Caracterização de Queratinase para Valorização Biotecnológica de Resíduos de Penas

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Cármen Câmara Campelo
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1 Sara Raquel Rebelo Pavão Caracterização de Queratinase para Valorização Biotecnológica de Resíduos de Penas Universidade dos Açores Departamento de Biologia Ponta Delgada 2015

2 ÍNDICE RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS 1.1.Seleção do isolado com atividade queratinolítica 1.2.Identificação molecular dos isolados Extração do DNA Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) ARDRA (Amplification Ribossomal DNA Restriction Analysis) 1.3. Amplificação do gene codificante para queratinase a partir de primers degenerados 1.4.Purificação dos fragmentos amplificados e sequenciação 1.5.Determinação do ph e temperatura ótimos das enzimas produzidas pelos isolados com maior atividade queratinolítica 1.6.Determinação do peso molecular das enzimas por Zimograma 1.7. Imobilização do isolado bacteriano com maior atividade queratinolítica 1.8. Curva de crescimento para o isolado com maior atividade queratinolítica 1.9.Determinação da atividade enzimática ao longo do tempo 1.10.Determinação da hidrólise das penas ao longo do tempo de cultura 1.11.Fracionamento cromatográfico 1.12.Caracterização bioquímica da enzima produzida pelo isolado com maior atividade queratinolítica Identificação dos inibidores específicos Identificação dos substratos específicos

3 Determinação da resposta a iões e a solventes Identificação da massa dos péptidos de queratina por MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser desorpstion/ionization time of flight mass spectrometry) RESULTADOS 1.1.Degradação das penas e produção de queratinase 1.2.Identificação molecular dos isolados 1.3. Amplificação do gene codificante para queratinases a partir de primers degenerados 1.4.Purificação dos fragmentos amplificados e sequenciação 1.5.Determinação do peso molecular das enzimas por Zimograma 1.6.Determinação do ph e temperatura ótimos das enzimas produzidas pelos isolados com maior atividade queratinolítica 1.7.Curva de crescimento do isolado com maior atividade queratinolítica 1.8.Determinação da atividade enzimática ao longo do tempo de cultura 1.9.Determinação da hidrólise das penas ao longo do tempo de cultura 1.10.Fracionamento cromatográfico Caracterização bioquímica da enzima com maior atividade queratinolítica Identificação dos inibidores específicos Identificação dos substratos específicos Determinação da resposta a iões e solventes 1.12.Identificação da massa dos péptidos de queratina por MALDI-TOF DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

4 Resumo Este projeto teve como principal objetivo a seleção do isolado com maior atividade queratinolítica com caracterização da queratinase produzida para avaliação do potencial biotecnológico. Neste trabalho estudou-se a capacidade queratinolítica em 76 isolados de Bacillus sp. da coleção de isolados pertencentes ao grupo de Microbiologia e Biotecnologia da Universidade dos Açores. Destes 76 isolados, concluiu-se que 48 eram produtores destas enzimas extracelulares, no entanto apenas 10 apresentavam maior capacidade queratinolítica em penas de galinha. Deste screening resulta que o isolado S196D apresenta maior capacidade queratinolítica digerindo 88,9 % do peso total das penas em apenas 24 h. Por análise ARDRA, agrupou-se estes 10 isolados em três grupos: Bacillus cereus (grupo I), Bacillus subtilis (grupo VII) e Bacillus licheniformis (grupo XIV). O isolado com maior atividade queratinolítica pertence ao grupo dos Bacillus subtilis (grupo VII). Desenhou-se primers degenerados com base em sequências queratinolíticas produzidas por Bacillus subtilis, os quais permitiram a amplificação de um gene codificante para queratinase. A análise em zimograma dos 10 isolados revelou a presença de diferentes bandas de digestão, no entanto perfis diferentes entre isolados do mesmo grupo taxonómico. Os testes com azocaseína revelaram que todos os isolados têm maior eficiência catalítica a ph alcalino (ph 8-11). Os isolados S114C, S155B e S183C têm uma maior eficiência catalítica a ph 11, os isolados S177B e S188D apresentam o seu ótimo de atividade a ph 10, os isolados S195A e S196D revelam um máximo de atividade a ph 9 e, por fim, o isolado S159C tem uma maior eficiência catalítica a ph 8. Todos os isolados têm um ótimo de atividade aos 60º C, no entanto mantêm uma capacidade catalítica superior a 70 % a 37º C.

