E SE UM BLOOM DE CIANOBACTÉRIAS TE BATESSE À PORTA?

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1 E SE UM BLOOM DE CIANOBACTÉRIAS TE BATESSE À PORTA? 1. INFORMAÇÃO DE APOIO As cianobactérias são organismos procarióticos fotossintéticos adaptados a uma vasta gama de condições ambientais e tolerantes a inúmeras situações de stress. Nos ecossistemas aquáticos fazem parte não só da comunidade fitoplanctónica mas também da comunidade bentónica que coloniza as margens. Dependendo das condições ambientais, a dinâmica destes organismos pode resultar no seu desenvolvimento em elevadas densidades, sendo este fenómeno descrito como florescência ou bloom. O aumento da carga de nutrientes em resultado das actividades humanas tem sido apontado como uma das causas para o desenvolvimento de blooms. Nos últimos anos, os blooms de cianobactérias têm sido um fenómeno cada vez mais descrito quer em termos de frequência, intensidade e distribuição geográfica e tem-se concluído por estudos recentes que a sua proliferação generalizada está também relacionada com as alterações climáticas. As cianobactérias proliferam a elevadas temperaturas, especialmente em águas ricas em nutrientes. O aquecimento global cria condições favoráveis para o seu desenvolvimento uma vez que estes organismos parecem responder melhor ao aumento da temperatura que a maior parte das outras espécies algais. O estudo das cianobactérias tem-se revelado de extrema importância uma vez que estes organismos produzem compostos tóxicos com efeitos severos a nível do sistema nervoso e a nível de órgãos como o fígado e o intestino. Em vários países foram descritos casos de morte de animais selvagens e domésticos por consumo de água contaminada com toxinas de cianobactérias e casos de dermatites, diarreias e reacções alérgicas em humanos após contacto com água contaminada em locais usados para fins recreativos. Assim, o desenvolvimento de cianobactérias tem sido considerado uma ameaça não só em termos de equilíbrio dos ecossistemas mas também em termos de saúde pública. Além da capacidade de produzirem compostos tóxicos os blooms de cianobactérias, assim como o de qualquer outro grupo fitoplanctónico, traz consequências nefastas para o ecossistema uma vez que a acumulação de grandes densidades fitoplanctónicas à superfície da água leva a uma perda da transparência, impede a penetração da luz nas camadas inferiores e leva à exaustão dos nutrientes. O declínio de uma florescência é por sua vez acompanhado de um aumento da degradação da matéria orgânica com consequente gasto do oxigénio dissolvido e acumulação de compostos tóxicos como a amónia. A depleção de oxigénio na água é muitas vezes acompanhada por mortandades de peixes e outra fauna aquática. A Ecotoxicologia é uma ciência que se baseia na realização de experiências e que utiliza variadíssimos organismos como modelos. Para além da avaliação dos efeitos dos tóxicos nos organismos dos ecossistemas, usa também o pressuposto de que os efeitos adversos causados nos vários organismos e no Homem podem ser semelhantes. Esta extrapolação da toxicidade tem que ser no entanto muito cautelosa. Actualmente em estudos toxicológicos, existem muitas alternativas aos ensaios com mamíferos entre os quais se destacam a utilização de testes com algas do

2 fitoplâncton, invertebrados do zooplâncton, bactérias, peixes, até estudos in vitro em que se estudam os efeitos da toxicidade usando linhas celulares. Dado o interesse que a problemática da ocorrência de blooms de cianobactérias tóxicas tem suscitado não só na comunidade científica e nas entidades responsáveis pela área da saúde pública como também no público em geral e no sentido de sensibilizar para as consequências da sua ocorrência, pretende-se com este trabalho experimental avaliar o potencial tóxico de uma estirpe de cianobactéria face a organismos de dois níveis tróficos de um ecossistema aquático. Propõem-se a avaliação da toxicidade de uma estirpe de cianobactéria face a outra microalga (produtor primário) e face a um organismo zooplanctónico (consumidor primário). A estirpe de cianobactéria escolhida pertence à espécie Microcystis aeruginosa uma vez que esta espécie se apresenta largamente difundida por todos os ecossistemas aquáticos, sendo apontada como produtora de vários tipos de toxinas. Dentro das toxinas produzidas, as de maior impacto são as microcistinas, cujo órgão alvo em mamíferos é o fígado, estando também descritos casos de intoxicações em peixes, aves e invertebrados. A espécie a trabalhar é produtora de microcistinas, nomeadamente da variante mais comum que é a microcistina LR. Este trabalho apresenta 3 etapas, que podem ser independentes em termos de execução: 1. Efectuar uma cultura laboratorial de uma estirpe de cianobactéria da espécie Microcystis aeruginosa com o objectivo de determinar a sua curva de crescimento. 2. Avaliar a toxicidade da cianobactéria num teste de toxicidade aguda com uma microalga verde: Inibição do crescimento de Chlorella vulgaris. 3. Avaliar a toxicidade da cianobactéria num ensaio com náuplios de um crustáceo zooplanctónico: Indução de mortalidade de náuplios de Artemia salina.

