klebsiella foram mais prevalentes, com 62% de Klebisella pneumoniae e 7% de Klebsiella oxytoca, seguidos por Escherichia coli (15%), Proteus mirabilis (9%), Enterobacter spp. (5%) e Morganella morganii (2%). A detecção de cepas produtoras de ESBL entre bactérias Gram-negativas é uma importante informação para o laboratório de microbiologia clínica, para os médicos e para os órgãos de saúde pública. Embora as normas preconizadas pelo NCCLS refiram-se à Escherichia coli e Klebsiella spp., a ocorrência de cepas produtoras de ESBL entre outras espécies de enterobactérias tem-se tornado mais freqüente, sugerindo que métodos para a detecção deste mecanismo de resistência deveriam ser usados pelos laboratórios clínicos. Summary The aim of this study is to emphasize the use of phenotypical methods to detect ESBL producers among species of Enterobacteriaceae. A total of 615 specimens of Enterobacteriaceae isolated from clinical samples from 5 hospitals located in Rio de Janeiro were studied. ESBL producers were detected by screening method (MicroScan Walkaway - Dade Behring) and confirmed by the combination disc methodology. Results indicated that Klebsiella species were more prevalent, with 62% of Klebisella pneumoniae and 7% of Klebsiella oxytoca, followed by Escherichia coli (15%), Proteus mirabilis (9%), Enterobacter spp. (5%) and Morganella morganii (2%). The detection of ESBL producers among Gram-negative bacteria is an important information to be given by the clinical microbiology laboratory to clinicians and infection control policies. Although the NCCLS proposed test standards only for Escherichia coli and Klebsiella spp., the occurrence of ESBL producers among other species is becoming more frequent, suggesting that methods for the detection of this mechanism of resistance should be used by clinical laboratories. 118 Sem título

2 Introdução e Objetivos A A produção de Beta Lactamases de Amplo Espectro (ES- BLs) tem sido descrita como um importante mecanismo de resistência a beta-lactâmicos em espécies da Família Enterobacteriaceae, e seu achado constitui um dado clínico relevante. Os beta-lactâmicos constituem a principal classe de antimicrobianos utilizada na prática clínica e a resistência a esta classe em meio aos bastonetes Gram-negativos é um dos principais mecanismos de resistência. Dentre os grupos de beta-lactamases reconhecidas, encontramos as cefalosporinases cromossomiais (AmpC), as enzimas que hidrolizam as carbapenemas e as beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs). O aparecimento das ESBLs restringe as opções terapêuticas utilizadas no tratamento das infecções causadas por microrganismos produtores de beta-lactamases. A detecção de cepas produtoras de ESBL constitui um desafio ao laboratório de microbiologia clínica, com impacto direto no controle deste mecanismo de resistência e no uso indevido de beta-lactâmicos. A produção de beta-lactamases não é facilmente reconhecida nos testes de sensibilidade a antimicrobianos realizados na rotina de um laboratório clínico, e são necessários testes confirmatórios que detectem este fenótipo de resistência. Freqüentemente a identificação de cepas ESBL-produtoras é baseada em características fenotípicas como o aumento da concentração inibitória mínima (CIM) para cefalosporinas de terceira geração e/ou aztreonam. Embora as normas preconizadas pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) refiram-se às espécies Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca e Escherichia coli, a ocorrência de cepas produtoras de ESBL entre outras espécies de enterobactérias tem despertado a atenção dos microbiologistas. Neste trabalho foi avaliada a prevalência de cepas produtoras de ESBL entre amostras de enterobactérias isoladas em cinco unidades de atendimento ambulatoriais e hospitalares do Rio de Janeiro, em um período de seis meses de estudo. Amostras de enterobactérias isoladas de diversos espécimes clínicos foram estudadas. A detecção de cepas produtoras de ESBL foi realizada através da metodologia de screening por equipamento automatizado e posterior confirmação pela metodologia de discos combinados. Os resultados ressaltam a importância da utilização de metodologias confirmatórias para a determinação de cepas produtoras de ESBL com a finalidade de que a correta terapia antimicrobiana seja empregada no tratamento das infecções causadas por estes microrganismos. Casuística e Métodos Foram estudadas 615 amostras de Gram-negativos pertencentes à Família Enterobacteriaceae, isoladas a partir de diversos espécimes clínicos de pacientes atendidos em cinco unidades ambulatoriais e hospitalares do Rio de Janeiro, em um período de seis meses (outubro de 2002 a maio de 2003). A identificação das espécies foi obtida através de equipamento automatizado (MicroScan Walkaway - Dade Behring), bem como os testes de sensibilidade a antimicrobianos (Painéis NUC33 e NC32). Para os isolados das espécies Escherichia coli e Klebsiella spp., os painéis utilizados apresentavam screening para a produção de ESBL. Para as demais espécies de enterobactérias, aquelas que apresentaram CIM elevada para cefalosporinas de terceira geração e/ ou aztreonam, foi realizado teste confirmatório através da metodologia de Discos Combinados, utilizando discos de cefalosporina de 3a geração (Cefpodoxima, Ceftazidima e Cefotaxima) e suas respectivas combinações com inibidor de beta-lactamase (Cefpodoxima/Ácido Clavulânico, Ceftazidima/Ácido Clavulânico, Cefotaxima/Ácido Clavulânico) (Oxoid) em placas de ágar Mueller-Hinton. Os resultados foram considerados positivos para fenótipo pro- 119 Sem título

