AÇÃO ANTILISTERIAL DO EXTRATO BRUTO DE Bacillus Amyloliquefaciens EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE PROTEÍNA, ph E SAL

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1 AÇÃO ANTILISTERIAL DO EXTRATO BRUTO DE Bacillus Amyloliquefaciens EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE PROTEÍNA, ph E SAL Murilo Anderson PEREIRA * Leonardo NUERNBERG * Denys SCHULZ * Cleide Rosana Vieira BATISTA * RESUMO: O elevado índice de morbidade em função da contaminação dos alimentos tem aumentado a necessidade de metodologias alternativas para conservação dos mesmos. Nesse sentido, essa pesquisa teve por objetivo: (1) otimizar a ação antilisterial do extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens em diferentes concentrações proteicas, ph e sal; (2) avaliar a ação do extrato bruto otimizado em ostras artificialmente contaminadas com Listeria monocytogenes. A ação do extrato bruto em diferentes concentrações de proteína (0,0; 5,0; 40; 80 µg/ml) sobre o inóculo de 10 6 UFC. ml -1 de Listeria monocytogenes foi verificada em caldo TSB-YE previamente ajustado para ph 4,0 e 8,0 e concentrações de NaCl de 0; 2,5 e 4,5 % p/v. Os ensaios foram realizados à temperatura de 25ºC em estufa DBO. Para determinar a recuperação microbiana, realizaram-se contagens de Listeria monocytogenes a cada 4 h, por até 50 h. Dos tratamentos testados, a combinação de 80 g/ml de proteína do extrato bruto, ph 4,0 e 4,5 % de NaCl mostrou melhor performance quanto a atividade antimicrobiana, chegando a uma redução de até 5 ciclos logarítmicos de Listeria monocytogenes. Quando testada a ação do tratamento conjunto de 80 g/ml de extrato bruto, ph 4,0 e 4,5 % de NaCl sobre carne de ostra, obteve-se uma redução no número de Listeria monocytogenes de aproximadamente 3 ciclos logarítmicos, (3,0x10 6 para 1,5x10 3 UFC. ml -1 ), após 24 h de incubação a 25ºC. Esses resultados indicam a possível utilização do antimicrobiano produzido por Bacillus amyloliquefaciens como conservador de alimentos. PALAVRAS-CHAVE: Antimicrobianos; Listeria monocy- togenes; alimentos; ostras. Introdução Listeria monocytogenes é o agente etiológico de listeriose, doença adquirida, principalmente, pelo consumo de alimentos contaminados, onde a taxa de morbidade pode chegar a 30% em populações suscetíveis, como mulheres grávidas, recém-nascidos e indivíduos imunodeprimidos. O alto risco à saúde humana associado à listeriose levou o United States Departament of Agriculture/Food Safety Inspection Service (USDA/FSIS) a estabelecer critério de tolerância zero para a presença de Listeria monocytogenes em alimentos prontos para o consumo 7. No Brasil, as informações referentes à vigilância epidemiológica dos casos de listeriose, assim como dados relativos ao isolamento de Listeria monocytogenes em alimentos, ainda são escassos. Além disso, a legislação brasileira, de acordo com a Resolução nº 12, de 2 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que fixa padrões microbiológicos para alimentos, não estabelece critérios para Listeria monocytogenes, determinando somente que seja pesquisado o patógeno em queijos 16. Estudo realizado por Hofer et al ( 2000), caracterizou cepas de Listeria spp., isoladas de diferentes fontes de infecção proveniente de diferentes regiões do Brasil, das quais, humanos representaram 7,9 %, animais 7,6 %, alimentos 74,8 % e meio ambiente ( 9, 5%). Das amostras analisadas, Listeria monocytogenes correspondeu a 24,8 % das cepas de Listeria isoladas. Várias pesquisas vêm demonstrando a capacidade de alguns alimentos permitirem multiplicação do patógeno e de servir de veículo primário para a transmissão de listeriose, 8,9,17,21. Estudos de Arumugaswamy et al. 2, mostram uma prevalência de 33 % de contaminação por Listeria monocytogenes em amostras de ostras desidratadas. Os surtos de listeriose envolvendo produtos cárneos impulsionaram diversas pesquisas visando ao controle de Listeria monocytogenes em alimentos. Pesquisadores ligados à ciência e tecnologia de alimentos têm voltado sua atenção, nos últimos anos, ao estudo de bacteriocinas como bioconservadores de alimentos. Batista 3, mostrou que Bacillus amyloliquefaciens produz uma substância capaz de inibir o desenvolvimento de Listeria monocytogenes, cuja caracterização indica ser uma bacteriocina 5,19,20. Considerando-se a patogênicidade de Listeria * Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina-UFSC Florianópolis SC - Brasil.. 239

