FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE II

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1 FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE II Instruções de Uso APRESENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DA FAMÍLIA Código MDR172 CDR5 CDR50 CDR1D ABSG ABSM FB2-100 PC1-500 NS Descrição Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR placas Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR5-1 x 5 ml Complemento de Coelho para HLA Classe II - CDR50-1 x 50 ml Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado - CDR1D - 1 x 1 ml Reagente Controle Antilinfócito B IgG - ABSG - 1 x 1 ml Reagente Controle Antilinfócito B IgM - ABSM - 1 x 1 ml Reagente de Isolamento (separação) - FB x 10 ml Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato - PC x 500 ml Reagente Controle Negativo - NS - 1 x 1 ml USO PRETENDIDO A Placa para Tipagem de HLA Terasaki é uma placa de poliestireno com 60, 72 ou 96 poços contendo anticorpos alo ou monoclonais conhecidos contra antígenos HLA. Cada poço contém 1 µl de um antissoro específico ou anticorpo monoclonal e 5 µl de óleo mineral. Cada placa contém um controle positivo e um negativo. Para uso na determinação de antígenos HLA classe II na superfície da 1

2 célula através da metodologia de microlinfocitotoxicidade dependente de complemento. Os controles ABSG, ABSM e NS são usados para testar a pureza das preparações celulares. Podem também ser usados em combinação para identificar a contaminação de preparo de células. Os complementos CDR5, CDR50 e CDR1D são utilizados em ensaios de citotoxicidade dependentes de complementos para determinar os antígenos HLA de Classe II da superfície celular. O componente FB2-100 (Fluorobeads B) fornece um procedimento simples para o isolamento de Linfócitos B para uso em testes de tipagem HLA classe II usando corantes fluorescentes. O componente PC1-500 (PBS/Citrato) é um reagente para ser usado no método de isolamento Fluorobeads B (FB2-100). Esses materiais são para uso em laboratório de imunologia na tipagem HLA. Através desse teste determina-se a compatibilidade HLA entre indivíduos e, por isso, esse teste é denominado de teste de histocompatibilidade. PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO DO PRODUTO Os linfócitos viáveis são incubados com uma mistura de anticorpos ligados a um complemento. Se o linfócito possuir um antígeno reconhecido por um anticorpo específico, a porção FAB do anticorpo se liga ao antígeno, formando um 2

3 complexo antígeno-anticorpo. Após a formação desses complexos, com a fração C1q e o Ca ++ do complemento, ligam-se à porção FC do anticorpo. Um anticorpo IgM é necessário para ligar uma molécula C1q, ou dois anticorpos IgG são necessários para ligar uma molécula C1q. A ligação C1q inicia a cascata do sistema complemento, a qual induz a uma lise da célula com o complexo antígeno-anticorpo. Em uma reação negativa os linfócitos se mantêm viáveis. Em uma reação positiva os linfócitos estão mortos. COMPONENTES FORNECIDOS E NÃO FORNECIDOS Código Material Fornecido Materiais necessários, mas não fornecidos 1) 10 placas de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe II - HLA MDR172; 2) Worksheets identificando a especificidade de cada anticorpo monoclonal; 3) Instruções de uso. 1) Microsseringas HLA (micro dispensadores/dosadores); 2) Insta-Seal (OLI cat. TIS250U) lâminas cobertas ou lâminas de vidro e óleo mineral (Vaseline); 3) Reagentes corantes e fixadores: - Para teste de exclusão de corante: eosina-y (base sódica) e formaldeído, ou Stain-Fix (cat. SF-500 da One 3

