FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE I

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1 FAMÍLIA HLA SOROLÓGICO DE CLASSE I Instruções de Uso APRESENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DA FAMÍLIA Código LMB2701 LMB2703 LM 172 LM144 A LM144 B CABC5 CABC-50 CABC-1D AHG1 ATSG ATSM ATSMX AMSM AGSM ALSG ALSM NS FB1-100 FB1-DEV Descrição Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe I HLA 10 placas Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe I HLA - 10 placas Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe I HLA - 10 placas Placa de Tipagem de Tecido Monoclonal Classe I Especial HLA - SMT 144 A e SMT 144 B: 10 conjuntos de placas cada um com um par de placas Complemento de Coelho para HLA Classe I - 1 frasco com 5 ml Complemento de Coelho para HLA Classe I - 1 frasco com 50 ml Complemento de Coelho para HLA Classe I Liofilizado - 1 frasco com 1 ml Soro Kappa de Cabra Anti-Humano - 1 frasco de 1 ml Reagente Controle Antilinfócito T IgG - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Antilinfócito T IgM - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Anti-T IgM - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Antimonócitos IgM - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Antigranulócitos IgM - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Antilinfócito IgG - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Antilinfócito IgM - 1 frasco para 1 ml Reagente Controle Negativo NS: 1 frasco para 1 ml Reagente de Isolamento (Separação) - 1 frasco para 10 ml Reagente de Isolamento (Separação) - 1 frasco para 22 ml USO PRETENDIDO A Placa para tipagem HLA Terasaki é uma placa de poliestireno com 60, 72 ou 96 poços contendo anticorpos alo ou monoclonais conhecidos contra o antígeno HLA. Cada poço contém 1 microlitro de um antissoro específico ou anticorpo monoclonal e 5 microlitros de óleo mineral. Cada placa contém um controle positivo e um negativo, para uso na determinação de antígenos HLA classe I na superfície da célula através da metodologia de microlinfocitotoxicidade dependente de complemento. Material para uso em laboratório de imunologia na tipagem HLA, através deste teste determina-se a compatibilidade HLA entre indivíduos. Este exame é denominado de teste de histocompatibilidade. 1

2 PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO DO PRODUTO As placas para tipagens monoclonais HLA de classe I contêm uma mistura de reagentes conhecidos e complemento de coelho, os quais são usados para determinar a presença de antígenos HLA de classe I em linfócitos T. Cada poço contém 1 microlitro (1 µl) de um anticorpo específico mais o complemento, bem como 5 microlitros (5 µl) de óleo mineral. Cada placa contém um controle positivo e negativo. Os linfócitos viáveis são incubados em uma mistura de anticorpos ligados a complemento. Se o linfócito possuir um antígeno reconhecido por um anticorpo específico, a porção FAB do anticorpo se liga ao antígeno, formando um complexo antígeno-anticorpo. Após a formação destes complexos, a fração C1q e o Ca ++ do complemento ligam-se à porção FC do anticorpo. Um anticorpo IgM é necessário para ligar uma molécula C1q ou dois anticorpos IgG são necessários para ligar uma molécula C1q. A ligação C1q inicia a cascata do sistema complemento a qual induz a uma lise da célula com o complexo antígeno-anticorpo. Em uma reação negativa, os linfócitos se mantêm viáveis. Em uma reação positiva, os linfócitos são mortos. COMPONENTES FORNECIDOS Placa plástica de tipagem HLA classe I 60, 72 ou 96 poços, composta por material de origem sérica humana (alossoro ou monoclonal), com determinadas especificidades, conforme identificação em cada uma das folhas de leitura em anexo (worksheets). Folhas de leitura identificando a especificidade de cada anticorpo. MATERIAIS E INSTRUMENTOS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS Materiais Microsseringas HLA (microdispensadores/dosadores) Lamínulas plásticas para cobrir as placas tipo Terasaki - Insta-Seal (cat. # TIS250U da One Lambda) ou lamínulas de vidro, e vaselina (petrolatum) Reagentes corantes e fixadores: o Para teste de exclusão de corante: eosina-y (base sódica) e formaldeído, ou Stain-Fix (cat. SF-500 da One Lambda) o Para teste fluorescente: FluoroQuench AO/EB (cat. # FQAE-500 da One Lambda) Extinção Hemoglobina o De soro bovino liofilizado: EDTA PBS a 5%; azida sódica a 1%. 2

