Bacillus amyloliquefaciens COMO POTENCIAL BIOCONSERVANTE DE ALIMENTOS: DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE PROTEÍNAS E AMINOGRAMA*

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1 Alim. Nutr., Araraquara v. 16, n. 1, p , jan./mar ISSN Bacillus amyloliquefaciens COMO POTENCIAL BIOCONSERVANTE DE ALIMENTOS: DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE PROTEÍNAS E AMINOGRAMA* Denys SCHULZ * Maria Risoleta Freire MARQUES******* Isabel Cristina MÜLLER**** Cleide Rosana Vieira BATISTA** RESUMO: Avaliou-se o perfil de proteínas em gel de poliacrilamida e o aminograma do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens. O extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens foi obtido por precipitação, centrifugação, diálise e esterilização por filtração. Como microrganismo indicador foi utilizado Listeria monocytogenes NCTC a 10 5 UFC/mL. Na determinação da composição global de aminoácidos em eletroforese SDS (10%)/PAGE (7,5 a 20%) foram constatadas seis bandas com pesos moleculares aparentes de: 14,8; 20; 29; 30; 34 e 56,2 kda e composto principalmente de aminoácidos hidrofóbicos (não polares), incluindo a prolina (446,77 ppm), leucina (11,03 ppm), valina (6,27 ppm), isoleucina (4,59 ppm), alanina (2,91 ppm) e glicina (1,87 ppm). Os resultados obtidos sugerem que o extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens é composto principalmente de proteases e outras enzimas bacteriolíticas. PALAVRAS-CHAVE: Bacillus amyloliquefaciens; antimicrobianos; proteases. Introdução A contaminação de alimentos é um problema sério que resulta em grandes índices de morbidade. Já existem muitas tecnologias de conservação disponíveis, mas nenhuma delas assegura completamente a qualidade microbiológica dos alimentos. Com isso, fica evidente a necessidade de se desenvolver um número cada vez maior de alternativas de conservação para que, aliadas às tecnologias já existentes, seja possível disponibilizar para a população alimentos de qualidade, cada vez melhor e mais seguros, do ponto de vista microbiológico e toxicológico. 10 O uso de bioconservadores em alimentos tem sido amplamente difundido e, desde os anos 50 é relatada a habilidade de vários grupos de microrganismos, inclusive Bacillus, produzir substâncias com atividade antimicrobiana, como: subtilisinas, proteases, enzimas 5, 9, 18 bacteriolíticas, bacteriocinas, dentre outras. Os bioconservadores podem significar segurança para o consumidor, economia e uma alternativa na conservação de alimentos para as indústrias. 15 Batista 1 verificou que o Bacillus amyloliquefaciens produz uma substância capaz de inibir o desenvolvimento de Listeria monocytogenes. De acordo com os resultados obtidos, a inibição não parece ser devida à produção de ácidos ou peróxido de hidrogênio, tampouco à exaustão de nutrientes. Em continuidade a esses estudos, o presente trabalho teve como objetivo determinar o perfil protéico do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens, bem como realizar a análise de aminoácidos do mesmo, com intuito de utilizá-lo como um conservador natural de alimentos. Material e métodos Dosagem de proteínas do extrato bruto O extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens foi obtido por precipitação, centrifugação, diálise e esterilização por filtração. 20 A padronização da atividade antimicrobiana do extrato bruto de Bacillus amyliquefaciens foi realizada pela determinação da concentração de proteínas utilizando o Kit de Ensaio para Dosagem de Proteínas Totais (Analisa Diagnóstica - Método de Biureto) por comparação com padrão de albumina de soro bovino (BSA). A leitura foi feita em espectrofotômetro (Micronal B382) a 545 nm. A dosagem de proteínas realizada no pool dos extratos brutos foi utilizada como parâmetro tanto para determinar o perfil de proteínas quanto para análise de aminoácidos do mesmo. Para o estudo, o pool dos extratos brutos foi concentrado por liofilização (Liofilizador Edwards do Brasil). *Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, em 2003, no Curso de Mestrado em Ciência dos Alimentos, Centro de Ciências Agrárias - UFSC - Florianópolis - SC - Brasil. Trabalho elaborado com auxílio financeiro da CAPES, sob a forma de Bolsa de Mestrado e dos departamentos CAL e BQA da UFSC. **Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos - Centro de Ciências Agrárias - UFSC Florianópolis - SC - Brasil. ***Departamento de Bioquímica - Centro de Ciências Biológicas - UFSC Florianópolis - SC - Brasil. ****Departamento de Microbiologia e Parasitologia - Centro de Ciências Biológicas - UFSC Florianópolis - SC - Brasil.

