EFEITOS DOS METABÓLITOS EXTRACELULARES DE LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS SOBRE MICRORGANISMOS RESIDENTES DO TRATO GASTROINTESTINAL

Transcrição

1 EFEITOS DOS METABÓLITOS EXTRACELULARES DE LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS SOBRE MICRORGANISMOS RESIDENTES DO TRATO GASTROINTESTINAL Autores: PATRÍCIA ALVES PAIVA, MARIA CECÍLIA AGUIAR SANTOS, RONIZE VIVIANE JORGE DE FARIA, MARILÉIA CHAVES ANDRADE, SÉRGIO AVELINO MOTA NOBRE Introdução O trato gastrointestinal humano (TGI) é colonizado por diversos microrganismos. Com aproximadamente 400 m2, devido aos milhões de microvilosidades e aos oito metros de comprimento, o TGI é a maior superfície exposta à colonização microbiana, superando a pele, que antes acreditava-se ser o maior órgão (MACDONALD; MONTELEONE, 2005). A maioria dos microrganismos habitantes da microbiota intestinal comensal pertence à família Enterobacteriaceae ou aos gêneros Bacteroides, Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium e Enterobacter (BRANDT; SAMPAIO; MUIKI, 2006). Se ocorrer alterações na microbiota, resultantes de supressão e diminuição da microbiota normal, certos microrganismos podem surgir como oportunistas e causar danos ao hospedeiro (GIBSON; ROBERTFROID, 1995). Dessa forma, surgem os probióticos que são microrganismos vivos, que quando administrados em quantidades adequadas conferem benefícios ao hospedeiro. A maioria dos probióticos é utilizada para restabelecer a homeostase do trato gastrointestinal, devido a capacidade de sobreviverem ao percurso da boca ao cólon, tendo resistência a acidez do estômago e da bile (MCFARLAND, 2015). Avaliadas como grande grupo de bactérias probióticas, as bactérias do ácido lático (BAL) são encontradas no intestino humano associadas a efeitos benéficos para a saúde (HEMPEL et al., 2012). As BAL constituem um grupo de bactérias gram positivas que produzem ácido lático a partir da fermentação de carboidratos. Pertencentes ao filo Firmicutes, são encontradas no leite e contribuem na produção e aromatização de alimentos como queijos e iogurtes (SMIT; SMIT; ENGELS, 2005). Apesar de comprovado os efeitos probióticos das bactérias ácido láticas, ainda não se sabe ao certo se esse efeito é causado por alterações induzidas pelo contato bacteriano no trânsito gastrointestinal, ou se produtos derivados do seu metabolismo são suficientes para induzir tais alterações. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de metabólitos extracelulares da bactéria probiótica Lactococcus lactis subespécie lactis sobre microrganismos residentes do trato gastrointestinal. Material e métodos Extração dos metabólitos extracelulares de Lactococcus lactis subsp. lactis Foram incubadas por 24 horas à 37 C quatro placas de petri contendo 50 µl de suspensão bacteriana cada. A massa celular crescida foi transferida para um tubo de ensaio contendo 1 ml de ADE (Água Destilada Estéril). Para total retirada das células presentes no meio ágar M17 foi adicionada à placa 2 ml de ADE, que foi espalhada pela sua superfície. O líquido foi recolhido e depositado no mesmo tubo usado anteriormente. O produto do tubo de ensaio foi centrifugado (SL700 ) por 10 minutos em rpm para separação das fases extracelulares e intracelulares. As células formaram um pellet, que foi conservado no freezer -20 C e o sobrenadante armazenado para ser adicionado ao extrato extracelular. Para ter acesso a todo produto metabólico extracelular, o meio ágar M17 foi fragmentado e lavado com 5 ml de ADE. Na homogeneização do meio foi utilizado um sonicador (OMNI International, Tissue Master125) por cinco minutos, com intervalo de 30 segundos a cada minuto. Logo após, o meio ágar M17 foi filtrado em papel de filtro. O produto da filtração se uniu ao volume de sobrenadante resultante da centrifugação anterior. Os produtos extracelulares foram filtrados em membrana 0,22 µm (KASVI ) e armazenados no freezer -20 C para posterior utilização.

