Como silenciar um gene e como usar RNAi na biologia tumoral

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Natan Frade Ribeiro
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1 Universidade Federal do Rio Grande do Sul Laboratório de Sinalização e Plasticidade Celular Como silenciar um gene e como usar RNAi na biologia tumoral Guido Lenz III Curso de Sinalização Celular no Câncer 29 de Outubro a 01 de Novembro de 2013

2 Nature, 411, 494, 2001.

3 Mudança de paradigma clássico Antisense x sirna no pubmed sirna antisense

4 shrna x sirna sirna

5 Principais estratégias para RNAi + polibrene VSVG GagPol Rev LTR Transcrição Trangene Centrifugar e Filtrar (0,45 m) Célula Alvo shrna 48h Hek293T sirna Seleção Puromicina Clonagem

6 mirna shrna sirna

7 mrna 5 UTR Traduzido 3 UTR AUG UAA 2. sirna (small ou (short) interfering) 3. shrna (short hairpin) 1. Onde posicionar? 2. Qual sequencia pode, e qual não pode? 3. Tem como garantir silenciamento? 4. Tem como garantir a ausência de silenciamento de outros alvos (off-targets)?

8 mrna 5 UTR Traduzido 3 UTR AUG UAA 2. sirna (small ou (short) interfering) 3. shrna (short hairpin) 1. Como começar? Usando um serviço de desenho de sirnas ou uma biblioteca de shrnas

9 Nem todas as sequências de 21nts funcionam iguais Nature Genetics, 33, 396, O que fazer quando não funciona?

10 mrna 5 UTR Traduzido 3 UTR AUG UAA 2. sirna (small ou (short) interfering) 3. shrna (short hairpin) Onde posicionar? mirna based Não nos primeiros 100nt AUG UAA Não nos últimos 100nt 5 UTR Traduzido 3 UTR

11 Uma base não pareada pode ser o suficiente para não silenciar Cancer Cell, 2, 243, Alta especificidade (será)?

12 Importância do pareamento (B) Endogenous SOD1 mrna levels were determined by quantitative RT-PCR for each sirna transfection. Shown is the mean standard deviation of three replicate determinations for each sirna. Endogenous wild-type SOD1 mrna is mismatched to the sirnas used; taller bars imply greater discrimination against the mismatched target RNA. 1 Seed Sequence 21 Sense 5 -CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3 passanger strand Anti-sense 3 -GTTGTTCTACTTCTCGTGGTT-5 guide-strand 21 1

13 Minha experiência com alvos não conservados Biblioteca contra genes de humanos e camundongos Mas eu precisava silenciar um gene em ratos

14 CD nt Seed

15 Luis F. Campesato, Patricia L. C. Lopez, Guido Lenz, Ana Battastini CD73 ecto-5 Nucleotidase Degrada AMP a adenosina 10-3

16 OFF-TARGET Nature Biotech., 21, 635, 2003.

17 Mas não dá pra fazer bioinfo para prever os tais dos off-targets? Alvos Reais Alvos Preditos (Smith-Waterman) 79,84,89% identity cutoff

18 My off-target story

19 My off-target story SHC002 Sigma MISSION Non-Target shrna Control Vector The MISSION Non-Target shrna Control Vector is a lentivirus plasmid vector. The vector contains an shrna insert that does not target human and mouse genes, making it useful as a negative control in experiments using the MISSION shrna library clones. The short-hairpin sequence contains 4 base pair mismatches to any known human or mouse gene. This allows one to examine the effect of transfection of a short-hairpin on gene expression and interpret the knockdown effect seen with shrna clones. Ampicillin and puromycin antibiotic resistance genes provide selection in bacterial or mammalian cells respectively. In addition, self-inactivating replication incompetent viral particles can be produced in packaging cells (HEK293T) by co-transfection with compatible packaging plasmids. The Non-Target shrna Control Vector is provided as 10 μg of plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer at a concentration of 500 ng/μl. CCGG CAACAAGATGAAGAGCACCAA CTCGAG TTGGTGCTCTTCATCTTGTTG TTTTTG

21 nmol Pi/min/mg O non-target foi desenhado para humano e camundongo e em ratos? Atividade da ecto-5 - NT/CD73 após silenciamento por shrna em linhagem de glioma C6 de rato. Não afetou a atividade em camundongos e humanos a a b a 0 C6 controle C6/Ci C6/C4 C6/C6 Controle non-target 6 missmatches seq sem missmatch

22 Alinhamento da sequência toda Alinhamento só da dos NTs 2-11 (do anti-sense) Importância do pareamento 1 Seed Sequence 21 Sense 5 -CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3 Anti-sense 3 -GTTGTTCTACTTCTCGTGGTT

23 O que fazer em relação aos Offtargets? Usar a dose mínima necessária para silenciar o alvo Usar pelo menos duas sequências Experimentos de recuperação (rescue)

25 O que fazer em relação aos Offtargets? Usar a dose mínima necessária para silenciar o alvo Usar pelo menos duas sequências Experimentos de recuperação (rescue)

26 Experimentos de recuperação (rescue) Expressar o gene silenciado recombinante e ver se recupera o fenótipo Mas como fazer para o RNAi não silenciar também o recombinante (de preferência com um tag (Flag, HA) para ter certeza que o recombinante não está sendo silenciado) 5 UTR Traduzido 3 UTR AUG x x UAA 1. Se a região alvo for no UTR - Transfectar a célula com um plasmideo contendo o gene, sem o 3 UTR 2. Se a região alvo for na região traduzida - Transfectar a célula com um plasmideo contendo o gene um uma (ou mais) mutações silenciosas no alvo

27 Efeitos adversos independentes da sequência 36 out of 49 shrna sequences delivered by AAV8 produces liver injury, with 23 ultimately causing death Not restricted to a particular shrna or target But dependent on size 19mers are not toxic (and silence), 23mers or bigger are toxic (and don t silence as well)

28 Morbidity was associates with the downreagulation of liver-derived mirnas Probably due to exportin 5 saturation Optimization of dose and sequence Does not happen with sirnas, since they enter the pathway after exportin 5

29 sirna silenciou os alvos de forma dose dependente

30 dsrnas maiores do que 21nt são agonistas de Tlr3 e tem efeito anti-angiogênico Tlr3 Toll-like receptor 3 Long double-stranded viral RNA sensor TLR7 e 8 can also respond to duplex sirna and its corresponding single strands

31 Cinética Transfecção Transdução viral

32 Para o que usar Curar câncer? Se é possível silenciar qualquer gene Inclusive oncogenes de forma específica Então é só silenciar os oncogenes daquele tipo tumoral, correto? E se silenciar dois ou três ao mesmo tempo, não terá resistência, correto também?

33 Só que não!

35 Eficiência de transfeção Digamos que a eficiência seja aumentada para 99% Ou, sejamos otimistas, 99,9% (só 1 entre 1000 células não receberia o RNAi)

36 Terapia atual 1 a 30 mil células de 10 bilhões de células no tumor original Ou seja, 0, a 0,003% Se a eficiência for de 99,9%, 1 milhão de células não serão afetadas pelo RNAi

38 Resumindo Por mais que RNAi (no papel) pareça perfeito para curar câncer, não parece que vai (sozinho) Talvez junto com quimio (se ele conseguir matar aquela uma célula resistente ) Ou então, células produtoras de virus com shrna (mas, e a resposta imune)

39 Mas não tem outras utilidades em biologia tumoral? Triagens (screenings) Silenciamentos individuais para validar alvos

44 Muito-obrigado Muito-obrigado

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