2 monocytogenes, bem como a facilidade de sobreviver e se multiplicar em ampla faixa de ph, concentração de sal e temperatura, faz-se necessário desenvolver medidas de controle para esse patógeno. Frente a essa realidade, essa pesquisa teve por objetivo: (1) otimizar a ação anti-listerial do extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens em diferentes concentrações proteicas, ph e sal; (2) avaliar a ação do extrato bruto otimizado em ostras artificialmente contaminadas com Listeria monocytogenes. Material e métodos Microrganismos Os microrganismos utilizados neste estudo foram: Listeria monocytogenes NTC e Bacillus amyloliquefaciens isolado por Batista 3. As culturas foram preparadas a partir de colônias isoladas de cada linhagem por repicagem em ágar inclinado de Triptona de Soja (Oxoid)-TSA suplementado com 0,6% de Extrato de Levedura (Difco)-TSA-YE. Depois de incubadas a 35 o C por 24 h, as culturas em ágar inclinado foram armazenadas a aproximadamente 4 o C para serem utilizadas como culturas estoque. As culturas foram examinadas, periodicamente, para verificação de sua pureza através de plaqueamento em ágar, exame das características coloniais, morfologia e coloração de Gram. Obtenção do extrato bruto e detecção da atividade antimicrobiana Para a obtenção do extrato bruto, a cultura estoque de Bacillus amyloliquefaciens foi ativada através de incubação a 35ºC por 24 h, em seis frascos com 10 ml de Caldo Triptona de Soja (Oxoid) suplementado com 0,6 % de extrato de levedura (Difco)-TSB-YE. Em seguida, 60 ml deste caldo foram centrifugados a rpm por 30 minutos. Ao sobrenadante, foram adicionados cristais de sulfato de amônio (Vetec) até 20 % de saturação, para a precipitação de proteínas e procedeu-se uma nova centrifugação a rpm durante 30 min. O precipitado foi ressuspendido em água destilada numa proporção de 1:6 com relação ao volume original do caldo, obtendo assim o extrato bruto (EB). Em seguida, o EB foi dialisado (membrana Spectra/Por PM 3.500) por 24 h contra 1L de água destilada (renovado 3 vezes - após 2, 14, 16 h). O dialisado foi esterilizado por filtração em membrana Milipore de 0,22µm para obtenção do extrato bruto estéril e a atividade antimicrobiana do EB detectada na superfície de placas de TSA-YE conforme metodologia descrita por Schulz 20. Dosagem de proteínas do extrato bruto A determinação da concentração de proteínas no extrato bruto foi realizada através do Kit de Ensaio para Dosagem de Proteínas Totais (Analisa Diagnóstica Método do Biureto) por comparação com padrão de albumina de soro bovino (BSA). A leitura foi feita em espectrofotômetro a 545 nm. Viabilidade de Listeria monocytogenes frente a diferentes concentrações de proteína do extrato bruto, sal e ph Com o intuito de reduzir ao máximo o número de Listeria monocytogenes procurou-se potencializar a ação do EB de Bacillus amyloliquefaciens através da combinação de diferentes concentrações de ph (4,0 e 8,0), sal (0; 2,5 e 4,5 % p/v) e concentração protéica do EB (0,0; 5,0; 40; 80 µg/ml). Preparo e diluição do inoculo Para o preparo do inóculo, a cultura estoque de Listeria monocytogenes foi cultivada em TSA-YE inclinado por 24 h a 35ºC. Após incubação, a massa celular foi removida e ressuspensa em água peptonada 0,1%, e ajustada ao padrão McFarland, para uma concentração