PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS FORENSES

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1 PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS FORENSES NOVO SISTEMA AUTOMATIZADO DE GENOTIPAGEM DE STRS E SNPS POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS Daniel Amaro Sousa 1 Luciano Chaves Arantes 2 1 Licenciado em Ciências Biológicas pela Universidade Católica de Brasília, Mestre em Patologia Molecular pela Universidade de Brasília e aluno da Pós- Graduação em Biociências Forenses pela Pontifícia Universidade Católica de Goiás/IFAR. 2 Orientador: Bacharel e Licenciado em Ciências Biológicas pela Universidade de Brasília; Mestre em Ciência Forense pelo King's College London, Inglaterra; Mestre em Patologia Molecular pela Universidade de Brasília, Mestrando em Administração com Ênfase em Criminalística pela Escola Brasileira de Administração Pública e Empresas/Fundação Getúlio Vargas (FGV/EBAPE). Perito Criminal classe Especial da Polícia Civil do Distrito Federal e Chefe da Seção de Perícias Criminais do Instituto de Pesquisa de DNA Forense. Professor de especialização em Biociências Forenses IFAR/PUC. RESUMO A determinação da massa molecular de uma sequência de DNA, por meio da pesagem por espectrometria de massas, possui muitos benefícios, principalmente no campo forense. Dentre eles, pode se citar o fato de que variações de sequência observadas podem aumentar o poder de discriminação dos testes comparado às análises convencionais. Além disto, por meio desta técnica pode se trabalhar com os mesmos marcadores usados convencionalmente em técnicas forenses, o que facilita a implantação do método. A espectrometria de massa aplicada ao DNA possui muitas vantagens sobre a eletroforese capilar com fluorescência, sendo mais rápida e barata e não necessita de marcadores internos ou calibração espectral. Esta revisão de literatura tem por objetivo apresentar o mais novo sistema comercial para análise de DNA baseado em espectrometria de massas, o PLEX- ID, contribuindo assim para divulgação em língua portuguesa desta nova tecnologia. PALAVRAS-CHAVES: Análise de DNA. STRs. SNPs. Espectrometria de Massas. PLEX-ID. NEW AUTOMATED GENOTYPING OF STRS AND SNPS BY MASS SPECTROMETRY ABSTRACT The molecular weight determination of DNA sequences, weighting by mass spectrometry, has many benefits, especially in the forensics fields. Among them, may be mentioned the fact that observation of single sequence variations may increase the discriminatory power of the tests, compared to conventional analyzes. Moreover, this technique can work with the same genes conventionally used in forensics, which facilitates implementing the method. Mass spectrometry applied to the DNA has many advantages over the fluorescent capillary electrophoresis, being quicker and cheaper, does not require internal markers or spectral calibration. This literature review aims to present the newest system for DNA analysis based on mass spectrometry, the PLEX-ID, thereby contributing to dissemination in the Portuguese language of this new technology. KEY-WORDS: DNA Analysis. STRs. SNPs. Mass Spectrometry. PLEX-ID.