3 o De células vermelhas totais: solução salina; EDTA PBS a 5%; solução azida a 1%. Solução a 1% de tinta: soro albumina bovino (BSA); EDTA PBS 5%; azida sódica; tinta preta de caligrafia Higgins Solução 5% EDTA (dissódico) PBS Solução estoque de Brometo de etídio (EB): água destilada; PBS. Diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) FluoroBeads e FluoroQuench Instrumentos Microscópio de contraste de fase, que poderá ser invertido e com fluorescência, dependendo da metodologia de separação de linfócitos utilizada. Consultar o representante local para maiores esclarecimentos. CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA, UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ Validades e condições de armazenamento e transporte de cada um dos produtos pertencentes a esta família estão indicados em tabela abaixo. Código Temperatura de transporte Temperatura de armazenamento LMB2701 congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior LMB2703 congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior LM 172 congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior LM144 A LM144 B congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior CABC-5 congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior CABC-50 congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior CABC-1D refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. 2 C-8 C AHG1 congelados, acondicionados com gelo seco. -65 C ou inferior ATSG congelados, acondicionados com gelo seco. -20 C ou inferior ATSM congelados, acondicionados com gelo seco. -20 C ou inferior ATSMX congelados, acondicionados com gelo seco. -20 C ou inferior AMSM congelados, acondicionados com gelo seco. -20 C ou inferior AGSM congelados, acondicionados com gelo seco. -20 C ou inferior 3

4 ALSG ALSM NS FB1-100 FB1-DEV congelados, acondicionados com gelo seco. congelados, acondicionados com gelo seco. congelados, acondicionados com gelo seco. refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. refrigerados, acondicionados com gelo reciclável. -20 C ou inferior -20 C ou inferior -20 C ou inferior 2 C-8 C 2 C-8 C Os produtos que necessitam de transporte em temperatura diferente da ambiente deverão, durante o seu transporte, estar acondicionados em caixas de isolamento térmico, não sendo expostas ao calor ou umidade. No caso de material congelado, somente descongelar a placa que será utilizada imediatamente, caso contrário, permanecer com as placas no interior do freezer nas temperaturas indicadas acima. No caso dos complementos e controles, alíquotas em tubos de menor volume são recomendadas. Este volume deve ser determinado por cada laboratório, pois é dependente da rotina individual de cada um. PRECAUÇÕES Somente para uso em diagnóstico in vitro. Cuidados especiais: quando do manuseio do produto, utilizar luvas descartáveis. Descartar se houver descongelamento prematuro. IMPORTANTE: quando se tratar de material altamente perecível, o transporte e armazenagem devem ser a -65 C, com gelo seco ou freezer. CUIDADO: Todos os produtos de origem sanguínea devem ser tratados como potencialmente infecciosos. A fonte de material do qual esse produto foi derivado foi dada como negativa quando testada de acordo com os requerimentos para testes pela FDA. Nenhum método de teste conhecido pode assegurar que produtos derivados de sangue humano não transmitirão agentes infecciosos. Não existem padrões Americanos que indiquem potência ou especificidade. CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA Tratar como potencialmente infeccioso por ser material para teste diagnóstico que envolve amostra de origem sanguínea humana. 4

