ESTUDO DA INTERAÇÃO DE QUITOSANA EXTENSIVAMENTE DESACETILADA COM MODELOS DE MEMBRANA CELULAR

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1 ESTUDO DA INTERAÇÃO DE QUITOSANA EXTENSIVAMENTE DESACETILADA COM MODELOS DE MEMBRANA CELULAR Adriana Pavinatto 1 *, Jorge A. de M. Delezuk 1, Bruna R. Moreira 1, Felippe J. Pavinatto 1, Sérgio P. Campana- Filho 1, Osvaldo N. de Oliveira Jr. 1 1 Universidade de São Paulo USP Campus de São Carlos, São Carlos-SP *adriana@ursa.ifsc.usp.br Resumo Quitosana extensivamente desacetilada ( 5,6%) foi produzida através da desacetilação de beta-quitina assistida por ultra-som de alta intensidade, Processo DAIUS, [1]. Filmes de Langmuir do fosfolipídio ácido dimiristoil fosfatídico (DMPA), foram confeccionados a fim de mimetizar um modelo de membrana celular. Filmes mistos de quitosana e fosfolipídeos foram confeccionados com o objetivo de investigar a interação da quitosana extensivamente desacetilada sobre o modelo de membrana celular. Os filmes foram caracterizados por medidas de pressão de superfície e potencial de superfície. Os resultados obtidos evidenciam que a interação entre a quitosana extensivamente desacetilada e as monocamadas de DMPA difere daquelas observadas com quitosanas de grau médio de acetilação elevado. Palavras-chave: quitosana, filmes de Langmuir, ácido dimiristoil fosfatídico. Study of interaction between extensive deacetylated chitosan with cell membrane model Abstract Extensive deacetylated chitosan ( 5.6%) was produced by applying the ultrasound-assisted deacetylation process, USAD Process, to beta-chitin [1]. Langmuir films of phospholipid dimirystoyl phosphatidic acid (DMPA) were fabricated to mimic a cell membrane model. Films of chitosan and phospholipids were prepared to study the interactions occurring on cell membrane models. The films were characterized by surface pressure and surface potential measurements. The results showed that the interaction between extensively deacetylated chitosan and DMPA monolayers differ those observed to chitosan with medium degree of high acetylation. Keywords: chitosan, Langmuir films, dimirystoyl phosphatidic acid. Introdução A quitosana é um polissacarídeo derivado de quitina, polissacarídeo presente em carapaças e exoesqueletos de crustáceos e moluscos, como camarões e lulas, e também nas paredes celulares de alguns fungos. Enquanto a quitina é formada majoritariamente por unidades 2-acetamido-2-desoxi- D-glicopiranose (GlcNAc) unidas por ligações glicosídicas β(1 4), a quitosana é composta predominantemente por unidades 2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose (GlcN) unidas pelo mesmo tipo de ligação [2]. Assim, quitina e quitosana diferem quanto a quantidade de unidades GlcNAc e GlcN, sendo o grau médio de acetilação ( GA ), definido como o teor médio de unidades GlcNAc por cadeia polimérica, o parâmetro estrutural usado para diferenciar esses polímeros. Além disso, quitina e quitosana diferem quanto à solubilidade, sendo a quitosana solúvel em meios aquosos

2 moderadamente ácidos, enquanto quitina é solúvel apenas em uns poucos sistemas solventes binários. Monocamadas de Langmuir são formadas quando soluções de um material anfifílico são espalhadas na interface ar-água, dando origem a um filme de espessura monomolecular [3]. Tais filmes são preparados em cubas de Langmuir, que são compartimentos que permitem, através do fechamento de barreiras móveis, a variação da área ocupada pelo filme (compressão). Essa diminuição de área está associada à variação do grau de compactação da monocamada, o que permite que propriedades do filme possam ser estudadas por diversas técnicas para vários estágios da compressão. Entre as técnicas para caracterização de monocamadas, as mais empregadas são as medidas de pressão (π) e potencial ( V) de superfície. A pressão de superfície (π) é medida pela diminuição da tensão superficial da subfase aquosa devido à presença do filme, ou seja: π = γ - γ o, onde γ é a tensão superficial com a presença do tensoativo, e γ o é a tensão superficial da água pura. O potencial de superfície ( V) é o resultado da diferença de potencial entre a superfície e a subfase com ( V 2 ) e sem tensoativo ( V 1 ), ou seja, V = V 2 - V 1. A interface ar-água é naturalmente polarizada devido à orientação espontânea das moléculas de água nas proximidades da interface, com os átomos de oxigênio voltados em direção ao ar e os átomos de hidrogênio voltados para a água, originando uma diferença de potencial através da interface. Essa diferença de potencial varia com a presença da monocamada e depende da componente normal à interface do momento de dipolo médio das moléculas do filme, e também da reorientação e polarização das moléculas da subfase próximas à interface. Outras técnicas mais sofisticadas podem ser empregadas para caracterizar os filmes de Langmuir, incluindo microscopias e técnicas espectroscópicas. Uma curva característica de pressão-área, obtida para o ácido esteárico (um ácido graxo), é mostrada na figura 1. Os estados superficiais da monocamada podem ser analisados a partir do perfil da curva e interpretados de forma análoga aos estados tridimensionais da matéria (gasoso, líquido, sólido). A relação entre as regiões da isoterma de πxa com a compactação das moléculas do filme também é mostrada na figura 1.