5 Para o isolado com maior atividade queratinolítica, obteve-se uma curva de crescimento com uma fase exponencial entre as 6 e as 16 h de incubação com produção máxima da enzima às 24 h. A imobilização em agar do isolado S196D permitiu aumentar a eficiência catalítica e diminuir o número de bactérias em suspensão. O estudo da enzima produzida pelo isolado S196D revelou um ótimo de atividade queratinolítica a ph 9 a 37º C, embora a 60º C tenha-se obtido um ótimo de atividade a ph 6 e estabilidade catalítica a ph 6 a 10. A atividade enzimática decresce na presença de PMSF e EDTA. Na presença de substratos específicos a atividade enzimática mostra-se superior para AAPF-pNA e AAPM-pNA. Estes resultados sugerem que a queratinase em estudo pertence às serina protéases do tipo quimiotripsina. A atividade catalítica desta enzima é incrementada por iões divalentes, como o Ca 2+ (10 %) e Mg 2+ (20 %) bem como alguns monovalentes, Na + (10 %) e K + (. Esta atividade é inibida por alguns iões divalentes, tais como o Cu 2+, Ni 2+ e Hg 2+. Outro aspecto muito interessante acerca desta molécula, é o facto de apresentar uma grande estabilidade em contacto com agentes desnaturantes (ureia e SDS), bem como detergentes zigatiónicos (Chaps). O perfil peptídico resultante da hidrólise das penas é muito semelhante ao perfil peptídico comercial utilizado em fórmulas de condicionadores de cabelo, o que pode indicar uma potencial aplicação destes péptidos em cosmética. Adicionalmente a estabilidade térmica da enzima, bem como a sua estabilidade a diferentes valores de ph e agentes desnaturantes, conferem a esta enzima um elevado potencial biotecnológico.

7 Conclusão Dos 76 isolados que se testou a atividade queratinolítica verificou-se que 48 isolados apresentavam atividade catalítica em contacto com substratos de penas de galinha. Destes 48 isolados concluiu-se que apenas 10 apresentavam maior atividade queratinolítica. Os isolados que apresentam maior atividade queratinolítica pertencem ao grupo dos Bacillus subtilis. O isolado com maior atividade queratinolítica (S196D) pertence ao grupo dos Bacillus subtilis apresentado uma digestão de 88,9 % em 24 h de incubação (Tabela 1). Os resultados obtidos mostram que a enzima produzida pelo isolado S196D é uma queratinase, cujo ótimo de atividade encontra-se a 37º C a ph 9 e uma grande estabilidade térmica a 60º C e a esta temperatura com uma estabilidade a ph (6-9). Esta protéase tem uma especificidade em resíduos hidrofóbicos, como a fenilalanina e a metionina na posição p1. Também se pode concluir que esta enzima pertencente à classe das serina-metaloproteases, de acordo com os resultados de inibição (Figura 11). As queratinases apresentam uma vasta aplicabilidade. Relativamente aos produtos resultantes da hidrólise, estes podem ser aplicados em condicionadores de cabelo de forma a hidratar as fibras capilares (Vermelho et al, 2013). Outra aplicabilidade destes péptidos pode ser ao nível da saúde em processos relacionados com a cicatrização. Em trabalhos futuros, poder-se-á purificar esta enzima para posterior caracterização.

8 Referências Bibliográficas Brandelli, A, Daroit, D & Riffel, A. (2010). Biochemical features of microbial keratinases and their production and applications. Microbiol Biotechnol, (85), Giongo, J. (2006). Caracterização e aplicação de protéases produzidas por linhagens de Bacillus sp. ( Dissertação de mestrado, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de agronomia). Gupta, R & Ramnani, P. (2006). Microbial keratinases and their prospective applications: an overview. Microbiol Biotechnol, 0(70), Jeong, J. (2010). Characterization of a multifuncional feather-degrading Bacillus subtilis isolated from forest soil. Biodegradation, 0(21), Kumar et al.. (2010). Optimization of influential parameters for extracellular keratinase production by Bacillus subtilis in solid state fermentation using horn meal - a biowaste management. Microbiol Biotechnol, 0(160), Saleem, M. (2012). Biochemical analysis and investigation on the prospective applications of alkaline protease from a Bacillus cereus strain.. from Vermelho, A. (2011). Biodegradation of feather waste by extracellular keratinases and gelatinases from Bacillus spp. Microbiol Biotechnol, (27), Vermelho, A. (2013). Feather keratin hydrolysates obtained from microbial keratinases: effect on hair fiber. BMC Biotechology, Wileycom. (2015). Wileycom. Retrieved 27 June, 2015, from en/tutotuto_keratin.html Wymer, P. (1994). Enzymes and their role in Biotechnology. (3ª edição ed.). Biochemical Society

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