2 1 INTRODUÇÃO Um dos marcos iniciais na descoberta do DNA foi em 1869, quando o médico suíço Frederich Miescher isolou o principal componente do núcleo das células, denominado então nucleína (DAHM, 2008). Gradualmente foram sendo realizadas várias descobertas quanto à estrutura, forma e funções desta molécula, até que em 1953, James D. Watson e Francis Crick compilaram todas em um único modelo, sugerindo assim a estrutura geral do DNA (WATSON et al., 1953), formada por ácidos nucléicos pareados em uma dupla fita. Em 1957, durante uma apresentação, Crick estabeleceu o dogma central da biologia molecular, descrevendo assim a relação entre DNA, RNA e proteínas. Contudo, somente em 1985, Sir. Alec Jeffreys, um geneticista inglês, criou a ideia do DNA fingerprinting (impressão digital de DNA), ao observar que amostras de DNA possuíam sequências de marcadores adjacentes que se repetiam diversas vezes, os VNTRs (Variable number of tandem repeats) (JEFFREYS et al., 1985). O DNA fingerprinting utiliza polimorfismos observados nas regiões não codificantes que variam entre indivíduos (MCNAMARA-SCHROEDER et al., 2006). Este tipo de análise de DNA só foi possível devido a técnica desenvolvida por Jeffreys que usava enzimas de restrição que hidrolisavam o DNA em regiões flanqueadoras dos VNTRs. O conjunto de número de repetições para diferentes fragmentos parecia ser único para cada indivíduo, desta forma, possibilita ser aplicado na identificação humana (ZAGORSKI, 2006). Tão logo o primeiro artigo sobre o tema foi publicado no periódico Nature em 1985, a técnica de Jeffreys foi colocada a teste em um caso jurídico de investigação de parentesco. Um jovem que voltava de Gana para Inglaterra foi acusado de portar um passaporte falso, que pertencia a um filho de um casal ganense que eram cidadãos ingleses. O teste de DNA confirmou com sucesso que realmente o jovem era filho do casal, resolvendo este problema de imigração (WATSON, 2005). Entre 1986 e 1988, dois crimes correlacionados foram resolvidos com ajuda da análise de DNA estupros seguidos de morte contra duas adolescentes de 15 anos de idade. As análises de DNA das amostras de sêmen coletadas nas duas vítimas indicaram que um mesmo homem havia cometido os dois crimes. Um

3 suspeito confessou ter sido o autor do segundo, mas não do primeiro crime, entretanto seu perfil genético não correspondia ao das amostras de sêmen. Richard Buckland tornou-se, assim, a primeira pessoa inocentada pela análise de DNA (ARONSON, 2005). Após dois anos de busca pelo autor dos crimes, nos quais aproximadamente moradores doarem amostras de sangue ou saliva, Colin Pitchfork foi preso e condenado pelos estupros e homicídios (ZAGORSKI, 2006). Estes e vários outros casos de sucesso fizeram da tipagem do DNA uma técnica amplamente difundida, permitindo a análise de evidências em cenas de crime e testes de vínculo genético. O número de exames genéticos conduzidos aumenta a cada ano, e cria uma demanda por testes rápidos e baratos, porém com alto índice de precisão e confiabilidade. Diversos fabricantes têm apresentado certas alternativas, com diferentes metodologias de execução (HOUCK, 2006). Os polimorfismos do DNA podem ser analisados após purificação simples seguida por fragmentação com enzimas de restrição, porém como são geralmente encontrados em baixa quantidade, é necessário que os fragmentos de interesse sejam amplificados, por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). Após este passo, os fragmentos identificados com marcadores fluorescentes, são separados com base no seu tamanho, seja por uma malha sólida de agarose ou por capilares, e comparados com marcadores para gerar um perfil genético (ANDRADE, 2008). Este trabalho busca demonstrar um dos mais recentes avanços na área, o sistema de análises PLEX-ID, que identifica fragmentos com alta precisão por espectrometria de massas, baseando-se na massa observada da molécula DNA. Devido a sua alta sensibilidade, esta técnica permite não somente a análise dos SRTs, mas também de mutações em um único nucleotídeo (SNPs) de forma rápida, o que permite uma análise muito mais acurada, gerando um laudo mais preciso e confiável (SOBRINO et al., 2005; OBERACHER et al., 2007). Busca-se também com este trabalho comparar esta técnica a outros métodos presentes no mercado.

4 2 METODOLOGIA Trata de uma revisão de literatura baseada em trabalhos científicos que trataram do tema em questão, preferencialmente publicados a menos de 10 anos. Parte do material foi pesquisada em sites de busca tais como: Scielo, Google Acadêmico, Science Direct, Web of Science e PubMed., buscando artigos principalmente publicados entre 2002 e As palavras chaves utilizadas foram: History of Forensic DNA, DNA Fingerprint, Plex-ID, Mass spectrometry analysis of DNA. Outra parte do material utilizado foi obtida por meio da busca livre em internet dos manuais e guias dos equipamentos e técnicas utilizadas e vídeos. 3 DISCUSSÃO 3.1 Análise de perfis de DNA Desde o início das aplicações do DNA forense, por volta dos anos 80, é observado um aumento na sensibilidade e poder de discriminação destes testes. Em conjunto, foi observada uma redução do tamanho dos fragmentos de DNA passíveis de serem analisados, possibilitando assim a apreciação de amostras em alto grau de degradação, que são encontrados com frequências em análises forenses (SENGE et al., 2011). O principal método para análise do DNA mencionado é a análise de repetições curtas em paralelo ou STRs (short tandem repeats). Estes fragmentos ocorrem em regiões não codantes em padrões envolvendo repetições de 2 a 5 pares de bases diretamente adjacentes. Os STRs variam em número de repetições, que podem ser analisadas criando o perfil genético de um indivíduo (CARRACEDO, 2007). Dentre as características que contribuem para aplicação dos STRs na prática forense, pode se destacar o alto grau de polimorfismo em humanos e o tamanho relativamente pequeno dos amplicons - de 100 a 400 pares de bases (pb)- o que