5 PROCESSO DE MEDIÇÃO Coleta e Preparo da Amostra a. Sangue armazenado por menos de 24 horas: coloque ml de sangue total em heparina de sódio (1000 unidades/10 ml de sangue) em vacutainer tampa verde. b. Sangue armazenado por mais de 24 horas: coloque ml de sangue total em Vacutainer ACD ou CPDA. c. Não use heparina de lítio. IMPORTANTE: o sangue deve ser armazenado horizontalmente entre 22 e 25 C. Não refrigere. Isolamento de Linfócito a Partir de Sangue Fresco 1. Centrifugue sangue citrificado ou heparinizado por 10 minutos a 400 x g. 2. Colete a camada tamponada e dilua em volume igual de PBS (fosfato salino tamponado); misture bem. 3. Espalhe um máximo de 2 ml da mistura da camada tamponada/pbs sobre 1,5 ml de Ficoll-Hypaque em tubos de 5 ml, e centrifugue por 10 minutos a 1000 x g. 4. Colete aproximadamente 1 ml da interfase de cada tubo e transfira para tubos tipo Fisher. Centrifugue por 1 a 1 ½ minutos a 3000 x g em uma centrífuga tipo Fisher. 5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o grânulo em PBS. Centrifugue por 1 min. a 1000 x g (isto remove a maioria das plaquetas). 6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o grânulo em PBS, e então, adicione 1 gota de trombina (100 unidades/ml). Misture. 7. Coloque os tubos para girar em uma roda vertical a 8 RPM ou inverta os tubos por 2-5 minutos ou até que apareçam agregados brancos. 8. Centrifugue por 3 minutos a 1000 x g em uma centrífuga tipo Fisher e transfira o sobrenadante para limpar os tubos tipo Fisher. Os agregados remanescentes podem ser poupados para o procedimento de isolamento de monócitos. Centrifugue o sobrenadante por 1 minuto a 1000 x g. 9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o grânulo por 1 minuto a 1000 x g. Repita. 10. Ressuspenda o grânulo em meio de McCoy e ajuste as células para uma concentração de 2x10 6 células/ml de linfócitos totais para tipagem. Separando/Isolando Linfócitos T Atualmente existem diferentes procedimentos para o isolamento de linfócitos T, sendo que os mais utilizados são: 1. Através da observação empírica, notou-se que os linfócitos B tem a tendência de se aderirem a superfícies sólidas, enquanto que os linfócitos T são relativamente não aderentes. Com isso, o uso da 5

6 técnica de aderência em lã de nylon ainda pode ser usada por alguns laboratórios, sendo que a viabilidade em células não frescas é bem baixa, dificultando no processo de tipagem de classe II. 2. Através do processo onde pérolas imunomagnetizadas se ligam aos linfócitos (T ou B) e, desta forma, através da atração magnética esses linfócitos são isolados das demais células presentes na amostra. (FluoroBeads específicas para linfócito T ou B). Detalhes de Cada Técnica 1. Microtécnica do canudo com lã de nylon: As proporções dadas abaixo são para coluna capaz de manusear até 10 x 10 6 células. a. Feche uma das saídas de um canudo plástico, flexível e transparente (0,6 x cm) em ângulo de 45º. b. Proceda com um bom retalho de 0,1 g de lã de nylon esfregado, encharcando-o em HBSS ou PBS em uma placa de Petri. c. Encha ¾ do canudo com HBSS ou PBS, então, usando a ponteira de uma pipeta, gradualmente e uniformemente, coloque a lã de nylon dentro do canudo para uma altura de aproximadamente 6 cm. Nesse estágio a coluna pode ser guardada a 4 C por até 2 semanas. d. Corte ou perfure o lado selado do canudo fazendo uma abertura de aproximadamente 2 mm. e. Lave a lã de nylon com 5 ml HBSS ou PBS e então com 5 ml de meio contendo HIFCS a 5% f. Quando o meio cobrir a lã de nylon, gire o canudo para a posição horizontal e incube por 30 min. a 37 C. Alternativamente, use meio pré-aquecido (morno). g. Adicione 0,5 ml de suspensão de linfócitos purificados (procedimento descrito acima) em HIFCS a 5% ao topo da coluna e permita ás células se moverem por todo o percurso dentro da lã. Uma boa separação de célula T e B depende da pureza da preparação de linfócitos inicial. Portanto, a suspensão deverá ser isenta de granulócitos e plaquetas. h. Adicione aproximadamente 0,2 ml de HIFCS a 5% ao topo da coluna para prevenir ressecamento. Deixe a coluna deitada e incube a 37 C por 30 min. i. Para recuperar os linfócitos T, conceda duas lavagens (8 ml cada) de HIFCS a 5% morno (37 C) gotejando através da coluna que deverá estar na posição vertical. O eluente contém células T não aderentes. j. Para recuperar as células B aderentes, adicione 1,5 ml de HIFCS a 5% à coluna e repetidamente esprema o canudo. Continue esta etapa até que 8 ml do meio tenha sido usado. k. Centrifugue ambas as suspensões de células T e B por 5 min. a 1000 x g e lave-as uma vez com 1 ml de HIFCS a 5%. 6