2 Ensaio de estímulo e/ou inibição do crescimento Uma alíquota de cada cultura de trabalho de Escherichia coli, Enterococcus faecalis e Enterobacter sakazakii foi inoculada em meio ágar BHI e Lactococcus lactis subsp. lactis em meio ágar M17 e armazenados em estufa Fanem a 37 C por 24 horas. Foi preparada uma suspensão bacteriana de cada um dos microrganismos, calibrada com padrão 0,5 da escala de McFarland, com concentração de 108 células, logo após essa suspensão foi diluída para 104. Essa diluição foi contada na câmara de Neubauer para verificação do número de UFC que seriam inoculados. O preenchimento da microplaca, composta por 96 poços, foi realizado de acordo com a normativa The Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). Acrescentou-se em cada poço 90µl do extrato metabólico, 10µl de caldo Muller Hinton e o inóculo com o microrganismo desafiado. Nos tratamentos controle a placa foi preenchida com as concentrações: controle positivo, 90µl de ADE e 10µl do inóculo com o microrganismo; no controle negativo, 90µl do extrato metabólico e 10µl de ADE. O teste foi realizado em triplicata, com 27 tratamentos, sendo 12 representados pelos microrganismos e o extrato, 12 somente com os microrganismos, e 3 para avaliar a esterilidade do extrato. Os produtos dos tratamentos foram colocados na placa da seguinte forma: tratamento teste foi colocado nas colunas 1 ao 4 nas linhas A, B e C; controle positivo foi colocada nas colunas 1 ao 4 nas linhas H, F e G e o controle negativo foi colocado na coluna 5 nas linhas H, F e G. A microplaca foi incubada em estufa por 24 horas a 37 C. Após esse tempo foi verificada a absorbância das amostras contidas na placa, em um comprimento de onda de 630 nanômetro, em um espectrofotômetro de microplacas (THERMO PLATE ). Após o período foi retirado 10µl de cada poço e inoculado em placa de petri com o meio ágar Muller Hinton para todas as bactérias, pelo período de 24 horas a 37 C. Após, realizada a contagem direta de UFC. Análise dos dados Foram calculados a média e o desvio padrão. Para cálculo da média somou-se o valor da absorbância do inóculo contendo os microrganismos com o extrato metabólico, posteriormente subtraiu-se o valor da absorbância do inóculo contendo somente o microrganismo. O resultado foi dividido pela absorbância do inóculo com microrganismo sozinho, por último o resultado foi dividido por 100. A partir desses cálculos foi avaliado o índice de inibição ou estímulo, se negativo ocorreu inibição, positivo houve estímulo. Resultados e Discussão Extração dos metabólitos extracelulares de Lactococcus lactis subsp. lactis A centrifugação mostrou-se método adequado para separação dos produtos metabólicos extracelulares e intracelulares, conforme observa-se na figura 1A. Para separar os metabólitos extracelulares dissolvidos no meio ágar M17 foi utilizado o sonicador. Não foi encontrado na literatura dados que mostravam o melhor tempo para abrir os poros do meio ágar M17 e extrair os metabólitos. Portanto, foram realizadas diversas sonicações até se perceber que o tempo de 5 minutos com intervalo de 30 segundos a cada minuto foi o melhor, pois foi possível visualizar o meio ágar M17 totalmente degradado, como pode ser visto na figura 1B. Após a filtração do meio fragmentado e homogeneizado foi coletado o extrato metabólico extracelular que foi adicionado ao sobrenadante da centrifugação realizada anteriormente (FIGURA 1C).

3 Ensaio de estímulo e/ou inibição do crescimento O extrato metabólico extracelular teve ação bactericida contra a cepa de Enterobacter sakazakii, sendo visível uma diminuição na população do microrganismo como pode ser observado no gráfico 1. O extrato metabólico extracelular do Lactococcus lactis teve a capacidade de inibir o crescimento populacional da bactéria. Não se sabe ao certo qual substância presente no extrato possui essa capacidade, porém em estudo realizado por Lee e Jin em 2008, eles demonstraram que a nisina, que é produzida pelo Lactococcus lactis subsp. lactis, quando testada sozinha não tem capacidade de inibir o E. sakazakii, contudo quando administrado junto com algum composto orgânico, como por exemplo diacetil, o efeito dos dois juntos inibe o crescimento da bactéria. Com isso pode-se deduzir que no extrato deve ter algum composto que junto com a nisina tem essa capacidade de diminuir as populações de E. sakazakii. O extrato metabólico extracelular teve capacidade de estimular o crescimento, dos microrganismos Enterococcus faecalis e o próprio Lactococcus lactis, como pode ser observado no gráfico 1. Não foram encontrados dados na literatura que indique que o L. lactis ou algum produto oriundo dos seus metabólicos secundários possua capacidade de promover o crescimento da bactéria E. fecalis. A promoção de crescimento que ocorreu com L. lactis pode ser explicado pelo fato que quando as bactérias consomem todos os nutrientes presentes no meio ágar M17, elas produzem metabólicos que são utilizados para sobrevivência, dessa forma o extrato metabólico serviu como promotor de crescimento do L. lactis. Outro fato que pode explicar este estímulo ocorrido, é o fato do meio de extração possuir capacidade de arrastar substâncias presentes no meio ágar M17, que é um meio específico para o L. lactis. Dessa forma as substâncias estariam estimulando esse crescimento e não o extrato extracelular. O extrato não apresentou estimulação ou inibição do microrganismo Escherichia coli. Conclusão Observou-se que o extrato extracelular de Lactococcus lactis subsp. lactis possui capacidade de estimular o crescimento ao aumentar a população de Lactococcus lactis subsp. lactis e de Enterococcus faecalis. Contudo esse mesmo extrato não estimulou os microrganismos Escherichia coli e Enterobacter sakazakii. Não se pode afirmar que foi o exatamente o extrato extracelular que teve a capacidade de alterar a população dos microrganismos testados, pois ao realizar o processo de extração pode ter ocorrido arraste de substâncias presentes no meio ágar M17 que pode ter contribuído para os resultados obtidos. Referências MACDONALD, T.T.; MONTELEONE, G. Immunity, inflammation and allergy in the gut. Science, v. 307, p , MCFARLAND L. V. From Yaks to Yogurt: The History, Development, and Current Use of Probiotics. Clin Infect Dis. CID 2015:60 (Suppl2) LEE, S. Y.; JIN H. H. Inhibitory activity of natural antimicrobial compounds alone or in combination with nisin against Enterobacter sakazakii; Lett Appl Microbiol.; GIBSON, G. R.; ROBERFROID, M. B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concepts of prebiotics. Journal Nutrition, Bethesda, v. 125, n. 6, p , 1995.

4 HEMPEL, S. et al. Probiotics for the prevention and treatment of antibiotic-associated diarrhea: a systematic review and meta-analysis. Jama, v. 307, n. 18, p , SMIT, G.; SMIT, B. A.; ENGELS, W. J. Flavour formation by lactic acid bacteria and biochemical flavour profiling of cheese products. FEMS Microbiol Rev, v. 29, n. 3, p , Aug 2005.

5