3 pressão de superfície (mn/m) colapso Fase líquido-condensada (c) Fase líquido-expandida (b) Fase gasosa (a) área por molécula A 2 /mol Figura 1: Isoterma de π-a para o ácido esteárico, e ilustração da estruturação das moléculas no filme durante os diferentes estágios de compressão. ( ) = cabeça hidrofóbica e (І) cauda hidrofóbica. Além de ácidos graxos, fosfolipídios (principais componentes da membrana plasmática de células) são moléculas ideais para a formação de filmes de Langmuir. As monocamadas de Langmuir de fosfolipídios se assemelham muito a uma membrana celular e por esse motivo são extensivamente utilizadas como modelo para o estudo de interações de diversos tipos de peptídeos, fármacos e polímeros com biomembranas [4-6]. As interações podem ser estudadas no nível molecular, e nesse sentido, a ação da quitosana sobre membranas celulares, bem como os efeitos do polímero sobre a estruturação das membranas, pode ser avaliada [7-8]. Experimental Matéria-prima e extração de beta-quitina A beta-quitina foi extraída de gládios de lulas de duas espécies: Loligo sp. Os gládios foram lavados para remoção de resíduos de carne, enxaguados com água destilada, secos e então triturados em moinho de facas (Marconi MA-048). A fração correspondente a partículas com dimensões médias no intervalo mm (89% da massa triturada) foi utilizada na extração de betaquitina, conforme o procedimento descrito por [9]. Desacetilação de Beta-Quitina Assistida por Irradiação de Ultrassom de Alta Intensidade (Processo DAIUS) [1] A beta-quitina foi suspensa em solução aquosa de NaOH 40% na proporção 2:25 m/v e a suspensão foi transferida para um reator de vidro encamisado, que foi disposto no interior da caixa de isolamento acústico do equipamento de ultrassom (BRANSON Sonifier modelo 450, ν=20khz). O sonotrodo foi imerso na suspensão de beta-quitina, a qual foi submetida à irradiação intermitente

4 de ultrassom, sob agitação magnética constante. Foi obtida a amostra de quitosana, denominada 2IML, para qual a temperatura de reação foi mantida à 60ºC. Os parâmetros utilizados na reação de desacetilação de beta-quitina assistida por ultrassom de alta intensidade foram: reação isotérmica (I), amplitude de sonicação média (M), o tempo de sonicação longo (L) e o algarismo 2 indica que este reação foi realizada 2 vezes consecutivamente. A reação foi interrompida vertendo o meio reacional em béquer (contendo gelo moído) imerso em banho a - 10 C. A suspensão foi mantida a baixa temperatura enquanto HCl foi adicionado em pequenas porções até atingir ph 7.5; o sólido foi filtrado, extensivamente lavado com etanol 80% e seco, resultando em fibras solúveis em solução aquosa 1% de ácido acético. Caracterizações Um espectrômetro BOMEM MB-102 FTIR foi empregado para a aquisição dos espectros no infravermelho de beta-quitina e quitosana. As amostras foram trituradas com KBr (1:100 amostra/kbr), secas a 80,0 ºC e pressão reduzida durante 8h e então prensadas para resultar nas pastilhas empregadas para a aquisição dos espectros. Foram realizadas 48 varreduras com resolução de 4 cm -1. O valor de grau médio de acetilação ( GA ) da quitosana foi determinado por titrimetria realizada a 25.0 C±0.1 C usando um condutivímetro LF1 e bureta Titronic Universal, ambos da Schott-Geräte. O grau médio de acetilação ( GA ) de beta-quitina foi determinado por espectroscopia RMN 1 H como descrito na literatura [10]. O valor de viscosidade intrínseca ([η]) da quitosana foi determinado a 25,00 ± 0,01ºC com soluções do polímero em tampão ácido acético 0,3 M / acetato de sódio 0,2 M (ph 4.5) como descrito na literatura [11] Os valores de massa molar média viscosimétrica ( M empregando as constantes (K e a) determinados no mesmo solvente e temperatura [12]. v ) foram calculados Filmes de Langmuir como modelos de membrana celular Os filmes de Langmuir do fosfolipídio dimiristoil ácido fosfatídico (DMPA) (Avanti Polar lipids) foram confeccionados em uma cuba de Langmuir modelo KSV5000 da KSVInstruments (Finlândia). A cuba possui sensores de pressão (Wilhelmy) e potencial (Prova de Kelvin) de superfície acoplados. A água, com resistividade 18,2 mω.cm e ph 6, que serviu como subfase para os filmes, ou para a preparação de soluções tampão, foi fornecida por um sistema de purificação Milli-RO acoplado a um sistema Milli-Q (Millipore). Todo o trabalho foi realizado dentro de uma sala-limpa classe sob temperatura constante de 23 C. Para a confecção dos filmes de Langmuir foram espalhados 150 µl de uma solução do fosfolipídio 0,5 mg/ml em clorofórmio,