4 MDR172 CDR-5 CDR-50 CDR-1D ABSG ABSM 1) 1 frasco com 5 ml de Complemento de Coelho para HLA Classe II; 2) Instruções de uso. 1) 1 frasco com 50 ml de Complemento de Coelho para HLA Classe II; 2) Instruções de uso. 1) 1 frasco com 5 ml de Complemento de Coelho para HLA Classe II Liofilizado; 2) Instruções de uso. 1) 1 frasco com 1 ml de Reagente Controle Antilinfócito B IgG; 2) Instruções de uso. 1) Reagente Controle Antilinfócito B IgM - ABSM - 1 x 1 ml; 2) Instruções de uso. Lambda); - Para teste fluorescente: FluoroQuench AO/EB (cat. # FQAE-500 da One Lambda). 4) Eliminação da Hemoglobina: - De soro bovino liofilizado: EDTA PBS a 5%; azida sódica a 1%. - De células vermelhas totais: solução salina; EDTA PBS a 5%; solução azida a 1%. 5) Solução a 1% de tinta: soro albumina bovino (BSA); EDTA PBS 5%; azida sódica; tinta preta de caligrafia Higgins; 6) Solução 5% EDTA (dissódico) PBS; 7) Solução estoque de Brometo de etídio (EB): água destilada; PBS; 8) Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA); - Solução stock: Dissolva 10 mg de CFDA em 1 ml de acetona num tubo de vidro. Armazene a 20 C em tubos de Beckman. - Solução de trabalho: Use uma das seguintes: Preparado em PBS a ph 7,2: Acrescente 30 μl de solução stock CFDA a 5 ml de PBS (ph 7,2). Armazene a 2 5 C durante um período máximo de 1 semana. Preparado em PBS a ph 5,5: Acrescente 30 μl de solução stock CFDA a 5 ml de PBS (ph 5,5). Armazene a 2 5 C durante um período máximo de 1 semana. Não aplicável. Não aplicável. Não aplicável. Não aplicável. Não aplicável. 4

5 NS 1) 1 frasco com 1 ml de Reagente Controle Negativo; 2) Instruções de uso. Não aplicável. Código Material Fornecido Materiais necessários, mas não fornecidos FB ) 1 frasco com 10 ml de Reagente de Isolamento (separação); 2) Instruções de uso. 1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou equivalentes); 2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 ml e 1,5 ml, com tampas; 3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific, Nº de Catálogo 9249); 4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%; 5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente); 6) Aspirador ou pipetas descartáveis; 7) Reagente PBS/Citrato: - Número de catálogo OLI PC1-500, ou - Reagente PBS/Citrato (1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g de citrato trissódico dihidratado e 2,5 g de ácido cítrico em 90 ml de água destilada. Perfaça um volume final de 100 ml. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5 C. (2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 ml de 10X citrato a 90 ml de PBS. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5 C. 8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS) - Solução stock: Aqueça o FCS a 56 C durante 30 minutos para inativar o complemento. Armazene a uma temperatura entre 2 a 5 C ou aliquote e congele a 20 C; - Solução de trabalho: Adicione 5 ml de solução stock de HIFCS a 95 ml de meio de McCoy ou equivalente. PC ) 1 frasco com 500 ml de Reagente Fosfato Salino Tamponado PBS/Citrato; 2) Instruções de uso. 1) Placas de tipagem tecidual de classe II (One Lambda ou equivalentes); 2) Tubos de vidro ou plástico para centrífuga, de 5 ml e 1,5 ml, com tampas; 3) Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++ (ou seja, Irvine Scientific Nº de Catálogo 9242); 4) Meio de McCoy ou equivalente com HIFCS a 5%; 5) Separador magnético (One Lambda ou equivalente); 6) Aspirador ou pipetas descartáveis; 5