2 66 1, 20 Atividade antimicrobiana do extrato bruto A atividade antimicrobiana do extrato bruto foi realizada a cada extração antes da obtenção do pool dos extratos brutos, após obtenção do pool, bem como para investigar a atividade antimicrobiana das bandas obtidas no perfil eletroforético, do seu triturado e do seu sobrenadante após centrifugação. Para o estudo, Listeria monocytogenes NCTC foi ativada em caldo Triptona de Soja (Oxoid) suplementado com 0,6% de Extrato de Levedura (Difco) - TSB-YE a 35 o C por 24 h. Para detecção da atividade inibitória do extrato bruto obtido foram preparadas placas contendo ágar Triptona de Soja (Oxoid) suplementado com 0,6% de Extrato de Levedura (Difco) - TSA-YE que, após solidificado, foi semeado na superfície, com 0,1 ml de Listeria monocytogenes NCTC na concentração de 10 5 UFC/mL. Volumes de 10 L do extrato bruto foram aplicados na superfície de placas de TSA-YE. As placas foram deixadas em temperatura ambiente por 30 min para difusão do extrato bruto no ágar e depois incubadas a 35 o C por 24 h. Após a incubação foi realizada a leitura qualitativa para observação dos halos de inibição. Determinação do perfil de proteínas do extrato bruto O perfil das proteínas presentes no extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens foi determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) gradiente (7,5 a 20%), sob condições desnaturantes, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-10%), de acordo com o método de Laemmli 13. Os pesos moleculares aparentes das bandas foram calculados pelo método descrito por Hames & Rickwood 7. A eletroforese foi realizada com o sistema Mini Protean II (Bio Rad Laboratories, Richmond, CA), sendo o gel corado com Comassie Blue (0,05%). Os pesos moleculares aparentes das proteínas presentes na amostra foram comparados com os seguintes padrões de peso molecular: LW C3187 (14,2-45 kda, Sigma), Rainbow RPN800 ( kda, Amershan Pharmacia) e lisozima (14,3 kda, L-4631, Sigma). Amostras de nisina comercial (3,35 kda, Nisaplin - Grupo BV - 2,5 mg de nisina/100 mg de proteínas totais) e de protease de Streptomyces griseus (aproximadamente 20 kda, P6911 Sigma) também foram aplicadas no gel. Após coloração, cada banda foi dividida em duas partes para o ensaio da triagem da atividade antimicrobiana. Uma metade foi submetida ao teste de triagem da atividade antimicrobiana na superfície de placa de TSA-YE previamente inoculada com 0,1 ml de uma cultura de Listeria monocytogenes NCTC a 10 5 UFC/mL, conforme descrito anteriormente para o extrato bruto. A outra metade foi triturada em tampão fosfato 0,2 M ph 7,2, e submetido à triagem da atividade antimicrobiana. Como metodologia alternativa, o triturado contendo o tampão foi centrifugado a 700 giros por 15 min, sendo o sobrenadante submetido à triagem da atividade antimicrobiana. Após incubação, as placas foram examinadas quanto à presença de halos de inibição. 2 Análise de aminoácidos A análise de aminoácidos foi realizada com o objetivo de determinar a composição de aminoácidos totais (livres+protéicos) do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens. O extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens foi submetido à hidrólise ácida (HCl 6 N, 110 o C, 22 h) e posteriormente derivatizado com fenilisotiocianato de acordo com a metodologia descrita por Bidlingmeyer et al. 3, usando um pool de aminoácidos padrão e amônia como padrões. Os aminoácidos foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) num sistema de CLAE equipado com bomba inteligente (Hitachi, modelo L-6200), detector UV (Jasco, modelo Uvidec-100- VI) e cromatografados em coluna C 18 (Superiodex ODS, 5 m, 4,61 mm x 50 mm) eluída com tampão de acetato de sódio 140 mm ph 5,4 (A) e acetonitrila 60% em água (B). A eluição foi realizada a 40 o C com um gradiente linear de 0 (100% do solvente A) a 50% do solvente B em 25 min a um fluxo de 1,0 ml/min. A absorbância