5 sobre a subfase de tampão Theorell, ph em torno de 3,5, contendo as amostras 2IML e IAC solubilizado, em concentrações entre 0,05 e 0,300 mg/ml. Resultados e Discussão A comparação dos espectros no infravermelho de beta-quitina e da amostra 2IML revela que as principais bandas (Figura 2) ocorrem nos intervalos de cm -1 (deformações axiais de O- H e N-H), cm -1 (deformações axiais de C-H), cm -1 (deformações axiais de C=O e angulares de N-H), cm -1 (deformações angulares de C-H), cm -1 (deformação axial de CN), cm -1 (deformação axial de O-H em ligação hidrogênio) e cm -1 (deformação angular de C-O). As bandas de amida I (1657 cm -1 ), amida II (1560 cm -1 ) e amida III (1315 cm -1 ), e também a banda devido à deformação angular de C-H metílico (1380 cm -1 ), são mais intensas e bem definidas no espectro de beta-quitina do que naquele da amostra 2IML (Figura 2). Essas bandas são atribuídas à presença de grupos acetamido, mais abundantes na beta-quitina ( GA =81%) do que nas cadeias de quitosana 2IML (GA =5,6%). Transmitância β-quitina 2IML Número de Onda (cm -1 ) Figura 2: Espectros no infravermelho de beta-quitina e das quitosanas 2IML no intervalo cm -1. O emprego do processo DAIUS resultou em uma quitosana extensivamente desacetilada e de elevada massa molar média viscosimétrica. Os valores da massa molar média viscosimétrica ( M v ) e do grau médio de acetilação ( GA ) para a amostra 2IML estão inseridos na tabela 01.

6 Tabela 01 Valores da massa molar média viscosimétrica e do grau médio de acetilação para a amostra de quitosana 2IML. a- determinado por titrimetria. Amostra GA (%) a M v b- determinada por viscosimetria. (g/mol) b 2IML 5, Isotermas de pressão de superfície de filmes mistos de fosfolipídio e várias concentrações de 2IML estão mostradas na figura Pressão de Superfície (mn/m) DMPA 0,05 mg/ml de 2IML 0,075 mg/ml de 2IML 0,100 mg/ml de 2IML 0,200 mg/ml de 2IML 0,300 mg/ml de 2IML Área molecular média (A 2 ) Figura 3: Filmes de Langmuir mistos de DMPA com várias concentrações de 2IML na subfase As curvas de pressão de superfície demonstram que 2IML interage com as monocamadas de DMPA, provocando mudanças no comportamento das isotermas. As curvas são deslocandas para áreas moleculares médias menores, quando comparada com a isoterma do fosfolipídio puro, o deslocamento é mais acentuado conforme a concentração de quitosana é aumentada. As interações do polímero com as monocamadas lipídicas causam condensação destas, devido provavelmente as interações eletrostáticas entre os grupos amino protonados da quitosana extensivamente desacetilada e, portanto com maior número de grupamentos amino em sua estrutura, passíveis de protonação, e a cabeça polar fosfatídica de DMPA. Conclusões Através da desacetilação de beta-quitina assistida por irradiação de ultrassom de alta intensidade (Processo DAIUS), foi obtida a amostra de quitosana extensivamente desacetilada (GA=5,6%), a qual foi utilizada na confecção dos filmes de Langmuir de DMPA mistos com dimiristoil ácido fosfatídico (DMPA). A interação observada entre quitosana extensivamente

7 desacetilada e as monocamadas de DMPA difere daquelas observadas com quitosanas com valores de grau médio de acetilação elevados [8], evidenciando que os grupos acetamida nas cadeias de quitosana têm papel importante na sua interação com biomembranas. Agradecimentos Os autores agradecem à CAPES, CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro e a Miami Pescados pelo fornecimento dos gládios de lulas. Referências Bibliográficas 1. USP. IQSC. S. P. Campana-Filho. BR. Patente, Protocolo nº , 4 maio G.A.F.Roberts; Em Chitin Chemistry, 1992, Mc Millan Press Ltd, London, UK. 3. I. Langmuir; J. Amer. Chem. Soc. 1917, H. Brockman; Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, R. Maget-Dana; Biochimica et Biophysica Acta, 1999, 1462, G. Brezesinski; Advances in Colloid and Interface Science, 2003, F.J. Pavinatto; Biomacromolecules, 2007, 8, F.J. Pavinatto; Langmuir, 2007, 23, G. Chaussard; A. Domard Biomacromolecules 2004, 5, M. B. Cardoso; R. Signini; S. P. Campana Filho Polym. Bull. 2001, 47, M. Rinaudo; M. Milas; P. Le Dung Int. J. Biol. Macromol. 1993, 15, K. S. Suslick; D. A. Hammerton; R. E. Cline Junior J. Amer. Chem. Soc. 1986, 108, 5641.