7 l. Resuspenda as células em quantidade mínima de meio (ex. 0,5 ml), verifique a viabilidade, conte as células e ajuste a concentração para 2x10 6 células/ml. m. Na média, esse procedimento deverá fornecer uma recuperação de 80-90% das células. 2. Isolamento de linfócitos T puros através de pérolas imunomagnetizadas Fluorobeads T (One Lambda, Inc.). Esse procedimento leva menos de 10 minutos para ser completado, sendo que o procedimento é realizado totalmente em temperatura ambiente. Fluorobeads T é um reagente de separação composto de partículas imunomagnéticas acopladas a anticorpo monoclonal (CD2) específico para o linfócito T. Essas pérolas se ligam seletivamente aos linfócitos T e são então isoladas com o auxílio de um magneto (FBAMAG6 + 6 One Lambda, Inc.). 3. Isolamento a partir de Sangue Total a. Dispense 2 ml de sangue dentro de um tubo de 5 ml. b. Resuspenda a solução FluoroBeads T completamente antes do uso. Agite em aparelho agitador tipo Vortex por 10 segundos. c. Adicione 100 µl de FluoroBeads T à amostra teste. Imediatamente tampe o tubo e inverta-o por 2-3 minutos para dispersar as pérolas magnéticas d. Agite delicadamente o tubo através de rotação por 3 minutos à temperatura de C para permitir que as pérolas se liguem às células B (não exceder 4 minutos). Pode ser usada rotação manual ou mecânica. e. Adicione 2 ml de developer (solução de trabalho). Tampe o tubo e inverta-o 2 a 3 vezes para misturar. Esta etapa é essencial! f. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 3 minutos. g. Remova e descarte o sobrenadante com uma pipeta descartável. Remova então o tubo do magneto. h. Lave as células (pérolas) com 1-2 ml PBS/citrato. Delicadamente agite o tubo para dispersar as pérolas. Recoloque o tubo no separador magnético por 1 minuto. Remova e descarte os sobrenadantes. Repita esta operação duas vezes. i. Destampe o tubo e coloque-o em separador magnético por 1 minuto. Remova o sobrenadante. Lave as células (pérolas) duas vezes com PBS. j. Adicione 0,5 ml de CFDA (solução de trabalho ph 5.5) e agite. k. Incube o tubo horizontalmente no escuro por 10 minutos à temperatura de C. l. Magneticamente faça a separação (como descrito acima) e lave as células duas vezes com PBS. m. Ressuspenda as células em 0,5 ml de McCoy com 5% de HIFCS. 7