dos aminoácidos derivatizados (derivados-feniltiocianato) foi monitorada a 254 nm. A duplicata foi em amostras paralelas, tratadas independentemente uma da outra, desde o início. Resultados e discussão Atividade antimicrobiana do extrato bruto Todos os extratos brutos isolados e em pool apresentaram atividade antimicrobiana utilizando Listeria monocytogenes NCTC como microrganismo indicador. O pool foi testado freqüentemente para verificação da permanência da atividade e armazenado a 4 o C. Apresentou a mesma atividade antimicrobiana durante todo o período em que foram realizados os ensaios. Essa atividade foi posteriormente padronizada pela dosagem de proteínas. Observou-se ainda que, mesmo após a liofilização o extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens não perdeu a atividade antimicrobiana. Dosagem de proteínas do extrato bruto O pool de extratos brutos, proveniente da mistura de extratos brutos obtidos em água, apresentou 491,23 g de proteínas por ml. O método do Biureto foi utilizado na padronização da atividade antimicrobiana do extrato bruto devido à sua praticidade e sensibilidade. Para a nisina, não foi realizada a dosagem de proteínas, em função de ser a nisina comercial (Nisaplin); composta de rico material protéico. A concentração da nisina utilizada nos ensaios foi baseada nas informações fornecidas pelo fabricante.

3 67 Determinação do perfil de proteínas do extrato bruto Como observado na Figura 1, a eletroforese indica que o extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens apresenta um perfil de proteínas contendo 6 bandas bem definidas com peso molecular aparente de 14,8; 20; 29; 30; 34 e 56,2 kda. A banda com peso molecular aparente de 14,8 kda, sugere a presença de uma protease no extrato bruto, quando comparada ao peso molecular da protease produzida por Streptomyces griseus. Cepas geneticamente modificadas de Bacillus subtilis produziram subtilisina com peso molecular de 28,5 kda. Essa subtilisina (Carlsberg) foi primeiramente isolada nos anos 50 de uma cepa classificada como Bacillus subtilis, e posteriormente reclassificada como Bacillus licheniformis. A banda aparente de 29 kda presente no perfil eletroforético do extrato bruto sugere a presença de subtilisina, uma vez que Bacillus amyloliquefaciens é taxonomicamente muito semelhante ao Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis. A segunda maior protease extracelular de Bacillus subtilis é a protease neutra (30 kda) ou metaloprotease (40 kda). A termolisina produzida por Bacillus thermoproteolyticus possui um peso molecular de 35 kda. A banda aparente de 34 kda presente no perfil eletroforético sugere a presença dessa termolisina no extrato bruto de Bacillus 16, 18 amyloliquefaciens. FIGURA 1 Eletroforese em gel de poliacrilamida gradiente (7,5 a 20%): A) Lisozima (1,5 g/ L), B) Marcador de peso molecular LW C3187, C) Marcador de peso molecular Rainbow RPN800, D) Extrato bruto (149,165 g/ L de proteína), E) Protease de Streptomyces griseus (10 g/ L). Além de proteases extracelulares presentes na cultura de Bacillus subtilis, vários pesquisadores têm verificado a presença de outras serina proteases. Dentre essas, a Bacilopeptidase F (50 kda) que possui forte atividade proteolítica. Protease neutra, subtilisina e Bacillopeptidase F foram às únicas proteases extracelulares originalmente detectadas em culturas de Bacillus subtilis. Uma das menores proteases isoladas de cepas de Bacillus subtilis modificados foi a metaloprotease Mpr com peso molecular de 28 kda. Tanto o mercaptoetanol, como o EDTA inibem aproximadamente 50% de sua atividade e os dois inibidores juntos inativam a enzima. Duas das menores proteases extracelulares de Bacillus subtilis (Epr e NprB) foram primeiramente descobertas por clonagem dos seus respectivos genes em plasmídios. O gene epr codifica uma pré-proproteína que dá origem a uma proteína com peso molecular de 58 kda. Duas proteases