3 dutor de ESBL quando foi obtida uma zona de inibição maior ou igual a 5mm entre o disco de cefalosporina combinado e o correspondente não-combinado. Resultados Fig. 1 - Prevalência das Espécies de Enterobactérias Isoladas Fig. 2 - Enterobactérias Produtoras de ESBL Fig. 3 - Espécies Produtoras de ESBL As espécies de enterobactérias encontradas ao longo do estudo estão descritas na Figura 1. Um total de 9% das amostras de enterobactérias isoladas eram produtoras de ESBL (Figura 2). Em maior freqüência encontrava-se o gênero Klebsiella, com prevalências de 62% para Klebsiella pneumoniae e 7% para Klesbiella oxytoca, seguidos de Escherichia coli (15%), Proteus mirabilis (9%), Enterobacter spp. (5%) e Morganella morganii (2%) (Figura 3). Dentre as cepas de Klebsiella pneumoniae isoladas ao longo do estudo (n = 114), 30% apresentavam o fenótipo produtor de ESBL, enquanto para a espécie Klebsiella oxytoca (n = 11), 36% apresentavam o fenótipo. Das cepas de Echerichia coli (n = 354), apenas 2,2% das amostras isoladas era produtora de ESBL, enquanto para Enterobacter spp.(n = 47) 6,4% pertenciam ao fenótipo ESBLpositivo. As espécies Proteus mirabilis (n = 57) e Morganella morganii (n = 14) apresentaram o fenótipo em 8,8% e 7,2%, respectivamente (Tabela 1). 120 Sem título

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5 Tabela I - Ocorrência de Fenótipos Produtores de ESBL entre espécies de Enterobactérias Espécies Total Fenótipo Produtor de ESBL Klebsiella pneumoniae (30%) Klebsiella oxytoca 11 4 (36%) Escherichia coli (2,2%) Enterobacter spp (6,4%) Proteus mirabilis 57 5 (8,8%) Morganella morganii 14 1 (7,2%) Laudo Enterobacter cloacae ESBL ID Paciente: Espécime: Status: Final Lavado Broncoalveolar Antimicrobiano CIM Interpretação Amicacin >32 Resistente Amp/Sulbactam >16/8 Resistente Ampicilina >16 Resistente Aztreonam >16 Resistente Cefazolina >16 Resistente Cefepima >16 Resistente Cefotaxima >32 Resistente Cefotetan >32 Resistente Ceftazidima >16 Resistente Ceftriaxona >32 Resistente Cefuroxima >16 Resistente Ciprofloxacina >2 Resistente Gentamicina >8 Resistente Imipenem <=4 Sensível Levofloxacina >4 Resistente Meropenem <=4 Sensível Moxifloxacina >4 Resistente Pip/Tazo >64 Resistente Piperacilina >64 Resistente Ticar/Clav >64 Resistente Tobramicina >8 Resistente Trimeth/Sulfa >2/38 Resistente Enterobacter cloacae 122 Sem título

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7 Laudo Klebsiella pneumoniae IID Paciente: Espécime: Sangue Status: Final Antimicrobiano CIM Interpretação Amicacin <=4 Sensível Amp/Sulbactam >16/8 Resistente Ampicilina >16 Resistente Aztreonam <=8 Sensível Klebsiella pneumoniae Cefazolina >16 Resistente Cefepima 8 Sensível Cefotaxima 16 ESBL?? Cefotetan <=16 Sensível Ceftazidima <=2 Sensível Ceftriaxona >32 ESBL?? Cefuroxima >16 Resistente Ciprofloxacina <=1 Sensível Gentamicina >8 Resistente Imipenem <=4 Sensível Levofloxacina <=2 Sensível Meropenem <=4 Sensível Moxifloxacina <=2 Sensível Pip/Tazo 64 Intermediário Piperacilina >64 Resistente Ticar/Clav >64 Resistente Tobramicina 8 Intermediário Trimeth/Sulfa <=2/38 Sensível 124 Sem título