6 7) Reagente PBS/Citrato: - Número de catálogo OLI PC1-500, ou - Reagente PBS/Citrato (1) Solução stock (10X Citrato): Dissolva 7 g de citrato trissódico dihidratado e 2,5 g de ácido cítrico em 90 ml de água destilada. Perfaça um volume final de 100 ml. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5 C. (2) Solução de trabalho (1X PBS/Citrato): Adicione 10 ml de 10X citrato a 90 ml de PBS. Filtre, esterilize e armazene entre 2 a 5 C. 8) Soro fetal de bezerro inativado pelo calor (HIFCS) - Solução stock: Aqueça o FCS a 56 C durante 30 minutos para inativar o complemento. Armazene a uma temperatura entre 2 a 5 C ou aliquote e congele a 20 C; - Solução de trabalho: Adicione 5 ml de solução stock de HIFCS a 95 ml de meio de McCoy ou equivalente. Instrumentos Necessários e Não Fornecidos Microscópio de contraste de fase, que poderá ser invertido e com fluorescência, dependendo da metodologia utilizada para separação de linfócitos. Em caso de dúvidas, sempre consulte a Biometrix Diagnóstica. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA, UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ A validade e as condições de armazenamento e transporte de cada um dos produtos pertencentes a esta família estão indicados a seguir: Código do produto MDR172 CDR-5 Informações sobre transporte Os produtos devem ser transportados congelados, acondicionados com gelo seco. Os produtos devem ser transportados congelados, acondicionados com gelo seco. Temperatura de armazenamento -65 C ou inferior -65 C ou inferior 6

7 CDR-50 CDR-1D ABSG ABSM NS FB2-100 PC1-500 Os produtos devem ser transportados congelados, acondicionados com gelo seco. Os produtos devem ser transportados refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. Os produtos devem ser transportados congelados, acondicionados com gelo seco. Os produtos devem ser transportados congelados, acondicionados com gelo seco. Os produtos devem ser transportados congelados, acondicionados com gelo seco. Os produtos devem ser transportados refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. Os produtos devem ser transportados refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. -65 C ou inferior 2 C-8 C -20 C ou inferior. -20 C ou inferior. -20 C ou inferior. 2 C-8 C 2 C-8 C Caso o material esteja congelado, somente descongelar o que será imediatamente utilizado. Se necessário, aliquotar o conteúdo em tubos de menor volume. Esse volume deve ser determinado por cada laboratório, pois é dependente da rotina de cada um. PRECAUÇÕES Somente para uso em diagnóstico in vitro. Cuidados especiais: quando manusear o produto, utilizar luvas descartáveis. Descartar se houver descongelamento prematuro. CUIDADO: Todos os produtos de origem sanguínea devem ser tratados como potencialmente infecciosos. A fonte de material do qual esse produto foi derivado foi dada como negativa quando testada de acordo com os requerimentos para 7

8 testes pela FDA. Nenhum método de teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitirão agentes infecciosos. Não existem padrões Americanos que indiquem potência ou especificidade. CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA OBJETO DO DIAGNÓSTICO Por se tratar de material para teste diagnóstico, que envolve amostra de origem sanguínea humana, manipular como material potencialmente infeccioso. PROCESSO DE MEDIÇÃO Coleta e Preparo da Amostra a. Sangue armazenado por menos de 24 horas: coloque ml de sangue total em heparina de sódio (1000 unidades/10 ml de sangue) em tubo Vacutainer, tampa verde. b. Sangue armazenado por mais de 24 horas: coloque ml de sangue total em tubo Vacutainer ACD ou CPDA. c. Não use heparina de lítio. IMPORTANTE: o sangue deve ser armazenado horizontalmente entre 22 e 25 C. Não refrigere. Isolamento de Linfócito a Partir de Sangue Fresco 8

9 a. Centrifugue o sangue citrificado ou heparinizado por 10 minutos a 400 g. b. Colete a camada tamponada e dilua em volume igual de PBS (fosfato salino tamponado); misture bem. c. Espalhe o máximo de 2 ml da mistura da camada tamponada/pbs sobre 1,5 ml de Ficoll-Hypaque em tubos de 5 ml e centrifugue por 10 minutos a 1000 x g. d. Colete aproximadamente 1 ml da interfase de cada tubo e transfira para tubos tipo Fisher. Centrifugue por 1 a 1 ½ minuto a 3000 x g em uma centrífuga do tipo Fisher. e. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o concentrado em PBS. Centrifugue por 1 min a 1000 x g (isso remove a maioria das plaquetas). f. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o concentrado em PBS, e então, adicione 1 gota de trombina (100 unidades/ml). Misture. g. Coloque os tubos para girar em uma roda vertical a 8 RPM ou inverta os tubos por 2-5 minutos, ou até que apareçam agregados brancos. h. Centrifugue por 3 minutos a 1000 x g em uma centrífuga do tipo Fisher e transfira o sobrenadante para limpar os tubos Fisher. Os agregados remanescentes podem ser poupados para o procedimento de isolamento de monócitos. Centrifugue o sobrenadante por 1 minuto a 1000 x g. i. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o concentrado por 1 minuto a 1000 x g. Repita. j. Ressuspenda o concentrado em meio de McCoy e ajuste as células para uma concentração de 2x10 6 células/ml de linfócitos totais para tipagem. 9