5 facilita a amplificação dos fragmentos e a possibilidade de se realizar reações em multiplex, permitindo a análise de vários STRs simultaneamente (OBERACHER et al., 2007). Outro fator relevante para o estabelecimento da análise de STRs foi o desenvolvimento de nomenclaturas internacionais amplamente usadas, permitindo a comparação direta entre banco de dados de diferentes serviços de inteligência presentes em vários países (OBERACHER et al., 2007). Um conjunto de loci foi estabelecido para análise dos STRs, sendo os mais usados exemplificados na figura 1. Figura 1. Principais STRs e seus respectivos locus cromossomais (Adaptado de A tipagem de STRs geralmente é realizada pela amplificação por PCR dos STRs e medição dos fragmentos. Um dos primeiros tipos de análise destes marcadores era realizado em gel por meio da comparação com os tempos de migração de marcadores alélicos. Esta técnica foi aos poucos sendo substituída pela eletroforese capilar (BUTLER, 2007). A eletroforese capilar com detecção multicor de fluorescência é o método mais usado para tipagem de STRs, oferecendo a resolução de um par de bases

6 para discriminação dos alelos. Além de poder medir o comprimento dos alelos de PCR amplificados, esta técnica pode ainda oferecer outras informações, a exemplo de variações de um único nucleotídeo que podem ocorrem diferentemente entre perfis avaliados (BUTLER et al., 2004). Os STRs podem ser classificados como simples, quando encontradas repetições com apenas unidades idênticas quanto à sequência e comprimento (Ex. GAGT n ); compostos, quando apresentam repetições que contém 2 ou mais repetições simples adjacentes (GAGT n TATA n ); e complexos, quando apresentam repetições que contém muitos blocos de unidades repetidos espaçados por sequências intervenientes que variam mais ou menos em comprimento (Ex. GAGT n AAGAGT n TAGAGT n ) (URQUHART et al., 1994). Apesar de disponibilizar informações mais completas, é pouco provável que o sequenciamento dos STRs, para identificação de polimorfismos, substitua a análise convencional do tamanho dos fragmentos, principalmente devido à grande disponibilidade e baixo custo da última. Porém, estudos recentes indicam que é possível analisar também a presença de SNPs (polimorfismos de um único nucleotídeo), sem que seja necessário o sequenciamento dos fragmentos (OBERACHER et al., 2007). Os SNPs são variação de um único nucleotídeo que ocorrem em média a cada centena de bases do genoma humano, e que podem ser encontradas também nos STRs. Eles parecem corresponder a 85% dos polimorfismos observados no DNA. Muitos loci de SNPs já foram caracterizados, e existe um grande número de estudos relacionados a variações em diferentes populações humanas (BUTLER et al., 2007). Dentre as vantagens da aplicação dos SNPs na identificação, pode se citar o fato de que os mesmos podem ser encontrados em amostras de DNA com maior grau degradação, uma vez que a região alvo é menor. Outra grande vantagem dos SNPs refere-se ao fato de que a taxa de mutação deste tipo de polimorfismo é aproximadamente vezes menor que para os STRs. Por fim, a análise de SNPs de determinados genes pode ser útil no futuro para determinação de características físicas e éticas de indivíduos (BUTLER et al., 2007).

