FAMÍLIA DE KITS LABSCREEN

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1 FAMÍLIA DE KITS LABSCREEN Para detecção de anticorpos HLA usando a tecnologia de Citometria de Fluxo Instruções de Uso APRESENTAÇÃO E COMPOSIÇÃO DA FAMÍLIA Código LS1PRA LS2PRA LSM12 LS1A04 LS2A01 LS-AB2 LS-NC LSMICA001 LSMUTR Descrição Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades Kit Detec. Ac. Classe II Especificidades Kit Detec. Simultânea Ac. Classe I e II - Mistura de Pérolas Classe I e Classe II Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades - Antígenos Únicos HLA Classe I Combi - Grupo 4 Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de Antígenos Únicos HLA de Classe II Grupo 1 Conjugado PE de cabra, anti-humano IgG para uso em conjunto com kit LabScreen - LS-AB2 Soro controle Negativo para uso em conjunto com kit LabScreen Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de MICA Antígenos Únicos e Especificidades LABScreen Multi HLA Classe I e II e HNA - LSMUTR USO PRETENDIDO 1

2 Os produtos LabScreen são fabricados para serem utilizados na detecção de anticorpo HLA através da tecnologia de citometria de fluxo. PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO Os produtos LabScreen utilizam micropérolas revestidas com antígenos HLA de classe I e de classe II e reagentes pré-otimizados para a detecção de anticorpos HLA de classe I e de classe II em soro humano. Os produtos LabScreen utilizam o Sistema de Ensaio Lambda Multi-Analítico de Pérolas (LABMAS Lambda Array Beads Multi-Analyte System), o qual caracteriza o analisador de fluxo LABScan 100, para aquisição de dados e análise. O teste Mixed (misturado) detecta a presença de anticorpo para antígenos HLA de classe I e/ou de classe II. O teste PRA pode detectar anticorpos e suas especificidades contra antígenos HLA em cada painel LABScreen. O ensaio de Antígenos Únicos (Single Antigen) permite a confirmação da especificidade específica sugerida por um teste de PRA anteriormente realizado. O soro de controle negativo é usado para estabelecer o valor de fundo para cada pérola (bead) em uma bateria de testes. Princípio Os produtos LabScreen são utilizados em testes de detecção de anticorpo que utiliza um painel de pérolas codificadas por cor, as quais são revestidas com antígenos HLA purificados. Até 100 diferentes pérolas podem ser combinadas em uma suspensão para um único teste. O soro teste é primeiramente incubado com pérolas LabScreen. Qualquer anticorpo HLA presente no soro teste ligasse aos antígenos e então são marcados com R-Ficoeritrina (PE)-conjugado de cabra anti-humano IgG. O Analisador de Fluxo LabScan 100 detecta a emissão fluorescente de PE de cada pérola, permitindo quase uma aquisição de dados em tempo real. O padrão de reação do soro teste é 2

3 comparado à planilha de leitura lote-específico definindo a série de antígenos para determinar o PRA e a especificidade HLA. COMPONENTES FORNECIDOS Código Descrição Componentes do produto LS1PRA Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades Mistura de Pérolas classe I LabScreen: 1 X 125 µl / Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13 ml 3