intracelulares têm sido isoladas da esporulação ou fase estacionária de células de Bacillus subtilis. A primeira caracterizada foi a intracelular serina protease (ISP) com peso molecular de 31 kda. Estudos recentes têm indicado que essa enzima é sujeita à proteólise durante a purificação e que possui in vivo um peso molecular de 34 kda. A banda aparente de 34 kda presente no perfil eletroforético sugere a presença dessa enzima no extrato 16, 18 bruto de Bacillus amyloliquefaciens. Segundo Sampathkumar et al. 19 todas as cepas patogênicas de Listeria produzem zona de -hemólise em ágar sangue, sendo a Listeriolisina O (peso molecular de 58 kda) uma hemolisina, solúvel em água, produzida por Listeria monocytogenes. A Listeriolisina O pertence a família das citolisinas tiol ativas que é formada de polipeptídeos com pesos moleculares de 47 a 60 kda e são líticas para células eucarióticas pela formação de poros na membrana celular. Muitas citolisinas possuem também efeito antimicrobiano. 4 Analisando o perfil de proteínas presentes no extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens foi observado uma banda com peso molecular aparente de 56,2 kda, sugerindo a presença dessa substância nesse extrato, uma vez que esse também apresentou, em testes preliminares (dados não apresentados) uma forte atividade hemolítica em tubos e em placas de ágar sangue. Além desses indicativos, os gêneros Bacillus e Listeria são considerados taxonomicamente próximos. 6 Segundo Jack et al. 9, as bacteriocinas termolábeis de alto peso molecular (classe III de Klaenhammer - >30 kda) incluem muitas enzimas extra-celulares bacteriolíticas (hemolisinas e muramidases) que podem mimetizar as atividades fisiológicas das bacteriocinas, havendo a possibilidade de que a substância antimicrobiana produzida por Bacillus amyloliquefaciens seja uma bacteriocina. Não foi possível visualizar a atividade antimicrobiana das bandas, do seu triturado ou do seu sobrenadante após centrifugação (Figura 2). A perda da capacidade inibitória pode ser devida a modificações na estrutura da molécula causada pelo tratamento a que foi submetido o extrato bruto antes, ou até mesmo durante a eletroforese, uma vez que a mesma foi realizada em condições desnaturantes, ou simplesmente pela separação de proteínas que apresentam atividade antimicrobiana de modo sinérgico. 4, 23 Foi realizada uma eletroforese preparativa, aplicando-se várias concentrações do extrato bruto, numa faixa de 298,33 g/ L a 447,50 g/ L com o objetivo de verificar se a falta de atividade antimicrobiana era decorrente da baixa concentração protéica aplicada no gel. Foram realizadas eletroforeses em gel de

4 68 poliacrilamida gradiente (7,5 a 20%), sob condições desnaturantes, na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-10%) com a nisina comercial (Nisaplin), sendo aplicados 14,5 g/ L de nisina por poço. Os resultados comprovaram que o Nisaplin contém além da nisina outras proteínas, apresentando no perfil eletroforético várias bandas com pesos moleculares aparentes entre 14,3 kda e 58 kda. Todas as bandas foram testadas quanto à atividade antimicrobiana, porém nenhuma delas demonstrou tal atividade. atividade antimicrobiana em géis depois da eletroforese (sobre Listeria innocua como microrganismo indicador). O peso molecular aparente de tal substância foi correspondente as bandas entre 3 e 4 kda; porém, a coloração com Comassie não revelou uma banda específica correspondente ao agente ativo. Esse problema também foi verificado para outras bacteriocinas por razões desconhecidas. 