7 Dentre as desvantagens, pode se citar o baixo poder de discriminação por alelo, uma vez que os SNPs são pouco polimórficos. É observada também uma diminuição do poder de discriminação dos SNPs quando encontrados em misturas, devido ao número limitado de alelos. Finalmente, o número de plataformas comerciais disponíveis para análise de SNPs ainda é pequeno. A tabela 1 compara as principais características dos STRs e SNPs (BUTLER et al., 2007; GLOVER et al., 2010) Tabela 1. Características dos SNPs e STRs em relação à prática forense. Adaptada de Oberacher, Característica STR SNP Análise de DNA degradado Prejudicada Favorecida Poder de discriminação por alelo Alto Baixo Detecção em misturas Alta Baixa Determinação de características físicas e étnicas Baixa ou nula Alta Taxa de mutação Plataformas comerciais disponíveis para análise Muitas Poucas 3.2 Princípios gerais de espectrometria de massas Antes de discutir sobre o potencial da técnica de espectrometria de massas na genotipagem de DNA, faz-se necessária uma melhor compreensão dos princípios no qual esta técnica se baseia. A espectrometria de massas é uma técnica analítica que mede a relação massa/carga de partículas carregadas. Por meio da espectrometria de massas é possível determinar a composição elemental de uma amostra ou molécula. Um espectrômetro de massa geralmente é composto por: uma fonte de íons, que converte os analitos em íons; um analisador de massa, que separa os íons por campos eletromagnéticos; e um detector, que detecta o valor relativo de cada íon (EL-ANEED, 2009). Muitos espectros de massa são acoplados a sistemas cromatográficos, que possibilitam a separação dos componentes antes da análise, gerando melhores resultados (HALL et al., 2005). A figura 2 ilustra as configurações necessárias para caracterização de ácidos nucléicos.

8 O sistema de análise é constituído geralmente por duas partes, a cromatográfica e a de espectrometria de massas. A parte cromatográfica possui uma bomba que controla o fluxo e pressão do equipamento, um amostrador e uma coluna acoplada a um termostato, que quando necessário, aumenta a temperatura da coluna (65 75 C), desnaturando o DNA e possibilitando a análise individual das fitas complementares (OBERACHER et al., 2007). Figura 2. Esquema geral de um sistema de cromatografia líquida acoplado a espectrometria de massas para análise de moléculas de DNA. (1) Bomba, (2) Reservatório de solventes, (3) Degaseificador, (4) Separador em T, (5) Capilar restritor, (6) Amostrador automático (7) Injetor (8) Agulha, (9) Dispensador, (10) Termostato da coluna, (11) Coluna de capilar monolítica, (12) Espectro de massa do tipo quadrupolo/quadrupolo/tof, (13) Fonte de ionização de eletrospray, (14) Entrada de gás, (15) Barras quadrupolo, (16) Sistema de vácuo, (17) Célula de colisão, (18) Pusher (Empurrador), (19) Reflectron, (20) Detector. Adaptado de Oberacher (2007). Este sistema cromatográfico possibilita ainda a dessalinização dos ácidos nucléicos antes da análise, aumentando a qualidade do espectro gerado e os limites de detecção. O eluente usado para remover os ácidos nucléicos da coluna confere ainda a essas moléculas o estado ionizado, devido a sua grande força iônica. Por fim, uma agulha de electrospray cria um fino aerossol que adentra na entrada de gás do espectrômetro (OBERACHER et al., 2007). O segundo componente do equipamento, consiste em um espectrômetro de massa com analisador do tipo tempo-de-voo (time-of-flight,tof). A análise de TOF acontece quando os íons gerados no electrospray são acelerados por um campo elétrico de força conhecida. A energia cinética dos mesmos é medida ao se analisar o tempo que a partícula ionizada leva para alcançar o detector. Partículas com menor carga são mais lentas, assim como partículas de maior massa. A partir de