4 LS2PRA LSM12 LS1A04 LS2A01 LS-AB2 LS-NC LSMICA001 LSMUTR Kit Detec. Ac. Classe II Especificidades Kit Detec. Simultânea Ac. Classe I e II - Mistura de Pérolas Classe I e Classe II Kit Detec. Ac. Classe I Especificidades - Antígenos Únicos HLA Classe I Combi - Grupo 4 Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de Antígenos Únicos HLA de Classe II Grupo 1 Conjugado PE de cabra, antihumano IgG para uso em conjunto com kit LabScreen - LS-AB2 Soro controle Negativo para uso em conjunto com kit LabScreen Teste LabScreen de Detecção de Anticorpos de MICA Antígenos Únicos e Especificidades LABScreen Multi HLA Classe I e II e HNA - LSMUTR Mistura de Pérolas classe I LabScreen: 1 X 125 µl / Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13 ml Mistura de pérolas de classe I e de classe II LabScreen: 1 X 500 µl / Tampão de Lavagem LabScreen: 2 X 26 ml Pérolas antígenos únicos de classe I LabScreen Grupo 4: 1 X 125µL / Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13 ml Pérolas antígenos únicos de classe II LabScreen - Grupo 1: 1 X 125 µl / Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13 ml 1 X 1 ml (liof.) Soro controle Negativo 1 x 400µL Pérolas antígenos únicos de MICA - Grupo 1: 1 X 125 µl / Tampão de lavagem LabScreen: 1 X 13 ml Mistura de pérolas de classe I e II e HNA LabScreen: 1 X 500 µl / Tampão de Lavagem LabScreen: 1 x 52 ml MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS Instrumentos não fornecidos Analisador Luminex (sua calibração deverá seguir as instruções do fabricante Luminex) 4

5 Plataforma Luminex XY (acessório opcional para leitura automatizada de 96 amostras no analisador de fluxo LabScan 200). Centrífuga (para placa PCR de 96 poços 200µL cada poço) Minicentrífuga para tubo de 1,5 ml Agitador tipo Vortex Agitador de placa ou plataforma de rotação Para opção de trabalho com placa-filtro: o o o o Manifold para vácuo Placa com filtro Bomba a vácuo com pressão inferior a 100mmHg Agitador de placa ou plataforma de rotação Materiais não fornecidos Conjugado-PE de cabra anti-humano IgG (cat # LS-AB2 da One Lambda) PBS (filtrado) Tubo de 1,5mL Ponteira para micropipetas Se o teste é realizado em placa de 96 poços: o Microplaca de 96 poços 250µL o Selo para vedar a placa acima Soro de controle negativo (cat # LS-NC da One Lambda ou outro equivalente não contendo anticorpo HLA quando testado pelo método LabScreen) Placa filtro CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA, UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ Código Informações sobre transporte Temperatura de 5

6 Toda a família Os produtos devem ser transportados acondicionados com gelo seco. armazenamento Abaixo de -65 C a. Uma vez descongeladas, as esferas não podem mais ser recongeladas, devendo ser conservadas entre 2-8 C por até 3 meses. b. Após a primeira utilização, conservar o Tampão de Lavagem entre 2-8 C por até 3 meses. PRECAUÇÕES a. Para uso em diagnóstico in vitro. b. Referir-se à folha de dados de segurança para informação detalhada. CUIDADO: Os reagentes de teste do LabScreen PRA contêm Azida sódica a 0,1% (NaN 3 ), como preservativo. Em condições ácidas, Azida sódica libera Ácido hidrazóico, um componente extremamente tóxico Reagentes contendo Azida sódica devem ser diluídos em água corrente antes de serem descartados. Essas condições são recomendadas para evitar depósitos em encanamentos onde condições explosivas podem ser desenvolvidas. CUIDADO: todos os produtos de sangue devem ser tratados como potencialmente infecciosos. A fonte do material do qual se originou este produto foi dado como negativo quando testado de acordo com os atuais requerimentos de testes do FDA. Nenhum método de teste conhecido pode oferecer segurança que produtos derivados de sangue humano não transmitirão agente infeccioso. CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA 6