3 2. MATERIAIS A fornecer: Inóculo de Microcystis aeruginosa e Chlorella vulgaris; Concentrado e Extracto de Microcystis aeruginosa (para testes de toxicidade); Quistos de Artemia salina; Câmara de Neubauer; Meio de cultura Z8; Lugol; Pipetas Pasteur descartáveis; Outro necessário: Microscópio óptico; Lupa; Bomba aquário; Sal cozinha ou sais marinhos; Tubo plástico para arejamento; Placa poços 3ml / tubos de ensaio; Garrafa / frasco 1L e 5L; Frascos pequenos. 3. PREPARAÇÃO PRÉVIA MEIO DE CULTURA Z8 Um dos meios usados na cultura de microalgas é o meio Z8, composto por uma solução rica em azoto (solução A), uma solução rica em fósforo (solução B), uma solução de ferro (solução de Fe- EDTA) e uma solução de micronutrientes. 1. Esterilizar um recipiente de vidro de 5 litros de capacidade. Caso não seja possível, poderá utilizar um garrafão de plástico transparente bem lavado. 2. Adicionar 4 L de água destilada. 3. Verter o conteúdo total de cada um dos frascos (Sol. A, Sol. B, Sol. Fe-EDTA e Sol. Micronutrientes) na água. 4. Agitar bem. 5. Dos 4 L de meio Z8 retirar 1L para um Erlenmeyer esterilizado ou, não sendo possível esterilizar, bem lavado. Nos 3 L de meio restantes far-se-á a cultura de Microcystis aeruginosa. No recipiente com 1 L far-se-á a cultura de Chlorella vulgaris.

4 4. MÉTODO EXPERIMENTAL A. CULTURA LABORATORIAL DE CIANOBACTÉRIAS A. 1. Início da cultura a partir de cultura stock 1. Limpar a bancada e acender as lamparinas (todos os procedimentos devem ser realizados em condições de esterilidade de forma a evitar contaminações). 2. Retirar um pequeno volume (1 ou 2 ml) da cultura stock de Microcystis aeruginosa para um tubo de vidro para quantificação. Fixar as células com 1 ou 2 gotas de lugol. Este procedimento tem como finalidade imobilizar as células e torná-las mais pesadas sendo mais rápida a sua sedimentação. 3. Determinar a concentração celular através da contagem de células na câmara de Neubauer. 4. Colocar o resto do volume do stock nos 3 L de meio e recalcular a nova concentração inicial. 5. Tapar o recipiente com uma rolha estéril de algodão cardado e gaze na qual foi introduzido um tubo para arejamento. Identificar o recipiente com a cianobactéria usada, o meio de cultura e a data. 6. Ligar os tubos de arejamento a bombas de arejamento de modo que a cultura fique a borbulhar. 7. Registar a data de início da cultura, o volume do meio de cultura, a concentração inicial de microalgas, a temperatura, fotoperíodo e luminosidade (se possível). A. 2. Determinação da curva de crescimento de Microcystis aeruginosa 1 Anotar a concentração celular no dia do início da cultura. 2 De 24 em 24 horas retirar 1 a 2 ml de cultura e fixar com uma gota de lugol. Este procedimento permite, além de imobilizar as células, preservar a amostra para o caso de não ser quantificada de imediato. 3 Determinar a densidade celular em câmara de Neubauer. 4 Anotar numa tabela o número de cél /ml determinado em cada intervalo de tempo. 5 Fazer a curva de crescimento com a concentração celular (Cél/ml) em função do tempo (dias).

5 B. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DA CIANOBACTÉRIA NUM ENSAIO COM UMA ALGA VERDE CHLORELLA VULGARIS Os ensaios de toxicidade são realizados com organismos considerados representativos de um determinado nível trófico, fáceis de manter em laboratório e de manipular. As microalgas são utilizadas como representativas do primeiro nível trófico da cadeia alimentar de uma coluna de água. B. 1. Início da cultura a partir de cultura stock 1. Para a cultura de Chlorella vulgaris verter o conteúdo do stock em 1L de meio. 2. Tapar o recipiente com uma rolha estéril de algodão cardado e gaze na qual foi introduzido um tubo para arejamento. Identificar o recipiente com a alga usada, o meio de cultura e a data. 3. Ligar os tubos de arejamento a bombas de arejamento de modo que a cultura fique a borbulhar. 4. Registar a data de início da cultura, o volume do meio de cultura, a concentração inicial de microalgas, a temperatura, fotoperíodo e luminosidade (se possível). B. 2. Preparação do inóculo 1. Determinar a densidade celular da cultura de Chlorella vulgaris por quantificação na câmara de Neubauer. 2. Conhecida a concentração de células no inóculo fazer uma diluição com o fim de adicionar a cada poço 0,5 ml de inóculo e obter uma concentração inicial de 1*10 6 cél/ml. B. 3. Ensaio de toxicidade O objectivo do teste de toxicidade é determinar os efeitos tóxicos da estirpe de cianobactéria Microcystis aeruginosa que cultivas-te no crescimento da microalga Chlorella vulgaris. O crescimento das algas expostas ao extracto de cianobactéria é comparado com o crescimento das algas num controlo apropriado, neste caso no meio de cultura Z8, durante um período de 48 horas. Os testes de toxicidade deverão ser realizados em placas com poços de 3 ml de capacidade. Caso não seja possível, é possível realizar os testes em tubos de ensaio. Cada solução teste consistirá num volume de 2ml de extracto de cianobactéria e 0,5 ml de inóculo de Chlorella vulgaris perfazendo um volume total de 2,5 ml. Testar o extracto directo e diluído de 1:2 e 1:4 em meio Z8. Para cada solução realizar 3 réplicas (Fig. 1). Figura 1. Set experimental Teste de toxicidade em Chlorella.