9 parâmetros experimentais, é possível encontrar a razão massa/carga para cada íon analisado (VESTAL et al., 2005). O TOF é tipo de analisador mais comum usado em análises de DNA. Devido a sua alta sensibilidade, pode ser usada para detectar e discriminar moléculas com até 250 nucleotídeos. (VESTAL et al., 2005). 3.3 Análise de genótipos por espectrometria de massas Uma das formas recentemente desenvolvidas para análise de SNPs sem a necessidade de sequenciamento, incluindo os presentes em STRs, é a genotipagem por espectrometria de massas (HALL et al., 2005). A figura 2 ilustra o fluxo de trabalho aplicado durante a análise de genótipos por espectrometria de massas. Figura 3. Esquema representando a análise de genótipos por espectrometria de massas. Primeiramente é feita uma busca em um banco de dados, que possibilita, por meio das sequencias encontradas, desenhar iniciadores, necessários ao preparo da PCR. Em seguida os fragmentos amplificados são analisados por espectrometria de massa (MS), onde é medida a relação massa/ carga dos fragmentos. Os dados gerados serão então tratados com um programa adequado e as sequencias serão determinadas. Com a impossibilidade de resolução da sequencia pela massa adquirida, a espectrometria em sequencia (MS/MS) é realizada seguidamente, onde os fragmentos são ionizados e selecionados por sua relação massa carga e depois medidos. (Fonte: Autoria Própria)

10 A análise do DNA começa com o preparo da amostra a ser processada. Inicialmente, é realizada uma busca no banco em bancos de dados dos genótipos que se busca estudar, elencando assim os iniciadores (primers) a serem utilizados (OBERACHER et al., 2007). Em seguida, a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) é utilizada para amplificar os fragmentos. Avaliando corretamente o tamanho dos genes, para evitar sobreposição de tamanho, é possível que testes multiplex sejam desenhados, ou seja, várias sequências podem ser amplificadas em uma mesma reação (OBERACHER et al., 2007). Após um determinado número de ciclos, os produtos de PCR são desalinizados, desnaturados e então analisados quanto ao seu tamanho por espectrometria de massas (MS). Em seguida compara se o valor de massa observado com o valor teórico calculado para cada sequência (OBERACHER et al., 2007). A diferença de massa, quando observada, indica variação de sequência, que pode estar tanto relacionada a variações no comprimento dos alelos como variações de nucleotídeos únicos. Vale lembrar que, por esta técnica, o exato da alteração da sequência não é avaliado. Quando requerido, cliva-se a sequência de DNA em fragmentos específicos, que são novamente analisados (MS/MS), permitindo assim a reconstrução da sequência de ácidos nucléicos (OBERACHER et al., 2002). Devido ao seu grande potencial, a identificação de genótipos por espectrometria de massas pode ser usada com sucesso para identificação de SNPs em STRs, aumentando assim consideravelmente seu poder de discriminação. Esta técnica também é aplicável à análise de DNA mitocondrial (mtdna), que apresenta a maior parte de suas variações na forma de SNPs. A análise de mtdna, que por seu maior grau de estabilidade se apresenta em alguns casos como única fonte de comparação, é muito favorecida pelo uso da espectrometria de massas, que parece ser mais rápida e apresentar menor custo do que o método de análise convencional por sequenciamento (HALL et al., 2005; PETKOVSKI et al., 2005).

11 3.4 O sistema PLEX-ID : identificação humana por STRs e SNPs O sistema PLEX-ID foi inicialmente desenvolvido com o nome de Ibis T5000 pela empresa Ibis Biosciences, que foi adquirida pela Abbott em O equipamento foi criado com o intuito de detectar e caracterizar microrganismos de forma rápida (SAMPATH, 2011). O sistema PLEX-ID é constituído basicamente por um dessalinizador acoplado a um espectrômetro de massas (Figura 4). Figura 4. O sistema PLEX-ID. A) Vista externa da plataforma. B) Esquema interno do aparelho, com ênfase nos principais componentes. Após a amplificação, os produtos de PCR, sintetizados externamente em placas de 15 a 96 poços, são inseridos no equipamento, identificados por código de barras e passam por um carrossel de dessalinização para retirada de contaminantes. A amostra segue então diretamente para um electrospray (ESI) acoplado a um espectrômetro de massa do tipo TOF (BIOSCIENCES, 2011). Todos os comandos do aparelho são controlados por uma tela sensível ao toque. O sistema PLEX-ID possui ainda uma fonte de alimentação ininterrupta (nobreak) de série, para proteger o equipamento de oscilações no fornecimento de energia (BIOSCIENCES, 2011). Outra característica importante do equipamento são seus programas de operação. Eles permitem tanto controlar o equipamento quanto analisar os resultados obtidos (BIOSCIENCES, 2011).