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9 Laudo Morganella morganii IID Paciente: Espécime: Urina Status: Final Antimicrobiano CIM Interpretação Amicacin 8 Sensível Amp/Sulbactam >16/8 Resistente Ampicilina >16 Resistente Aztreonam >16 Resistente Cefazolina >16 Resistente Cefepima >16 Resistente Cefotaxima >32 Resistente Cefotetan <=16 Sensível Ceftazidima 4 Sensível Ceftriaxona >32 Resistente Cefuroxima >16 Resistente Ciprofloxacina >2 Resistente Gentamicina >8 Resistente Imipenem <=4 Sensível Levofloxacina >4 Resistente Pip/Tazo >64 Resistente Piperacilina <=8 Sensível Ticar/Clav 64 Intermediário Tobramicina >8 Resistente Trimeth/Sulfa <=2/38 Sensível Laudo Proteus mirabilis ID Paciente: Espécime: Status: Final Hematoma Antimicrobiano CIM Interpretação Amicacin 8 Sensível Amp/Sulbactam >16/8 Resistente Ampicilina >16 Resistente Aztreonam <=8 Sensível Cefazolina >16 Resistente Cefepima >16 Resistente Cefotaxima >32 Resistente Cefotetan <=16 Sensível Ceftazidima <=2 Sensível Ceftriaxona >32 Resistente Cefuroxima >16 Resistente Ciprofloxacina >2 Resistente Gentamicina <=1 Sensível Imipenem <=4 Sensível Levofloxacina >4 Resistente Meropenem <=4 Sensível Moxifloxacina >4 Resistente Pip/Tazo <=8 Sensível Piperacilina >64 Resistente Ticar/Clav 64 Intermediário Tobramicina 8 Intermediário Trimeth/Sulfa >2/38 Resistente Proteus mirabilis 126 Sem título

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11 Conclusões A observação do aumento de isolados produtores de ESBL dentre outras espécies de enterobactérias que não aquelas padronizadas pelo NCCLS (Escherichia coli, Klebsiella spp.) constitui um fator determinante que indica a necessidade de padronização de métodos para a detecção deste mecanismo de resistência. Sendo um mecanismo de resistência mediado por plasmídio, a produção de ESBL pode ser facilmente transmitida de microrganismo a microrganismo dentre as várias espécies de enterobactérias. Por ser um mecanismo de resistência que não é corriqueiramente detectado na rotina de um laboratório clínico, a terapia antimicrobiana aplicada pode ser incorreta, acarretando falha terapêutica. O monitoramento e a vigilância de cepas ESBL-produtoras associados a medidas de controle e a mudanças na prática terapêutica, baseadas em dados epidemiológicos locais, certamente contribuiriam para a contenção deste mecanismo de resistência. Correspondência para: Pedro Fernandez Del Peloso Laboratório Richet - Rio de janeiro - RJ Avenida das Américas LJ: D CEP: Tel: micro@richet.com.br Referências Bibliográficas 1. Aibinu IE, Ohaegbulam VC, Adenipekun EA, et al. Extended-Spectrum b-lactamase Enzymes in Clinical Isolates of Enterobacter Species from Lagos, Nigeria. J.Clin. Microbiol. 2003; 41(5): Bradford PA. Extended Spectrum b-lactamases in the 21st Century: Characterization, Epidemiology, and Detection of This Important Resistance Threat. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14(4): MD Consultoria. Mecanismos de Resistência de Bacilos Gram-Negativos. Centro MD de Treinamento em Microbiologia Clínica: Curso 2; National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing - M100-S13; Janeiro Navon-Venezia S, Hammer-Munz O, Scwartz D t al. Occurence and Phenotypic Characteristics of Extended-Spectrum b-lactamases among Members of the Family Enterobacteriaceae at the Tel-Aviv Medical Center (Israel) and Evaluation of Diagnostic Tests. J. Clin. Microbiol. 2003; 41(1): Quinteros M, Radice M, Gardella N. et al. Extended-Spectrum b-lactamases in Enterobacteriaceae in Buenos Aires, Argentina, Public Hospitals. Antimicrob. Agents Chemother. 2003; 47(9): Spanu T, Luzzaro F, Amicosante G et al. Occurence of Extended-Spectrum b-lactamases in Members of the Family Enterobacteriaceae in Italy: Implications for Resistance to b-lactams and Other Antimicrobial Drugs. Antimicrob. Agents Chemother. 2002; 46(1): Tzelepi E, Giakkoupi P, Sofianou D. et al. Detection of Extended-Spectrum b-lactamases in Clinical Isolates of Enterobacter cloacae and Enterobacter aerogenes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(2): Sem título

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