de 10 8 UFC. ml -1. A seguir 1 ml desta solução foi diluída em 9 ml de água peptonada 0,1 % e, após homogeneização, uma alíquota de 1 ml foi transferida para tubos de ensaio ao qual foi adicionado TSB-YE até completar 3 ml. Em seguida, realizou-se diluições seriadas e plaqueamento em TSA-YE com incubação a 35ºC por 24 h para determinar o número inicial de microrganismos/ml. Ação do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens frente a Listeria monocytogenes A ação do extrato bruto, com volume final de 1mL, em diferentes concentrações de proteína (0,0; 5,0; 40; 80 ug/ml) sobre o inóculo de 10 6 UFC. ml -1 de Listeria monocytogenes foi verificada em tubo de ensaio contendo um volume final de 3 ml de TSB-YE previamente ajustado para ph 4,0 e 8,0, com soluções de HCl (1 N) e NaOH (1 N), e para concentrações NaCl em 0; 2,5; 4,5 % p/v. Os ensaios foram realizados à temperatura de 25ºC em estufa DBO, por até 50 h. Para verificar a recuperação microbiana, procedeuse à retirada de alíquotas de 0,1 ml da cultura tratada com as diferentes concentrações protéicas do extrato bruto, sal e ph nos tempos de incubação 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 50h. A cada tempo, realizou-se diluição seriada em água peptonada 0,1% e 0,1 ml foi incubado em TSA-YE à 35ºC por 24 h, para determinação do número de microrganismos. Ação do extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens otimizado em ostras contaminadas com Listeria monocytogenes Para avaliar a ação do EB de Bacillus amyloliquefaciens otimizado, inicialmente procedeu-se a 240

3 investigação de Listeria monocytogenes em ostras naturalmente contaminadas; para após realizar a investigação com inoculação de Listeria monocytogenes em ostras. Determinação de Listeria monocytogenes em ostras Crassostrea gigas. Durante os anos de 2002 e 2003, foram analisadas um total de 20 (vinte) amostras de ostras (Crassostrea gigas), da região litorânea de Florianópolis, das quais 10 foram coletadas no local de cultivo e 10 nos pontos de venda. Uma unidade amostral era composta por 12 ostras. Para as análises, 25 g da ostra foram homogeneizadas com 225 ml de Caldo Enriquecido para Listeria (LEB) isento dos agentes seletivos em Bagmixer-(Interscience, França) e incubou-se a 35ºC por 6 h. Posteriormente, foi adicionado 0,9 ml de SR 141 (agente seletivo) e incubouse novamente a 35ºC até completar 24 h. Em seguida, transferiu-se 0,1 ml para 10 ml de Caldo Frazer adicionado de suplemento com SR 156 e incubou-se a 35ºC por 24 h. Culturas mostrando escurecimento no Caldo Frazer foram semeadas em Ágar Seletivo para Listeria (Oxoid)-LSA suplementado com SR 140 e incubadas a 35ºC por 24 h. Colônias suspeitas de Listeria foram transferidas para TSA- YE e submetidas a identificação em API Listeria- BioMerieux 1. Ação do extrato bruto otimizado em ostras artificialmente contaminadas com Listeria monocytogenes A ação do extrato bruto otimizado em ostras artificialmente contaminadas foi realizada utilizando-se 1mL do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens com 80 g de proteína por ml, ph 4,0 e 4,5% de NaCl, (melhor combinação conforme item 5.3.2), foi adicionada a 3g de carne de ostra previamente inoculada com 10 6 UFC. ml -1 de Listeria monocytogenes. Para verificar a recuperação microbiana, procedeuse à retirada de alíquotas de 1g nos tempos de incubação 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h. A cada tempo realizou-se diluição seriada em água peptonada 0,1% e 0,1 ml foi incubado em LSA (Oxoid) suplementado com SR 140 a 35ºC por 24 h, para determinação do número de Listeria monocytogenes viáveis. Análise estatística dos dados Para análise dos resultados do comportamento de Listeria monocytogenes frente a diferentes concentrações de extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens, concentrações de sal e ph, utilizouse modelo de regressão