12 O PLEX-ID pode ser usado para análise de STRs, com um kit vendido pela própria fabricante que usa os loci internacionalmente reconhecidos do CODIS. O kit é composto de placas contendo todos os componentes necessários para amplificação dos fragmentos. Como alguns loci possuem tamanho semelhante, eles são separados na placa, de forma que oito poços são usados para avaliação de quatorze genótipos (BIOSCIENCES, 2011). O modelo de configuração desta placa de análise encontra-se na figura 5. Figura 5. Esquema de uma placa do teste de STRs PLEX-ID. Este método usa os loci padrão do CODIS, além do locus da amelogenina. Em cada uma das dez primeiras colunas pode-se analisar uma amostra, enquanto que as duas últimas colunas são reservadas para os controles negativos e positivos. Adaptada do manual PLEX-ID STR CODIS Loci v2.0 Assay. Durante a análise de STRs, a precisão de dados gerada suporta o estudo de SNPs nos loci, aumentando consideravelmente o poder de discriminação de cada locus (BIOSCIENCES, 2011). 3.5 Aplicações em tipagens de mtdna A análise do DNA mitocondrial (mtdna) é útil na prática forense devido a duas propriedades inerentes. A primeira se relaciona ao fato de que o genoma mitocondrial é altamente polimórfico, sendo assim útil na identificação humana. O mtdna apresenta duas regiões altamente variáveis, HV1 e HV2, que quando necessário são amplificadas e sequenciadas, permitindo assim a criação de perfis de mtdna (NILSSON et al., 2008).

13 A segunda propriedade está relacionada ao grande o número de cópias que existem em cada célula, apesar de o mtdna compor apenas 1% do DNA total. Devido a esta característica, o mtdna é encontrado com frequência em estado analisável em amostras altamente degradadas, por vezes aparecendo como único marcador disponível em vestígios de ossos, dentes e pelos (NILSSON et al., 2008). Como citado anteriormente, durante a análise do mtdna as regiões hipervariáveis são usualmente amplificadas por PCR e sequenciadas por eletroforese capilar. O sequenciamento, porém é caro e trabalhoso. O sistema PLEX-ID permite a análise, por meio da amplificação e espectrometria de massas, destas regiões hipervariáveis, identificando prontamente mutações úteis para diferenciação de indivíduos (BIOSCIENCES, 2011). Além disto, o sistema PLEX-ID também é útil na análise de casos de heteroplasmia, onde um indivíduo apresenta mais de um tipo de mtdna, uma vez que o grau de pureza é menor que o requerido para o sequenciamento. A medição da massa por espectrometria permite avaliar prontamente se mais de uma espécie de DNA mitocondrial se apresenta em um indivíduo (BIOSCIENCES, 2011). 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS A determinação da massa molecular de uma sequência de DNA possui muitos benefícios, principalmente no campo forense. Dentre eles, pode se citar o fato de que variações de sequência observadas podem aumentar o poder de discriminação dos testes comparado às análises convencionais, uma vez que se pode se detectar facilmente alterações em um único nucleotídeo em moléculas de até 250 bases. Além disto, por meio desta técnica pode se trabalhar com os mesmos marcadores usados convencionalmente, o que facilita a implantação do método. A espectrometria de massa aplicada ao DNA possui muitas vantagens sobre a eletroforese capilar com fluorescência, sendo mais rápida e barata, não necessita de marcadores internos ou calibração espectral.

14 Apesar de já presente no mercado, de acordo com informações de catálogo do sitio do fabricante, o preço do equipamento é bastante alto, por volta de duzentos mil dólares, que pode ser compensado pelo relativo baixo custo de análise (AFSHARI et al., 2012). Devido ao seu tamanho, o equipamento não pode ser levado ao campo, sendo as análises realizadas no laboratório. Por fim, a operação exige técnicos altamente treinados, pois mesmo com o avanço dos programas de computador, faz se necessário interpretar alguns dados manualmente. No entanto, estas desvantagens são superadas pelo alto nível acurácia dos dados gerados, principalmente na análise de microrganismos e amostras forenses, onde a possibilidade de estudo de amostras degradadas mostra o grande potencial do sistema desenvolvido.

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