8 n. Adicione 1 µl de célula ressuspendida em um poço de placa Terasaki virgem. Verifique a contagem de células através de um microscópio fluorescente. Ajuste a concentração para 2 x 10 6 /ml (2.000 células por poço) o. A amostra pode ser transferida para um tubo Fisher e armazenada horizontalmente à temperatura de 2-5 C por até 3 dias antes de ser testado. Após este procedimento, teremos células T prontas para tipagem HLA classe I. Procedendo Com o Teste Devido à resistência de cada reagente, adote os cuidados necessários quando dispensando as células e os reagentes. Não toque o fundo dos poços com as agulhas das seringas. Descongele as placas em temperatura ambiente (20-25 C) por 15 minutos, e use-a em até uma hora após a retirada do freezer. 1. Para cada poço adicione 1µl de uma suspensão de linfócitos T de 2 x 10 6 para as placas de tipagem HLA, usando uma seringa de 50 µl conectada a um dispensador de repetição. 2. Misture as microgotas usando um misturador eletrostático ou um arame. 3. Incube as placas à temperatura ambiente (20 a 25 C) por 60 minutos. 4. Após a incubação, core e fixe as células: a. Para teste de exclusão de corante, adicione a cada poço: 5 µl de corante eosina, seguido de, após 2 minutos, 5 µl por poço de formaldeído, ou 10 µl de Stain-Fix (cat # SF-500 da One Lambda) b. Para teste por fluorescência, adicione 5 µl de FluoroQuench AO/EB (cat # FQAE-500 da One Lambda) em cada poço. 5. Cubra as placas com lâmina de vidro e sele-as com petrolato derretido ou com lamínulas para placas Terasaki Insta-Seal TM. Deixe as placas repousarem por 15 minutos (temperatura ambiente) para que os linfócitos possam assentar. A formação de borbulhas nas placas pode ser reduzida colocando-as no refrigerador. Elas podem ser lidas uma ou duas semanas após a selagem (somente pelo método de exclusão de corante). As placas pelo método fluorescente podem ser armazenadas a 2-5 C no escuro por até 2 dias. Célula morta ocorrerá em qualquer poço teste onde o antígeno HLA na superfície da célula é reconhecido pelo seu anticorpo anti-hla conjugado. Quando a técnica de exclusão de corante é usada, linfócitos negativos (vivos) aparecem pequenos, brilhantes e não refrativos. Linfócitos positivos (mortos) aparecem escuros e não refrativos com corante eosina. 8

9 As reações são marcadas (scores) pela estimativa de percentual de células mortas, através de leitura microscópica. Para teste fluorescente, os linfócitos negativos (vivos) aparecem verdes, e os linfócitos positivos (mortos) aparecem vermelhos (quando usando corante fluorescente da One Lambda com laranja de acridina e brometo de etídio). Avaliação Microscópica dos Testes A contagem da reação é feita pela estimativa de percentual de células mortas. Se houver linfócitos mortos no controle negativo, o percentual de células mortas nos poços restantes tem que ser ajustado de acordo. O padrão ASHI de leitura é: Score % de células mortas Interpretação % Negativo % negativo duvidoso % Positivo fraco % Positivo % fortemente positivo não legível As frequências fenotípicas para HLA classe I variarão de modo diferente nas diferentes populações (caucasoides, negroides, orientais, etc.). Referência 4. CALIBRAÇÃO DO PROCESSO Não existe procedimento de calibração para a metodologia em questão. CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS Não existe cálculo para a obtenção dos resultados da medição. O resultado é feito pela contagem da reação pela estimativa de percentual de células mortas realizada pela leitura microscópica. LIMITAÇÕES DO PROCESSO Dificuldades na separação celular e contaminação da preparação de linfócitos com células vermelhas, levedura, monócitos, plaquetas ou granulócitos podem causar resultados errôneos. Cabe ainda salientar que resultados errôneos podem ocorrer quando concentrações de células estão acima ou abaixo do nível aceitável. Contaminação bacteriológica ou mudança no ph de reagentes monoclonais podem causar reações falso negativas. Certos antígenos HLA 9