22 Todas essas citações são exemplos de como essas substâncias antimicrobianas chamadas bacteriocinas são heterogêneas não só em relação aos seus pesos moleculares, mas também quanto a suas propriedades diante da separação por eletroforese, normalmente utilizada para determinar essas características. A estabilidade das bacteriocinas diminui à medida que aumenta sua purificação, porque as bacteriocinas são um grupo heterogêneo de substâncias e geralmente são necessários protocolos específicos de 11, 21 purificação para cada bacteriocina. Eletroforeses em condições não desnaturantes, com tricina e coradas por outros métodos, com sais de prata, por exemplo, serão necessárias para melhor caracterizar esse extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens, ou seja, identificar a banda ativa para posterior seqüenciamento. Análise de aminoácidos FIGURA 2 - Teste da atividade antimicrobiana de cada banda obtida do perfil eletroforético do extrato bruto, seu triturado e o sobrenadante em placa de TSA-YE incubada a 35 o C por 24 h utilizando Listeria monocytogenes como microrganismo indicador. No trabalho de Kalmokoff & Teather 12, o tratamento da bacteriocina com -mercaptoetanol e sua fervura não afetaram a atividade inibitória, sugerindo que as pontes dissulfeto quebradas não são necessárias para sua atividade inibitória. Zheng & Slavik 24 utilizando a mesma técnica apresentada nesse estudo para tratamento prévio, fixação e enxágüe, obtiveram uma zona de inibição em placa na banda correspondente a 3,4 kda. Estava assim determinado o peso molecular do agente antimicrobiano que pesquisavam, uma vez que foram quatro as bandas separadas pela eletroforese, mas apenas uma apresentou atividade. Oscáriz et al. 17, ao realizarem o teste de atividade de uma substância antimicrobiana produzida por Bacillus cereus, após eletroforese também conseguiram observar zonas de inibição de crescimento de vários microrganismos. De modo alternativo Zamfir et al. 23, ao realizarem o mesmo procedimento, observaram formação de uma zona de inibição correspondente a um peso molecular inferior a 6,5 kda, porém essa banda foi visualizada somente por coloração com sais de prata (sensibilidade de 0,1 a 1,0 ng de proteína); sendo que o Coomassie Brilliant Blue (sensibilidade de 0,1 g de proteína) não foi capaz de revelála nitidamente. Hyronimus et al. 8 também detectaram Conforme mostrado na Figura 3, o extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens é composto principalmente de uma grande quantidade de aminoácidos hidrofóbicos (não polares), incluindo a prolina (446,77 partes por milhão - ppm), leucina (11,03 ppm), valina (6,27 ppm), isoleucina (4,59 ppm), alanina (2,91 ppm) e glicina (1,87 ppm). Foi detectado também a presença de aminoácidos polares sem carga, como a serina (6,33 ppm) e treonina (3,30 ppm). Os aminoácidos polares com carga negativa (ácidos) detectados foram o ácido aspártico/aspartato (10,79 ppm) e ácido glutâmico/glutamato (26,15 ppm). O único aminoácido polar com carga positiva (básico) detectado foi a lisina (6,58 ppm). Os outros aminoácidos pesquisados no extrato bruto como metionina, fenilalanina, cistina, tirosina, arginina e histidina não foram detectados. A quantidade de aminoácidos totais presente no extrato bruto foi de 526,59 ppm. A amônia não foi detectada no extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens o que comprova que o sulfato de amônio utilizado no processo de extração foi totalmente removido pelo processo de diálise, ou seja, o processo de diálise utilizado foi eficaz para sua remoção. A maioria dos peptídeos de Bacillus contém altas concentrações de prolina e glicina, o que confere dobras no final do centro hidrofóbico na posição 5 a 7 do C- terminal (+1 refere ao aminoácido N-terminal da proteína madura), sendo suas cadeias peptídicas estabilizadas por pontes de hidrogênio. O grupo amino secundário (imino) da prolina é mantido numa conformação rígida que reduz a flexibilidade estrutural nesse ponto da cadeia polipeptídica. As altas concentrações de prolina e a presença de glicina

