Utilização de plasmídeos vegetais derivados de vírus no melhoramento genético e proteção de cultivos

Transcrição

1 Utilização de plasmídeos vegetais derivados de vírus no melhoramento genético e proteção de cultivos Prof. Dr. Felipe dos Santos Maraschin Laboratório de Fisiologia Vegetal Instituto Biociências UFRGS Porto Alegre, RS

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3 Plasmídeos vegetais Sistema de expressão transiente de amplo espectro Simples administração Não transgênico Sem necessidade de cultura in vitro ou agentes de seleção Superexpressão constitutiva ou induzível, estável e duradoura Não herdável e não transmissível

4 TYLCV Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Geminivirus (ssdna circular) Patógeno de diversas culturas pelo mundo Transmitido por Bemisia tabaci whitefly

5 Ciclo de um Geminivirus

6 TYLCV Genoma circular ssdna 6 ORFs Região intergênica (IR) contém elementos para replicação pelo hospedeiro e funciona como um promotor bidirecional Proteínas do hospedeiro geram novas cópias dsdna A proteína C1 é essencial para a produção de novos genomas ssdna por replicação rolling circle A proteína V1 codifica o capsídeo (CP) e é essencial para transmissibilidade As proteínas V2, C2, C3 e C4 estão envolvidas na mobilidade viral, aparição de sintomas e na severidade da doença Em suma, cinco ORFs não estão envolvidas na replicação e expressão do vírus

7 Modificação do vírus As proteínas do capsídeo viral V1, V2 estão envolvidas no movimento do vírus dentro da planta TYLCV inoculados mecanicamente não causam infecção Um isolado israelense (GenBank X15656) é capaz de causar infecção com inoculação mecânica Remoção de 20 aa (60nt) N-terminais da proteína V1 (CP) tornou o vírus incapaz de gerar sintomas. Entretanto esta versão que é capaz de multiplicar-se e espalhar-se nos tecidos vegetais foi denominada IL-60 TYLCV é funcional somente com pequenos insertos

8 O sistema de expressão Uma célula expressando V1,V2 replica autonomamente dsdna contendo a IR. Um plasmídeo contendo IR é capaz de se auto-propagar em células vegetais como um plasmídeo ssdna não é produzido e capsídeos virais não podem ser produzidos O vetor pode ser propagado em E coli O gene de interesse é colocado em um plasmídeo satélite que possui a região IR como promotor (p-ir). A administração plasmídeo helper p1470 ativa a propagação do plasmídeo satélite Satélite (expressão) helper

9 Ciclo do plasmídeo vegetal X X X X Outras células

10 Expressão de genes exógenos Inicialmente a expressão é limitada ao floema, e após alguns dias passa a espalhar-se para outros tecidos. DNA

11 Silenciamento gênico Expressão de dsrna formando hairpin para silenciamento do gênico.

12 Expressão do operon prnabcd de Pseudomonas fluorescens em tomate. Formação de um único mrna policistrônico e acúmulos do composto funcional pyrrolnitrina. O acúmulo de pyrrolnitrina confere resistência à infecção por R. solani.

13 Vantagens do sistema Facilidade: miniprep de 2 plasmídeos administrados mecanicamente na planta hospedeira. Somente uma clonagem é necessária Altos níveis de expressão: comparáveis a CaMV::35S Universalidade de hospedeiros Estratégia não transgênica e com reduzidos riscos de biossegurança. USDA Non GMO!!! Limitação de fluxo gênico Aplicação em espécies de difícil transformação Expressão de operons sem a necessidade de transformação plastidial, rotas metabólicas co-expressas

14 Resultados preliminares - UFRGS Tabaco Arroz Eucalipto Macieira Videira

15 Projetos em colaboração Embrapa Uva e Vinho, Bento Gonçalves, RS Resistência à sarna da maçã (Apple scab) MSc.Roberta Cusin

16 Sarna da maçã Causada pelo ascomiceto Venturia inaequalis Predominante em clima úmido temperado Causa perdas de até 100% nos pomares Quatro aplicações de fungicidas mais tratos culturais perfazem 20% do custo de produção Fuji, Gala e Golden delicious são muito sucetíveis.

17 Variedades resistentes à sarna Vários acessos de germoplasma de Malus são resistentes à sarna A resistência já foi mapeada e um gene, Vf2 oriundo de Malus floribunda, foi demonstrado como o responsável pelo fenótipo resistente A introgressão genética nas variedades cultivadas pode levar décadas (até 20 anos)

18 Mecanismo de resistência Interação gene-a-gene Proteínas R reconhecem efetores do patógeno (Avr genes) Reconhecimento por uma proteína LRR identificada como Vf2

19 Viabilizar a introgressão imediata do gene de resistência nas variedades suscetíveis Fuji e Gala Clonagem do gene Vf2 de Malus floribunda Tratamento plantas Fuji e Gala com o gene de resistência Genotipagem Análise da expressão Testes de patogenicidade

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21 Resultados Amostragens Abril e 30 dias detecção DNA plamidial 240 dias análise expressão gênica

22 Expressão do gene de resistência nas plantas tratadas

23 Macierias Gala e Fuji resistentes à sarna

24 Modulação da expressão de gênica para obtenção de uvas apirênicas Jaiana Malabarba Doutoranda PPGBCM-UFRGS Orientação Giancarlo Pasquali e Luis Fernando Revers

25 Fator de transcrição MADS Presente em um QTL para apirenia em videira MADS Box, gene candidato

26 Modulação da expressão gênica Superexpressão: Variedades apirênicas Silenciamento:Variedades com sementes

27 Resultados A superexpressão restaurou parcialmente a formação de sementes em variedades apirênicas fold increase!

28 Resultados O silenciamento por RNAi suprimiu a produção de sementes em variedades com sementes

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30 Agradecimentos Roberta Cusin Jonata Ribeiro Jaiana Malabarba Vitor Falavigna Luis Fernando Revers, Embrapa Sílvio André Meirelles Alves, Embrapa Diogo Porto, Embrapa Márcia Margis, UFRGS Rogério Margis, UFRGS

31 MUITO OBRIGADO! Felipe dos Santos Maraschin