7 Quando trabalhar com soro humano, é recomendado o uso de EPIs adequados para um laboratório clínico, bem como tomar todos os cuidados para trabalho com sangue humano. PROCESSO DE MEDIÇÃO Coleta e Preparo da Amostra a) O soro para teste pode ser fresco (de sangue mantido à temperatura ambiente por menos de 24 horas). O soro separado deverá estar congelado a -20 C ou abaixo dessa temperatura, e descongelado imediatamente antes do ensaio. Entretanto, os grumos deverão ser separados do soro de teste através de centrifugação ( g por 10 min) ou por filtração (0,2 um) antes do teste. Qualquer grumo/precipitado ou contaminação no soro poderá gerar resultados inválidos. b) O soro do teste não poderá ser aquecido inativado, pois pode dar um fundo alto no teste. c) O soro não diluído é, geralmente, usado para o teste. Entretanto, se uma amostra de fundo alto é diluída para este ensaio, o soro de controle negativo deverá ser testado na mesma diluição. Procedimento do Teste Para Efetuar o Teste em Tubo de Microcentrifugação de 1,5mL: 1. As pérolas LabScreen devem ser bem misturadas através de Vortex leve ou por pipetagem repetitiva antes de ser usado. 2. Incubar 5 µl das pérolas LabScreen com 20 µl do soro teste em tubos separados de 1,5 ml no escuro por 30 min a C com suave agitação. 3. Para cada bateria de teste, um soro de controle negativo deve ser testado (código da One Lambda LS-NC) para estabelecer valores de fundo. 7

8 4. Diluir tampão de lavagem 10X em água destilada para fazer uma solução 1X. 5. Adicione 1 ml de tampão de lavagem 1X a cada tubo com solução pérola/soro e agite em Vortex. Centrifugue a 9300 g por 2 minutos. Aspire e descarte o sobrenadante. 6. Repetir a etapa 5 duas vezes. 7. Diluir 1 µl do conjugado PE anti-humano IgG 100X (código da One Lambda LS-AB2) com 99 µl de tampão de lavagem 1X para fazer uma solução 1X. 8. Adicione 100 µl de conjugado PE anti-humano IgG a cada tubo. Agite em Vortex e incube no escuro por 30 minutos a C com agitação suave. 9. Repetir a etapa 5 duas vezes 10. Adicionar 80 µl de PBS a cada tubo. A amostra está pronta para a aquisição de dados e análises, ou pode ser armazenada a 2-5 C no escuro por até 24 horas antes da análise. Para Efetuar o Teste em Placa de 96 Poços: Cuidado: o fechamento da placa de 96 poços deve ser feito com todo cuidado e completamente para prevenir a contaminação da amostra poço-apoço. Feche a placa com selo adesivo pressionando-o contra cada anel dos 96 poços. Não reutilize os selos das placas. Utilize um selo fresco para cada etapa que requeira a aplicação do selo adesivo na placa. 1. As pérolas LabScreen devem ser bem misturadas por suave agitação em Vortex ou pipetagem repetitiva por diversas vezes antes do uso. 2. Incubar 5 µl das pérolas LabScreen com 20 µl do soro teste em cada poço da placa de 96 poços no escuro por 30 minutos a C com agitação suave. 3. Para cada bateria de teste, um controle um soro controle negativo deve ser testado (código da One Lambda LS-NC) para estabelecer valores de background 8

9 4. Diluir tampão de lavagem 10X em água destilada para fazer uma solução 1X. 5. Depois da incubação, adicione 150 µl de tampão de lavagem 1X a cada poço da placa. Cobrir com o selo da placa (código da One Lambda # SSPSEA300) e agite em Vortex. Centrifugue a 1300 g por 5 minutos. Aspire e descarte o sobrenadante. 6. Remover o tampão de lavagem dos poços da placa por aspiração a vácuo ou por agitação (to flick). 7. Adicionar 200 µl de tampão de lavagem 1X a cada poço da placa. Cobrila com um novo selo e agitar em Vortex. Centrifugar a 1300g por 5 minutos. 8. Remover o tampão de lavagem dos poços da placa por aspiração a vácuo ou agitação (to flick). 9. Repetir as etapas 7 e Diluir 1µL do conjugado PE anti-humano IgG 100X por teste (código da One Lambda LS-AB2) com 99µL de tampão de lavagem 1X para fazer uma solução 1X. 11. Adicione 100µL de conjugado PE anti-humano IgG a cada poço. Cobrir a placa com o selo. Agite em Vortex e incube no escuro por 30 minutos a C com agitação suave. 12. Centrifugar a 1300g por 5 minutos. 13. Remover o conjugado PE anti-humano IgG 1X de cada poço da placa através de aspiração a vácuo ou agitação (to flick). 14. Repetir as etapas 7 e 8 duas vezes 15. Adicionar 80µL de PBS a cada poço. Cobrir com um novo selo e agitar em vortex. A amostra está pronta para a aquisição de dados e análises, ou pode ser armazenada a 2-5 C no escuro por até 24 horas antes da análise. Para Efetuar o Teste em uma Placa Filtro de 96 Poços: 9