não-linear, onde os dados foram ajustados através da equação Y = a. X b, sendo que, Y = valores das contagens bacterianas em UFC. ml -1 e X = o tempo em horas para cada contagem bacteriana 16. Foi aplicado Teste T de Student para os parâmetros a e b da equação Y = a. X b, com nível de confiabilidade de 95% 22. Resultados e discussão Viabilidade de Listeria monocytogenes frente a diferentes concentrações de proteína do extrato bruto, sal e ph A determinação da viabilidade de Listeria monoytogenes a 25ºC, em meio TSB-YE foi estudada com intuito de estabelecer a melhor combinação de fatores, (concentração protéica do EB, ph, concentração de sal) para reduzir ao máximo o número de Listeria monocytogenes. O melhor resultado desse estudo pode ser observado na Figura 1 que mostra as curvas de sobrevivência de Listeria monocytogenes em ph 4,0, concentrações de sal 4,5 % e concentrações protéicas do EB (0,0; 5,0; 40 e 80 g/ml).. Para os experimentos, a população média inicial de Listeria monocytogenes foi de 3,0x10 6 UFC. ml -1. log UFC/mL 1,E+07 1,E+06 1,E+05 1,E+04 1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E Tempo (horas) ph 4,0 Sal 4,5 Ant 00 ph 4,0 Sal 4,5 Ant 5 ph 4,0 Sal 4,5 Ant 40 ph 4,0 Sal 4,5 Ant 80 FIGURA 1- Sobrevivência de Listeria monocytogenes em TSB-YE a 25ºC, frente a ph 4,0, extrato bruto em diferentes concentrações de proteína (0,0; 5,0; 40; 80 g/ml) e 4,5 % de NaCl. Como pode ser observado na Figura 1, a população média inicial de Listeria monocytogenes foi de 3,0x10 6 UFC. ml -1, em ph 4,0 e ausência de EB, o número de células de Listeria monocytogenes apresenta uma discreta redução com 4,5% de sal no início do tratamento, permanecendo constante ao longo do tempo. A maior redução no número de células de Listeria monocytogenes em ph 4,0 foi observado quando a cultura foi submetida ao tratamento com 4,5% de sal e 80 g/ml de proteína do EB. A sobrevivência de Listeria monocytogenes frente a diferentes phs foi avaliada por Parish & Higgns 15, que cultivaram quatro linhagens desse microrganismo, em caldo TSB suplementado com 0,6% de extrato de levedura, incubados a 30ºC por até 96h. Os meios foram testados em ph com valores entre 3,5 e 7,0 e variação de 0,5. Os resultados observados por Parish & Higgns 15 mostraram que o crescimento para todas as linhagens de Listeria monocytogenes ocorreu em valores de ph iguais ou superiores a 4,5. Não ocorreu crescimento em ph igual ou 241

4 inferior a 4,0, fato esse semelhante aos resultados apresentados no presente trabalho. Estudo conduzido por Farber et al. 10 avaliou os efeitos da adição dos ácidos lático, acético e cítrico na multiplicação de quatro cepas de Listeria monocytogenes em caldo BHI, com valores de ph variando de 4,0 a 6,0. Resultados mostraram que o ácido acético foi o mais eficaz dos acidulantes testados, não sendo observada a multiplicação do patógeno em phs menores que 5,6 a 4ºC ou menores que 5,0 a 30ºC. O valor mínimo de ph exigido para o patógeno iniciar o crescimento a 30ºC variou de 4,3 a 5,2, dependendo do acidulante utilizado. Segundo esse estudo, ph menor que 4,3 limita o crescimento microbiano, estando em conformidade com os resultados do presente trabalho. Com ph ácido, o número de Listeria monocytogenes não aumenta, isso se deve, provavelmente, porque a acidez é um dos fatores primários que afetam a multiplicação microbiana em alimentos. Segundo Doores, citado por Batista 3 a maioria das bactérias, inclusive Listeria monocytogenes, crescem melhor em valores de ph próximos à neutralidade. Quanto à concentração de sal, observou-se que exerceu menor influência na sobrevivência de Listeria monocytogenes. Estudos realizados por Mc Clure et al. 13 para comprovar os efeitos do cloreto de sódio, ph e temperatura, no crescimento de Listeria monocytogenes mostraram que foi necessário uma concentração de 8,8% de NaCl para limitar o crescimento de Listeria