10 Separando/Isolando Linfócitos B Atualmente, existem diferentes procedimentos para o isolamento de linfócitos B, sendo que os mais utilizados são: a. Através da observação empírica, notou-se que os linfócitos B têm a tendência de se aderir às superfícies sólidas, enquanto que os linfócitos T são relativamente não aderentes. Com isso, o uso da técnica de aderência em lã de nylon ainda pode ser usado por alguns laboratórios, sendo que a viabilidade em células não frescas é bem baixa, dificultando no processo de tipagem de classe II. b. Através do processo onde pérolas imunomagnetizadas se ligam aos linfócitos (T ou B) e, dessa forma, através da atração magnética esses linfócitos são isolados das demais células presentes na amostra. (FluoroBeads específicas para linfócito T ou B). Seguem explicações mais detalhadas sobre as técnicas a seguir: Detalhes de Cada Técnica 1. Microtécnica do Canudo com Lã de Nylon - as proporções dadas abaixo são para coluna capaz de manusear até 10 x 10 6 células/ml: a. Feche uma das saídas de um canudo plástico, flexível e transparente (0,6 x cm) em ângulo de 45 ; b. Proceda com um bom retalhamento de 0,1g de lã de nylon esfregado, encharcando-o em HBSS ou PBS em uma placa de Petri; c. Encha ¾ do canudo com HBSS ou PBS. Então, usando a ponteira de uma pipeta, gradualmente e uniformemente, coloque a lã de nylon dentro do 10

11 canudo para uma altura de aproximadamente 6 cm. Nesse estágio a coluna pode ser armazenada a 4 C por até 2 semanas; d. Corte ou perfure o lado selado do canudo fazendo uma abertura de aproximadamente 2 mm; e. Lave a lã de nylon com 5 ml HBSS ou PBS e então com 5 ml de meio contendo HIFCS a 5%; f. Quando o meio cobrir a lã de nylon, gire o canudo para a posição horizontal e incube por 30 min a 37 C. Alternativamente, use meio préaquecido (morno); g. Adicione 0,5 ml de suspensão de linfócitos purificados (procedimento descrito acima) em HIFCS a 5% ao topo da coluna e permita às células se moverem por todo o percurso dentro da lã. Uma boa separação de células T e B depende da pureza da preparação de linfócitos iniciais, portanto, a suspensão deverá ser isenta de granulócitos e plaquetas; h. Adicione aproximadamente 0,2 ml de HIFCS a 5% ao topo da coluna para prevenir ressecamento. Deixe a coluna deitada e incube a 37 C por 30 min; i. Para recuperar os linfócitos T, realize duas lavagens (8 ml cada) com HIFCS a 5% morno (37 C) gotejando através da coluna que deverá estar na posição vertical. O eluente contém células T não aderentes; j. Para recuperar as células B aderentes, adicione 1,5 ml de HIFCS a 5% à coluna e, repetidamente, esprema o canudo. Continue essa etapa até que 8 ml do meio tenham sido usados; k. Centrifugue ambas as suspensões de células T e B por 5 min a 1000 x g e lave-as uma vez com 1 ml de HIFCS a 5%; 11

