FLUOROQUENCH AO/EB. Reagente Corante Fixador. Instruções de Uso. Fluoroquench AO-EB 500 ml

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1 FLUOROQUENCH AO/EB Reagente Corante Fixador Instruções de Uso APRESENTAÇÃO DO PRODUTO Código FQAE-100 FQAE-500 Descrição Fluoroquench AO-EB 100 ml Fluoroquench AO-EB 500 ml USO PRETENDIDO Esse reagente é usado para corar fluorescentemente e fixar linfócitos em uma placa teste do tipo Terasaki, em ensaios de microlinfotoxicidade. Os produtos FluoroQuench AO/EB incluem uma mistura de reagentes para facilitar a avaliação microscópica das células e para prolongar a conservação das placas para uma posterior avaliação. PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO Em testes HLA, um reagente fixador pode reduzir significativamente o plano de fundo fluorescente. O EDTA é usado para parar a reação complemento-dependente de lise celular. O brometo de etídio (EB) é usado para corar as células mortas. O laranja de acridina (AO) é usado para corar células vivas. Consulte o esquema a seguir para melhor entendimento do princípio: 1

2 PRINCÍPIOS O corante, após a lise celular, penetrará nas células mortas (corandoas de vermelho) e nas células vivas (corando-as de verde). O processo de coloração das células é a etapa final do teste sorológico HLA. Na figura abaixo damos uma ideia de como as leituras devem ser feitas: O procedimento prático é resumido conforme diagrama abaixo: 2

3 MATERIAIS FORNECIDOS Hemoglobina bovina Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) Brometo de etídio (EB) Laranja de acridina (AO) Azida sódica FluoroQuench AO/EB pode ser apresentado pronto para uso em dois frascos diferentes: um com 100 ml (FQAE-100) e outro com 500 ml (FQAE-500) MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS Dispensador 5 µl, tampas plásticas CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA, UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ Deve ser armazenado em temperatura entre 2 e 8 C. O transporte pode ser realizado em temperatura ambiente ou gelo reciclável. Esse produto deve ficar protegido da luz solar e umidade excessiva. PRECAUÇÕES Pode causar irritação aos olhos, pele, membranas das mucosas e trato respiratório superior. Não deixe entrar em contato com olhos, ou pele, ou vestimenta. Pode ser tóxico por inalação, em contato com a pele, ou se engolido. A exposição ao produto pode causar náusea, dor de cabeça e vômito. Evite exposição prolongada ou repetitiva. Pode causar dano em herança genética (mutagênese). Em contato com ácido, libera gás altamente tóxico. Ao manipular, é preciso adotar precauções de utilização adequada de EPI equipamento de proteção individual. Sempre use luvas e evite contato dos reagentes ou amostras com a pele. Controles de Engenharia: A ventilação geral do laboratório deve ser adequada para a utilização normal. Proteção respiratória: Normalmente, não é necessária nenhuma. Proteção das mãos: Utilizar luvas resistentes a produtos químicos. Proteção para os olhos: É recomendada a utilização de óculos de segurança. 3

4 Proteção da pele: Usar vestimenta de laboratório. Outros Controles: Recomenda-se ducha de segurança e lavagem ocular. Ingestão: Pode causar irritação do trato intestinal e outros efeitos adversos. Contém <0,1% de azida sódica. Há relatos de que a ingestão de azida sódica pode causar falta de ar, náuseas, vômitos, agitação, diarreia, queda de tensão arterial (hipotensão) e colapso. Contato com a Pele: Pode causar irritação. O contato prolongado e extenso pode resultar em absorção com sintomas sistêmicos semelhantes à ingestão. O contato repetido com a pele pode causar reações alérgicas (sensibilidade). Contato com os Olhos: Pode causar irritação. CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA Tratar a amostra como potencialmente infecciosa, devido à sua origem biológica. PROCESSO DE MEDIÇÃO Importante: Agite antes de usar. Para evitar contaminação, não reaproveite o reagente não usado não o devolva para o frasco mãe de solução. 1. Use seus métodos habituais para isolar e identificar sua amostra teste. 2. Depois da incubação com complemento, dispense 5 µl de FluoroQuench AO/EB em cada poço. Use a técnica de softdrop (dispensação suave, que é obtida aspirando um pouco de ar antes de aspirar o reagente colchão de ar ). 3. Coloque a lâmina plástica para tampar a placa. 4. Deixe as placas descansarem a C por aproximadamente 15 minutos antes da avaliação microscópica. 5. Placas podem ser armazenadas no escuro, a 2 5 C, por 2 3 dias. Detalhamento da Parte Prática 1. Partir de uma amostra com linfócitos na quantidade de 2 x 10 6 /ml µl de linfócito é dispensado no interior de cada poço da placa tipo Terasaki. 3. Ao utilizar uma placa sem o complemento inserido no poço, faça uma incubação por meia hora, à temperatura ambiente. 4. Adicione 5 µl de complemento de coelho em cada poço. 5. Proceda com a incubação pelo período de uma hora, à temperatura ambiente. 6. Adicione, então, o corante em cada poço (nesse caso, 5 µl de Fluoroquench). 7. As placas são, então, lidas em microscópio. 4

5 CALIBRAÇÃO DO PROCESSO Não se aplica. OBTENÇÃO DOS RESULTADOS Os resultados dependerão da análise individual, sendo que a tabela abaixo deve ser observada: 1 0% - 10% de células mortas Negativo 2 11% - 20% de células mortas Negativo 4 21% - 50% de células mortas Fraco positivo 6 51% - 80% de células mortas Positivo 8 81% - 100% de células mortas Positivo 0 Poço sem leitura devido a uma de inúmeras razões LIMITAÇÕES DO PROCESSO Dificuldades com a separação das células e contaminação nas preparações de linfócitos com células vermelhas, leveduras, monócitos, plaquetas, ou granulócitos podem causar resultados errôneos. Adicionalmente, resultados errôneos podem ocorrer quando a concentração celular for acima ou abaixo do nível aceitável. CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Sempre deve haver uma segunda pessoa para revisar a primeira leitura. A quantidade de células deverá ser checada e deve estar dentro do valor de 2 x 10 6 linfócitos/ml. Para validação do produto em caso de novo lote, o laboratório poderá realizar um teste com células com tipagem conhecida em duplicata, utilizando ambos os produtos: o antigo e o novo. VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão. 5

6 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO O plano de fundo fluorescente não específico será reduzido, e a lise celular complemento-dependente será interrompida. As células mortas fluorescerão vermelhas, enquanto que células viáveis fluorescerão verdes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DOMBRAUSKY, M., Comparision of 10% Hemoglobin/ 5% EDTA Quench vs. FluoroQuench. HLA Technical Workshop, IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE One Lambda, Inc Kittridge Street Canoga Park CA EUA REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR:

7 REVISÕES Revisão Descrição da Alteração Data 00 Elaboração 10/ Formatação, revisão geral do texto e alteração de Responsável Técnica 11/ Alteração do DDG 09/ Revisão gramatical e ortográfica, formatação, alteração de Responsável Técnica 12/2012 7