monocytogenes entre ph 6,6 e 7,6 a 20ºC e não ocorreu crescimento em valores de ph inferiores a 4,95. A influência do ph, do sal, e da temperatura sobre Listeria monocytogenes também foi estudada por Martinis et al 14. Os resultados mostraram que a 10ºC, a recuperação das células foi influenciada tanto pelo ph quanto pela concentração de NaCl, ocorrendo uma diminuição da formação de colônias proporcional à diminuição do ph e aumento da concentração de NaCl. Esses pesquisadores afirmam que concentrações de 2,0 a 3,5% de NaCl parecem desempenhar um efeito protetor quando aplicados com ph ácido. Os resultados gerais do presente estudo mostraram que a ação do EB contra Listeria monocytogenes foi mais acentuada quando se aplicou o tratamento de 80 g/ml de proteína do extrato bruto, ph 4,0 e 4,5 % de sal (Figura 1). A combinação desses fatores resultou na maior redução do número de Listeria monocytogenes e manutenção do nível baixo do microrganismo durante as 50h, onde foi possível reduzir cinco ciclos logarítmicos do microrganismo, de 3x10 6 UFC. ml -1 para 2,5x10 1 UFC. ml -1. De acordo com os resultados, constata-se que quanto mais ácido é o ph e maior é a concentração de proteína do extrato bruto, maior é a eliminação de Listeria monocytogenes A melhor ação do extrato bruto foi atingida com a concentração protéica de 80 g/ml. Esses resultados concordam com os apresentados por Schulz 20, o qual mostrou que a máxima atividade antimicrobiana do EB foi observada com 80 g de proteína, produzindo um halo de inibição de 0,7 cm de raio em placas de cultivo celular. Determinação de Listeria monocytogenes em amostras de ostras Crassostrea gigas. Nenhuma das 20 amostras analisadas durante o período deste trabalho apresentaram contaminação por Listeria monocytogenes. Masuda et al. apud Embarek 8 também não encontraram contaminação por Listeria spp. nem por L. monocytogenes quando analisaram 84 amostras de ostras e mexilhões. Entretanto, outros pesquisadores têm demonstrado a ocorrência deste microrganismo em frutos do mar. Revisão realizada por Embarek 8, revela uma ocorrência de 52 % de Listeria spp. e 14 % de Listeria monocytogenes em amostras de água usadas para transportar salmão vivo. De 147 amostras de mexilhões analisadas 11,6 % apresentaram contaminação por Listeria spp. e 1,4 % por Listeria monocytogenes. Arumugaswamy et al 2., encontraram uma prevalência de 33 % de contaminação por Listeria monocytogenes em amostras de ostras desidratadas. No Brasil, poucos dados sobre contaminação por Listeria monocytogenes em produtos de origem marinha são encontrados. No entanto, esse microrganismo é freqüentemente pesquisado em produtos lácteos. A legislação brasileira, de acordo com a Resolução nº 12, de 2 de janeiro de 2001, da ANVISA, determina que seja pesquisado o patógeno somente em queijos e derivados 6. Ação do extrato bruto otimizado em ostras artificialmente contaminadas com Listeria monocytogenes A figura 2 mostra o comportamento de Listeria monocytogenes em ph 4,0 concentrações de sal 4,5 % e concentrações protéicas do EB 80 g/ml em carne de ostra artificialmente contaminada por 24h. Quando as amostras de ostras foram submetidas ao tratamento em ph 4,0; 4,5 % de NaCl e ausência de extrato bruto, não ocorreu crescimento de Listeria monocytogenes e a população microbiana final ficou em torno de 5,0x10 5 UFC. ml -1. Obteve-se, assim, uma pequena redução, menor que um ciclo logarítmico, o que provavelmente deve ser devido a ação do ph ácido e a concentração de 4,5% de Log UFC/mL 1,E+07 1,E+06 1,E+05 1,E+04 1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E Tempo (horas) ph 4,0 Sal 4,5 Ant 00 Ajuste a equação ph 4,0 Sal 4,5 Ant 80 FIGURA 2 - Sobrevivência de Listeria monoytogenes em carne de ostra incubada a 25ºC, frente à ação do extrato bruto em 80 g/ml de concentração protéica, ph 4,0 e 4,5 % p/v de NaCl. 242