12 l. Ressuspenda as células em quantidade mínima de meio (ex. 0,5 ml), verifique a viabilidade, conte as células e ajuste a concentração para 2x10 6 células/ml; m. Na média, esse procedimento deverá fornecer uma recuperação de 80-90% das células. 2. Isolamento de Linfócitos B (Puros) Através de Pérolas Imunomagnetizadas Fluorobeads B (One Lambda, Inc.): Este procedimento leva menos de 10 minutos para ser completado e é realizado totalmente em temperatura ambiente. O reagente de separação Fluorobeads B é composto de partículas imunomagnéticas acopladas a anticorpo monoclonal (CD19) específico para o linfócito B. Essas pérolas se ligam seletivamente aos linfócitos B e, então, são isoladas com o auxílio de um magneto (FBAMAG6 + 6 One Lambda, Inc.). 3. Isolamento a Partir de Sangue Total: a. Dispense 5 ml de sangue em um tubo de 15 ml. b. Adicione 5 ml de PBS/Citrato 1X e misture por inversão. c. Antes do uso, ressuspenda completamente as FluoroBeads B. Agite em Vortex por 10 segundos. d. Adicione 100 µl de FluoroBeads T à amostra de teste. Tampe imediatamente o tubo e o inverta por 2-3 minutos para dispersar as pérolas magnéticas. 12

13 e. Agite delicadamente o tubo através de rotação por 5 minutos à temperatura de C para permitir que as pérolas se liguem às células B (não exceder 5 minutos). Pode ser usada rotação manual ou mecânica. f. Destampe o tubo e coloque-o em um separador magnético por 5 minutos. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Então, remova tubo do magneto. g. Adicione 2-3 ml de PBS/Citrato 1X (PC1-500). Agite o tubo para a ressuspensão das pérolas. h. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 1 minuto. i. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Então, remova o tubo do magneto. j. Repita essa etapa de lavagem somente com o PBS/Citrato 1X outras duas vezes. k. Siga com os procedimentos de identificação e marcação da célula conforme descrito a seguir, ou ressuspenda as células (beads) em 0,5 ml de meio McCoy ou equivalente, com 5% HIFCS. Procedimento de Marcação e Concentração da Célula A. Pelo método CFDA: 1. Destampe e coloque o tubo em um separador magnético por 1 minuto. Remova o sobrenadante. Ressuspenda as células (beads) com PBS. Repita essa etapa duas vezes. 2. Adicione 0,5 ml de CFDA (solução de trabalho, ph 5,5) e misture. 3. Incube o tubo horizontalmente no escuro por 10 minutos a C. 13

14 4. Repetir etapa Ressuspenda as células em 0,5 ml de meio McCoy ou equivalente, com 5% HIFCS. 6. Adicione 1 µl de suspensão celular a um poço branco de uma placa Terasaki. Verifique a contagem de células através de um microscópio de fluorescência. Ajuste a concentração para 2 x 10 6 /ml (2.000 células por poço). 7. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5 ml e armazenadas horizontalmente a 2-5 C por até 2 dias antes de serem aplicadas nas placas para o teste. B. Método do FQAE FluoroQuench (corante) com Brometo de etídeo e Laranja de acridina: 1. Transfira 1 µl de células (beads/pérolas) para um poço branco de uma placa Terasaki. 2. Adicione 5 µl de FQAE (cat. OLI # FQAE-500) ao poço. 3. Verifique a contagem da célula através de um microscópio de fluorescência. Ajuste, remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Então, remova o tubo do magneto. 4. As amostras poderão ser transferidas para tubos de 1,5 ml e armazenadas horizontalmente a 2-5 C por até dois dias antes de serem aplicadas nas placas para o teste. Após esse procedimento, teremos células B prontas para tipagem HLA de classe II. 14