10 frequentemente exibem especificidades fracas. Estes são chamados antígenos de reação cruzada e são detalhados por antígenos e anticorpos de cada placa na folha guia de reação modelo que acompanha a placa. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Uma amostra de um painel previamente conhecido deverá ser tipado anterior ao início dos testes de rotina para averiguar a confiabilidade do novo lote de placa recebido no laboratório. Somente utilizar as placas dentro de seu prazo de validade. Caso o laboratório queira testar a pureza de suas preparações celulares ou ainda em combinação identificar a contaminação da preparação de células, os Controles da One Lambda poderão ser utilizados conforme explicados abaixo: NS = Soro de controle normal que é usado para determinar o fundo de células mortas. Esse soro é proveniente de soro humano do sexo masculino que não tenha sofrido transfusão com sangue AB negativo. ABSM, ABSG, ABSMD = Controles antilinfócitos B que são usados para determinar a pureza dos linfócitos B. Os controles antilinfócitos B são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos linfócitos B sem reatividade contra granulócitos, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. (OBS.: ABSG na diluição de trabalho fornecida, não é recomendado para o teste de células com leucemia crônica linfocitária, nas placas LCT30D da One Lambda). AGSM, AGSMD = Controles antigranulócitos que são utilizados para determinar a pureza dos granulócitos. Esses controles são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos granulócitos, mas sem reatividade contra linfócitos B, linfócitos T, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. AMSM, AMSMD = Controles antimonócitos que são usados para determinar a pureza de monócitos. Os controles antimonócitos são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a monócitos, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, linfócitos T, plaquetas e células vermelhas do sangue teste. ATSG, ATSM, ATSMX, ATSMD = Controles antilinfócitos T que são utilizados para determinar a pureza de linfócitos T. Os controles antilinfócitos T são anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos a linfócitos T, mas sem reatividade contra granulócitos, linfócitos B, plaquetas, monócitos e células vermelhas do sangue teste. OBS.: ATSMX é o único controle anti-t para ser utilizado com células isoladas com FluoroBeads T. ALSG, ALSM = Controles antilinfócitos totais que são usados para determinar a reatividade do complemento. Esse controle é feito com anticorpos monoclonais os quais são fortemente citotóxicos aos 10

11 linfócitos humanos. OBS.: não utilize ALSG como controle para teste com DTT (Ditiotreitol) pois o DTT irá degradá-lo. VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO A. Potência e Especificidade Os reagentes-teste foram precisamente caracterizados por triagens sequenciais sorológicas separados. Painéis de referência de amostras de linfócitos congelados foram usados em duas triagens separadas. Dois terços de todos os reagentes selecionados são fortes, com reatividade HLA específica claramente definida (com 70% de índice de força), permitindo não mais que 10% de reações falso positivas e 15% de reações falso negativas. O restante (um terço dos reagentes) não foram de encontro a esse critério, mas foram exaustivamente investigados quanto à sua utilidade quando usados para sustentar outros anticorpos bem definidos. Anticorpos multiespecíficos são usados somente se anticorpos não monoespecíficos são disponíveis para uma especificidade em particular. Anticorpos multiespecíficos foram escolhidos com o mesmo desempenho característico para todas as especificidades como o anticorpo monoespecífico. Para confirmar e validar a força e especificidade do soro, foram feitas triagens contra um painel de linfócitos frescos preparados. As análises foram feitas usando técnicas de computadas do Eighth International Histocompatibility Workshop em (referência 4). B. Controle Negativo O antissoro do controle negativo é originário de um sangue saudável humano masculino do tipo AB, o qual não possui reatividade citotóxica em testes com doadores de linfócitos selecionados ao acaso. Este controle é usado para determinar a viabilidade do linfócito. C. Controle Positivo O controle positivo é um anticorpo monoclonal e é fortemente citotóxico aos linfócitos humanos. Este controle é usado para determinar a atividade de complemento. 11

12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS TERASAKI PI, BERNOCO F, PARK MS, OZTURK G, IWAKI Y. Microdroplet testing for HLA A, B, C and D antigens. Am J. Clin Pathol 69: , DANILOVS J, TERASAKI PI, PARK MS, AYOUB G. B lymphocyte isolation by thrombin nylon wool. In Histocompatibility Testing. Terasaki PI, Ed., UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, CA , ASHI Laboratory Manual, 2 nd ed. Edited by Zachary, Andrea A. and Teresi, Gary, p. 199, TERASAKI PI, Ed., Histocompatibility Testing. Los Angeles, CA, NIKAEIN A, Ed., ASHI Procedure Manual, 3 rd Edition, ASHI, Lenexa, KS. IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE One Lambda, Inc Kittridge Street Canoga Park CA EUA REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR:

13 REVISÕES Revisão Descrição da Alteração Data 00 Elaboração 10/ Formatação, layout, produtos descontinuados, alteração nas condições de armazenagem e transporte, inclusão das denominações comerciais de cada item da família, inclusão de número de registro e alteração de Responsável Técnica Correção das temperaturas de armazenamento do CABC-1D e AHG1 01/ / Alteração do DDG 09/ Revisão gramatical e ortográfica, layout, alteração de Responsável Técnica 12/