5 NaCl que inibiram o crescimento microbiano. No entanto, quando foi testada a ação do tratamento conjunto de 80 g/ml de proteína do EB de Bacillus amyloliquefaciens, ph 4,0 e 4,5% de NaCl sobre a carne de ostra, obteve-se uma redução no número de Listeria monocytogenes de aproximadamente 3 ciclos logarítmicos, após 24 h de incubação a 25ºC (Figura 2). A diferença entre os resultados da redução do número de Listeria monocytogenes em caldo TSB-YE que foi de 3,0x10 6 UFC. ml -1 para 2,5x10 1 UFC. ml -1 (Figura 1) e na carne de ostra 3,0x10 6 para 1,5x10 3 UFC. ml -1 (Figura 2), pode ser devido a uma melhor homogeneização do EB no meio líquido do que em meio sólido, e/ou devido às características químicas ou físicas da carne de ostra, pois, a composição química (presença de enzimas exógenas) e as condições físicas são parâmetros críticos para a estabilidade e para a atividade de bacteriocinas em alimentos ou bebidas. Segundo Ganzle et al. (1999), a inibição do crescimento e eliminação de microrganismos por bacteriocinas durante a produção e armazenamento de alimentos, é resultado de interações específicas entre a bacteriocina, a matriz do alimento, e o microrganismo alvo. Saucier & Greer, reportaram que os constituintes da carne e a atividade enzimática endógena podem interferir na atividade antimicrobiana de bacteriocinas usadas em alimentos. Este fato foi demonstrado com a nisina, que não é ativa em sistemas cárneos, porque reage com a glutadiona da carne crua produzindo um complexo inativo e sujeito á degradação proteolítica. aimed to: (1) optimize the antilisterial action of the crude extract produced by Bacillus amyloliquefaciens in different proteic, ph and salt concentrations; (2) evaluate the optimized crude extract action in oysters artificially contaminated with Listeria monocytogenes. The crude extract action in different protein concentrations (0.0; 5.0; 40; 80 µg/ml) over the 10 6 CFU. ml -1 Listeria monocytogenes inocolum was verified in TSB-YE culture media previously adjusted to ph 4.0 and 8.0 and NaCl concentrations to 0; 2.5; 4.5 % p/v, resulting in a complete factorial analyses of 36 microbial behavior curves. The essays were performed at 25ºC temperature in DBO. To determine microbial recuperation, Listeria monocytogenes count was performed every 4 hours, through up to 50 hours. Among all treatments tested, the combination 80 g/ml crude extract, ph 4.0 and NaCl 4.5% showed the best antimicrobial activity performance, reaching a reduction of up to 5 Listeria monocytogenes logarithmic cycles. When the treatment action together of 80 g/ml crude extract, ph 4.0 and NaCl 4.5 % was tested over oyster meat, a reduction of approximately 3 logarithmic cycles in Listeria monocytogenes number (3,0x10 6 to 1,5x10 3 CFU. ml -1 ) was obtained after 24 hours incubation at 25ºC. These results indicate the possible utilization of the antimicrobial produced by Bacillus amyloliquefaciens as food preservative. KEYWORDS: antimicrobials; Listeria monocytogenes; Food; Oyster. Conclusão A ação do EB produzido por Bacillus amyloliquefaciens foi mais acentuada quando se aplicou o tratamento com 80 g/ml de proteína do extrato bruto, ph 4,0 e 4,5 % de NaCl, possibilitando uma redução de Listeria monocytogenes superior a todas as combinações testadas. A ação do extrato bruto otimizado em ostras artificialmente contaminadas com Listeria monocytogenes causou uma redução no número desse microrganismo de aproximadamente 3 ciclos logarítmicos, após 24 h de incubação a 25ºC, indicando a possível utilização do antimicrobiano produzido por Bacillus amyloliquefaciens como conservador de alimentos. PEREIRA, M.A.; NUERNBERG, L.; SCHULZ, D.; BATISTA, C.R.V. Antilisterial action of the crude extract from Bacillus amyloliquefaciens in diferent concentration of protein, ph and salt. Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 3, p , ABSTRACT: The high index of morbidity by food contamination has raised the need of alternative methodologies to preserve them. Therefore, this research Referências bibliográficas 1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Compendium of methods for then microbiological examination of foods. 4 th ed. Waschington: D. C., p. 2. ARUMUGASWAMY, R.K.; ALI, G.R.; ABD HAMID, S.N. Prevalence of Listeria monocytogenes in foods in Malaysia. Int. J. Food Microbiol., v.23, n.1, p , Set BATISTA, C. R. V. Studies on the cultural properties of smooth and rough forms of Listeria monocytogenes end on anthrgonistic interaction with Bacillus amyloliquefaciens f. Thesis. (Doctor of Philosophy) Faculty of Science - University of Strathclyde, Glasgow, BERRY, E. D.; HUTKINS, R. W.; MANDIGO, R. W. The use of bacteriocin-producing Pediococcus acidilactici to control post processing Listeria monocytogenes contamination of frankfuturters. J. Food Prot., V. 54, p , BONELLI, R. R. Extração e caracterização de uma substância antimicrobiana produzida por Bacillus amyloliquefaciens f. Dissertação (Mestrado 243

6 em Ciência dos Alimentos) Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis-SC. 6. BRASIL. ANVISA. Resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de Aprova o regulamento técnico princípios gerais para estabelecimento de critérios e padrões microbiológicos para alimentos e seus anexos I, II e III. Diário Oficial. Brasília, 10 de janeiro de CLEVELAND et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol., v. 71 p. 1-20, EMBAREK P. K. B. Presence, detction and growth of Listeria monocytogenes in seafoods: a review. Int. J. Food Microbiol., v. 23 p , FARBER, J. M. Listeria monocytogenes in fish products. J. Food Prot., v.54, p , FARBER, J. M., et al. The effect of various acidulants on the growth of Listeria monocytogenes. Letters Appl. Microbiol., v. 9, p , GÄNZLE, M. G.; WEBER, S.; HAMMES, W. P. Effect of ecological factors on the inhibitory spectrum and activity of bacteriocins. Int. J. Food Microbiol., v. 46, p , HOFER, E.; RIBEIRO, R.; FEITOSA, D. P. Species and serovares of the genus Listeria isolated from different sources in Brazil from 1971 to Mem. Inst. Osvaldo Cruz, v. 95, p , McCLURE, P. J.; ROBERTS, T. A.; OTTO OGURO, P. Comparison of sodim chloride, ph and temperatura on the growth of Listeria monocytogenes on gradient plates and in liquid medium. Lett. Appl. Microbiol., v.9, n.3, p.95-99, MARTINIS, E.C.P. et al. Influence of ph, salt, and temperatura on nisin resistence in Listeria monocytogenes. J. Food Prot., v.60, n.4 p , PARISH, M. E.; HIGGINS, D.P. Survival of Listeria monocytogenes in low ph model broth systems. J. Food Prot., v.52, n.3, p , PEREIRA, A.R. Ajuste prático de curvas na pesquisa biológica, Campinas: Fundação Cargill,1987, v PORTO, A. C. S. Capacidade de sobrevivência e termorresistência de Listeria monocytogenes em salsichas formuladas, com e sem a adição de lactato de potássio, embaladas a vácuo e armazenadas a - 18 ºC, 4 ºC e 10 ºC f.Tese (doutorado) Universidade Federal de Santa Catarina, SAUCIER, L.; GREER, G. G. Description of a simple detection assay for in situ production of bacteriocin on meat. J. Food Prot., v.64, n.2, p , SCHULZ, D. Isolamento e caracterização da substância antimicrobiana produzida por Bacillus amyloliquefaciens. Florianópolis: Universidade Federal de Santa Catarina p. (Relatório final) 20.. Caracterização parcial do extrato bruto produzido por Bacillus amyloliquefaciens e ensaios preliminares de citotoxicidade f. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Santa Catarina, VIEIRA, M. A. S. Controle de Listeria monocytogenes Scott A em queijo minas frescal através de tratamento termoquímico p.Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, VIEIRA, S. Introdução à bioestatística. 3 ed. rev. amp. Rio de Janeiro: Campus, 1980, 196 p. 244

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