15 Observação: o protocolo a seguir é um protocolo recomendado, partindo-se do pressuposto de que o laboratório estará utilizando a metodologia do FQAE como corante das células. Os tempos de incubação podem variar dependendo da força de tipagem dos reagentes e/ou complemento utilizado. (A One Lambda sugere 30 minutos com o anticorpo e 60 minutos com o complemento, nas placas de tipagem de HLA). Procedendo Com o Teste Devido à resistência de cada reagente, tome os cuidados necessários quando dispensar as células e os reagentes. Não toque o fundo dos poços com as agulhas das seringas. Descongele as placas à temperatura ambiente (20-25 C) por 15 minutos e use-as em até 1 hora após a retirada do freezer. Agite o tubo contendo sua amostra por inversão não agite através do procedimento de pipetagem repetitiva. 1. Para cada poço adicione 1 µl de uma suspensão de linfócitos B (2 x 10 6 células/ml) para as placas de tipagem HLA, usando uma seringa de 50 µl conectada a um dispensador de repetição. 2. Misture as micro-gotas, usando um misturador eletrostático ou um arame. 3. Incube as placas à temperatura ambiente (20 a 25 C) por 60 minutos para as placas monoclonais e avance para a etapa # 6. Para placas com alosoro, incube por 30 minutos a C. 4. Adicione 5 µl de complemento DR (CDR-5, CDR-50 ou CDR1D) a cada poço da placa com alosoro. Incube por 1 hora no escuro. 15

16 Observação: Placas Monoclonais (LMT ou SMT): Não é necessária esta etapa de adição de complemento de coelho e esse período de incubação. Da etapa (4) avance diretamente para a etapa (6). 5. Em cada poço adicione 5 µl de FQAE. 6. As placas podem ser lidas de imediato ou então poderão ser armazenadas a 2-5 C por até dois dias. Célula morta ocorrerá em qualquer poço teste onde o antígeno HLA na superfície da célula é reconhecido pelo seu anticorpo anti-hla conjugado. Para teste de fluorescência, os linfócitos negativos (vivos) aparecem verdes, e os linfócitos positivos (mortos) aparecem vermelhos (quando usando corante fluorescente da One Lambda com laranja de acridina e brometo de etídio FQAE- 500). Avaliação Microscópica dos Testes A contagem da reação é feita pela estimativa de percentual de células mortas. Se houver linfócitos mortos no controle negativo, o percentual de células mortas nos poços restantes deve ser ajustado de acordo. O padrão ASHI de leitura é: Score % de células mortas Interpretação % Negativo % Negativo duvidoso % Positivo fraco % Positivo % Fortemente positivo 16

17 Ilegível As frequências fenotípicas para HLA de classe I variarão de modo diferente nas diferentes populações (caucasoides, negroides, orientais, etc.). Referência 4. CALIBRAÇÃO DO PROCESSO Não existe procedimento de calibração para a metodologia em questão. CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS Não existe cálculo para a obtenção dos resultados da medição. O resultado é feito pelo score da reação pela estimativa de percentual de células mortas realizada pela leitura microscópica. LIMITAÇÕES DO PROCESSO Dificuldades na separação celular e contaminação da preparação de linfócitos com células vermelhas, leveduras, monócitos, plaquetas ou granulócitos podem causar resultados errôneos. Cabe, ainda, salientar que resultados errôneos podem ocorrer quando concentrações de células estão acima ou abaixo do nível aceitável. A contaminação bacteriológica ou a mudança no ph de reagentes monoclonais podem causar reações falso negativas. 17

18 Certos antígenos HLA frequentemente exibem especificidades fracas. Estes são chamados antígenos de reação cruzada e são detalhados por antígenos e anticorpos de cada placa na folha guia de reação modelo que acompanha a placa. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Uma amostra com tipagem previamente conhecida deverá ser utilizado anterior ao início dos testes de rotina para averiguar a confiabilidade do novo lote de placa recebido no laboratório. Somente utilizar as placas dentro de seu prazo de validade. Caso o laboratório queira testar a pureza de suas preparações celulares ou ainda em combinação identificar a contaminação da preparação de células, os Controles da One Lambda poderão ser utilizados conforme explicados abaixo: NS = O soro controle normal é usado para determinar o fundo de células mortas. Esse soro é proveniente de soro humano do sexo masculino que não tenha sofrido transfusão com sangue AB negativo. ABSM, ABSG, ABSMD = Os controles antilinfócitos B são usados para determinar a pureza dos linfócitos B. Os controles antilinfócitos B são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos B sem reatividade contra granulócitos, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. (OBS.: O ABSG, na diluição de trabalho fornecida, não é recomendado para o 18