10 1. Diluir tampão de lavagem 10X (código da One Lambda LSPWABUF) em água destilada para fazer uma solução 1X (aproximadamente 3,2 ml/placa/lavagem). 2. Tampar qualquer poço da placa que não vá ser utilizado, o qual permanecerá não utilizado durante o teste, com o selo de placa para assegurar que os poços não utilizados permanecem secos. Pré-umedeça os filtros na placa filtro dispensando 300µL de tampão de lavagem dentro de somente aqueles poços que serão utilizados para o ensaio. 3. Incubar a placa por 10 minutos em agitador de placa a baixa temperatura. 4. Adicione 5µL de pérolas LabScreen com 20 µl de soro teste por poço teste da placa. a. Agite em Vortex ou gentilmente agite com pipetagem para misturar bem as pérolas LabScreen antes de usar. b. Para cada bateria de teste, um soro controle negativo (código da One Lambda LS-NC) deverá ser testado para estabelecer valores de background c. Durante as etapas de dispensação de pérolas e amostra, pressione gentilmente as ponteiras contra a placa filtro para evitar ruptura dos filtros. 5. Incubar no escuro por 30 minutos a C com agitação suave. 6. Adicione 275 µl de tampão de lavagem por poço (menos pode ser requerido baseado no volume da amostra e pérola já presentes no poço.) 7. Ligue a bomba de vácuo. Não exceda a pressão de vácuo em 100mmHg! Pressione a placa firmemente no manifold a vácuo. Certifique-se de que o líquido drena vagarosamente. Um rápido vácuo causará perda das pérolas devido à aderência nos poros do papel de filtro. Certifique-se que todos líquido foi drenado dos poços antes de proceder à próxima etapa de lavagem. 8. Repetir etapas 6-7 acima por mais 4 vezes. 9. Adicione 100 µl de 1 do PE conjugado anti-humano IgG 1X a cada poço. 10

11 10. Incubar no escuro por 30 minutos a C com agitação suave. 11. Repetir etapas 6-7 cinco vezes. 12. Adicione 80 µl de PBS 1X em cada poço. 13. Leia a amostra na máquina LabScan 100, ajustando a altura da sonda caso seja necessário. OBS.: qualquer um dos protocolos acima pode ser usado para um teste combinado: 1. Para o teste Combinado de classe I e de classe II (OLI cat. # LS12PRA) use 5 µl de cada suspensão de pérolas com 40µL do soro teste. 2. Os produtos cat.# LS1A03 e LS2A01 não podem ser combinados com outros produtos. 3. Volumes iguais de pérolas de classe I e de classe II ou pérolas de antígenos únicos grupo 1 e 2 podem ser misturadas primeiro. Então use 10 µl da mistura de pérolas por teste. Resultados Aquisição de Dados: 1. Prepare a máquina LabScan 100 para aquisição de amostra e calibração de acordo com o Manual do Usuário da Luminex. 2. Escolha um Template (gabarito) de acordo com a identificação de catálogo do kit e número de lote. I. Os templates de aquisição estão disponíveis através do Cd da One Lambda ou poderão ser baixados da internet através do web site de download da One Lambda ( II. Para criar seu próprio template de aquisição, seguintes instruções que se encontram no capítulo de Aquisição do Manual do Usuário da Luminex. 3. Crie um nome de arquivo para as amostras que serão adquiridas. 4. Certifique-se de que todos os ajustes do template estão corretos. As especificações do template são: I. Volume da amostra: 50 ml. 11