5 69 detectada no extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens são um indicativo que as cadeias dos peptídeos que o constituem apresentam conformação em folha. Porém, estudos mais refinados de purificação do extrato bruto, bem como o estudo de difração por raio-x de cristais desses peptídeos isolados e seqüenciados serão necessários para a obtenção de dados mais conclusivos a respeito da estrutura conformacional desses peptídeos, bem como para explicar 14, 18 a relação entre estrutura e função. Nota: A fim de facilitar a visualização de todos os aminoácidos no mesmo gráfico, foi considerado o valor 43 para a prolina, representando este a quantidade de 446,77 ppm de prolina. FIGURA 3 Aminograma do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens. Segundo Zamfir et al. 23 peptídeos fortemente hidrofóbicos são pertencentes às bacteriocinas da classe II (peptídeos não lantibióticos), que são subdivididas nos subgrupos IIa (bacteriocinas com forte atividade contra Listeria) e IIb (bacteriocinas cuja atividade dependem de dois peptídeos). Conclusão O ensaio para caracterização do extrato bruto mostrou seis bandas com pesos moleculares aparentes de 14,8; 20; 29; 30; 34 e 56,2 kda.; o que indica a presença de diferentes peptídeos compostos principalmente de aminoácidos hidrofóbicos não polares, incluindo a prolina (446,77 ppm), leucina (11,03 ppm), valina (6,27 ppm), isoleucina (4,59 ppm), alanina (2,91 ppm) e glicina (1,87 ppm). O extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens apresenta natureza protéica sendo provavelmente composto de algumas proteases e outras enzimas bacteriolíticas. Ensaios utilizando diferentes metodologias de cromatografia, eletroforese e seqüenciamento serão necessárias para verificar se a(s) substância(s) antimicrobiana(s) presente(s) no extrato bruto já existe(m) ou não. SCHULZ, D.; MARQUES, M.R.F.; MÜLLER, I.C.; BATISTA, C.R.V. Bacillus amyloliquefaciens as potential biopreservative of food: determination of the profile of proteins and aminogram. Alim. Nutr., Araraquara, v. 16, n. 1, p , jan./mar ABSTRACT: The protein profile in poliacrilamide gel and the aminogram of the crude extract from Bacillus amyloliquefaciens was avalued. The crude extract was obtained from a culture of Bacillus amyloliquefaciens by precipitation, centrifugation, dyalisis and sterilization through filtration. Listeria monocytogenes at 10 5 CFU/ ml was utilized as microorganism indicator. Six bands were identified by SDS (10%)/PAGE (7,5 to 20%) with aparent molecular weigh of 14,8, 20, 29, 30, 34 and 56,2 kda, composed mainly of hydrophobic aminoacids (non polars), including proline (446,77 ppm), leucine (11,03 ppm), valine (6,27 ppm), isoleucine (4,59 ppm), alanine (2,91 ppm) and glicine (1,87 ppm). The results suggest that the crude extract from Bacillus amyloliquefaciens is mainly composed of proteases and other bacteriolytic enzymes. KEYWORDS: Bacillus amyloliquefaciens; antimicrobials; proteases. Referências bibliográficas 1. BATISTA, C. R. V. Studies on the cultural properties of smooth and rough forms of Listeria monocytogenes and on anthagonistic interaction with Bacillus amyloliquefaciens f. Tese (Doutorado) - University of Strathclyde, Glasgow, BHUNIA, A. K.; JOHNSON, M. C.; RAY, B. Direct detection of antimicrobial peptide of Pediococcus acidilactici in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J. Ind. Microbiol., v. 2, p , BIDLINGMEYER, B. A.; COHEN, S. A.; TARVIN, T. L. Rapid analysis of amino acids using pre-column derivatization. J. Chromatogr., v. 336, n. 93, p. 104, BILLINGTON, S. J.; JOST, B. H.; SONGER, J. G. Thiolactivated cytolysins: structure, function and role in pathogenesis. FEMS Microbiol. Lett., v. 182, p , CLEVELAND, J. et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol., v. 71, p. 1-20, FARBER, J. M.; PETEKIN, P. I. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. Microbiol. Rev., v. 55, n. 3, p , HAMES, B. D.; RICKWOOD, D. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach. Washington, D.C.: IRL Press, p. 8. HYRONIMUS, B.; LE MARREC, C.; URDACI, M. C.

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