19 teste de células com leucemia crônica linfocitária, nas placas LCT30D da One Lambda.) AGSM, AGSMD = Os controles antigranulócitos são utilizados para determinar a pureza dos granulócitos. Esses controles são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos granulócitos, mas sem reatividade contra linfócitos B, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. AMSM, AMSMD = Controles antimonócitos são usados para determinar a pureza de monócitos. Os controles antimonócitos são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a monócitos, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, linfócitos T, plaquetas e células vermelhas do sangue teste. ATSG, ATSM, ATSMX, ATSMD = Controles antilinfócitos T que são utilizados para determinar a pureza de linfócitos T. Os controles antilinfócitos T são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a linfócitos T, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. OBS.: O ATSMX é o único controle anti-t para ser utilizado com células isoladas com FluoroBeads T. ALSG, ALSM = Controle antilinfócitos totais são usados para determinar a reatividade do complemento. Esse controle é feito com anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos humanos. OBS.: não utilize ALSG como controle para teste com DTT (Ditiotreitol), pois o DTT irá degradá-lo. 19

20 VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS Estes dados não estão disponíveis para a metodologia em questão. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO A. Potência e especificidade: Os reagentes-teste foram precisamente caracterizados por triagens sequenciais sorológicas separadas. Os painéis de amostras de referência de linfócitos congelados foram usados em duas triagens separadas. Dois terços de todos os reagentes selecionados são fortes, com reatividade HLA específica claramente definida (com 70% de índice de força), permitindo não mais que 10% de reações falso positivas e 15% de reações falso negativas. O restante - um terço de reagentes - não foram de encontro com esse critério, mas foram exaustivamente investigados quanto à sua utilidade quando usados para sustentar outros anticorpos bem-definidos. Anticorpos multiespecíficos foram usados somente se anticorpos não monoespecíficos são disponíveis para uma especificidade em particular. Anticorpos multiespecíficos foram escolhidos com o mesmo desempenho característico para todas as especificidades como o anticorpo monoespecífico. A triagem contra um 20

21 painel de linfócitos frescos preparados foi utilizada para confirmar e validar a força do soro e sua especificidade. As análises foram feitas usando técnicas computadas no Eighth International Histocompatibility Workshop em (referência 4). B. Controle Negativo O antissoro do controle negativo é originário de um sangue saudável humano masculino do tipo AB, o qual não possui reatividade citotóxica em testes com doadores de linfócitos selecionados ao acaso. Esse controle é usado para determinar a viabilidade do linfócito. C. Controle Positivo: O controle positivo é um anticorpo monoclonal com ação fortemente citotóxica aos linfócitos humanos. Esse controle é usado para determinar a atividade de complemento. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS TERASAKI PI, BERNOCO F., PARK MS, OZTURK G, IWAKI Y. Microdroplet testing for HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol 69: , DANILOVS J, TERASAKI PI, PARK MS, AYOUB G. B lymphocyte isolation by thrombin nylon wool. In Histocompatibility Testing. Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA ,

22 ASHI Laboratory Manual, 2 nd ed. Edited by Zachary, Andrea A. and Teresi, Gary, p. 199, TERASAKI PI, Ed., Histocompatibility Testing. Los Angeles, CA, NIKAEIN A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3 rd Edition, ASHI, Lenexa, KS. IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE One Lambda, Inc Kittridge Street Canoga Park CA - EUA REGISTRO ANVISA NÚMERO RESPONSÁVEL TÉCNICA 22

23 Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: REVISÕES Revisão Descrição da Alteração Data 00 Elaboração 09/ Formatação, layout, produtos descontinuados, alteração nas condições de armazenagem e transporte, inclusão das denominações comerciais de cada item da família, inclusão de 02/2011 número de registro e alteração de Responsável Técnica 02 Alteração do DDG 09/ Revisão ortográfica e gramatical, formatação, alteração de Responsável Técnica 12/