6 1. Adicionar 40 ml de meio Z8 ao concentrado de Microcystis fornecido (valor da concentração inicial é fornecido). 2. Congelar e descongelar de modo a rebentar as células e libertar as toxinas. 3. Confirmar ao microscópio que as células rebentaram. Repetir o procedimento de congelar e descongelar até as células rebentarem. 4. Filtrar com papel de filtro. 5. Fazer diluições de 1:2 e 1:4 em meio Z8. 6. Em placas de poços de 3 ml adicionar 2 ml de cada solução a testar por poço, incluindo o controlo que consistirá em meio Z8. Realizar três réplicas de cada concentração e de controlo (Fig. 1) 7. Adicionar 0,5 ml do inóculo de algas preparado. A concentração final de algas em cada um dos poços será de 1*10 6 cél/ml. 8. Tapar as placas com a tampa e envolver em parafilme para evitar evaporação. 9. Incubar durante 48 horas em constante agitação. Se não se dispuser de um agitador automático agitar manualmente as placas três vezes por dia. A agitação contribui para promover o adequado desenvolvimento da população de algas. Análise de dados 1. Ao fim das 48 horas de exposição terminar o teste fixando as algas com 1 ou 2 gotas de solução de lugol. 2. Com uma pipeta injectar vária vezes ar em cada poço de forma de ressuspender bem as algas e a homogeneizar bem as soluções. 3. Determinar a concentração de algas em cada poço, por contagem do número de células em câmara de Neubauer (não esquecer de homogeneizar bem as soluções!!!!). 4. Calcular a percentagem de inibição (% I) para cada uma das concentrações. % I = 100 ((valor médio cél/ml das réplicas de cada diluição / valor médio cél/ml das réplicas do controlo)) x Construir um gráfico onde se representa a percentagem de inibição em função da concentração celular.

7 C. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DA CIANOBACTÉRIA NUM ENSAIO COM UM CRUSTÁCEO ARTEMIA SALINA. O objectivo deste teste é determinar a toxicidade de uma cultura da cianobactéria Microcyistis aeruginosa face a náuplios de Artemia salina. Neste caso é enviado um extracto seco da cianobactéria obtido por ruptura das células por ultra-sons e numa solução de 80% de metanol. C. 1. Obtenção dos naúplios de artémia 1. Deixar durante algumas horas 1 L de água da torneira a arejar de modo a que sejam removidos vestígios de cloro. 2. Adicionar à água os sais marinhos. Dissolver bem. 3. Colocar aproximadamente um grama de cistos de artémia em cerca de 800 ml da água marinha preparada. Manter a cerca de 25 ºC com iluminação contínua e arejamento durante 24 horas. 4. Após 24 horas separar os naúplios com uma pipeta para nova água do mar. 5. Num pequeno copo concentrar ao máximo os náuplios. C. 2. Ensaio de toxicidade Teste de toxicidade 1. Ressuspender o extracto de Microcystis enviado em 12 ml da água do mar preparada. Agitar vigorosamente. Fazer diluições de 1:2 e 1:4 com a água do mar preparada. 2. Em cada poço e em triplicado adicionar 2 ml de cada solução a testar (Fig. 2). 3. Adicionar a cada poço 0,5 ml de suspensão de modo a introduzir organismos por poço. Figura 2. Set experimental Teste de toxicidade em Artemia. 4. Vedar as placas com parafilme para evitar evaporação, envolver em papel de alumínio e deixar incubar a 25 ºC. 5. Ao fim de 24 horas contar o número de artémias mortas em cada poço. As larvas são consideradas mortas se não for registado qualquer movimento num período de 30s. 6. Voltar a tapar as placas e deixar por mais 24 horas. 7. Ao fim de 48 horas contar o número de artémias mortas em cada poço.

8 8. No final das contagens fixar com lugol e contar o número total de larvas por poço. 9. Calcular a percentagem de artémias mortas em cada poço. Para cada concentração calcular a média e o desvio padrão. 10. Representar graficamente a percentagem de mortalidade em função da concentração.