12 II. III. IV. Time-out da amostra: 80 segundos Doublet Discriminator Gate: 8000 (low limit) e (high limit) Número e ID das da beads (pérolas) selecionadas de acordo com a worksheet fornecida com o produto. V. Número de eventos mínimo: 100 por bead VI. Flow nate: Fast. 5. Entre com o nome das amostras (Cuidado: se a mesma amostra é testada mais de uma vez, um nome diferente deverá ser aplicado). 6. Agora, a placa está pronta para ser lida 7. Coloque a placa dentro da plataforma xy e inclua o reservatório com sheat fluid (líquido circulante). 8. Clique no botão START para iniciar a aquisição desta seção. Depois que as amostras terminaram de correr, os dados deverão ser salvos (clique na tecla SAVE) como arquivo do tipo CSV. 9. Lave a máquina 2 vezes com sheat fluid (fluido de análise) ao final de cada seção. Análise de Dados: 1. Cada reatividade de soro pode ser calculada pelo sinal mediano fluorescente de cada perda revestida HLA depois correção para ligação não específica à pérola controle negativo (NC#001). Todos os dados são normalizados aos resultados obtidos usando um soro de controle negativo (catálogo da OL1#LS-NC) 2. A reatividade da amostra testes é calculada baseada nos valores medianos fluorescentes, os quais podem ser obtidos do arquivo CSV. 3. Para o LabScreen PRA ou LabScreen Single Antigen, a medicina normalizada para cada pérola revestida HLA equivale os valores medianos de cada pérola dividida pelo valor mediano de cada pérola do controle negativo (NC). 12

13 a) Para o LabScreen Mixed, a mediana normalizada equivale ao valor mediano das pérolas revestidas de Classe I ou Classe II menos o valor mediano da pérola do controle negativo. 4. Os valores medianos background para cada pérola HLA e a pérola NC são obtidos usando um soro controle negativo. 5. A força da reatividade anti-hla é calculada pela razão de background normalizado (NBG ratio). CALIBRAÇÃO DO PROCESSO Logo após a instalação ou revisão/manutenção técnica e durante procedimentos de rotina, a calibração do Analisador Luminex deverá ser efetuada. A calibração deverá ser feita diariamente, como parte da rotina de inicialização da máquina e sempre que a temperatura d Cal Temp mostrada no monitor do sistema indicar uma mudança de mais de 3 graus Celsius ( C). Os calibradores são microesferas com propriedades de dispersão de luz conhecida e também com intensidades conhecidas de fluorescência nas faixas dos comprimentos de onda de Reporter (relator RP1), Classification 1 (classificação CL1), e Classification 2 (classificação CL2). O processo de calibração utiliza essas microesferas para ajustar classe de voltagem para ótima e classificação consistente de microesfera e leituras de relator (reporter). Os ajustes da última calibração realizada aplicam-se automaticamente a qualquer nova sessão. Esta é a aparência da Tela principal no Computador após ter sido ligado: 13

14 Para Calibrar o Instrumento: 1. Ligue o Analisador Luminex. Clique em Warmup na tela principal e, então, clique em OK na caixa de diálogo que aparecerá. Depois de 30 minutos de aquecimento (warmup), vá para a próxima etapa. 2. Clique em Prime na tela principal. Clique OK quando você quiser começar o ciclo de prime (onde é deixado entrar o fluído de análise - sheath fluid) na máquina, para a retirada de bolhas maiores. 3. Remova as microesferas calibradoras (Classification CAL1 e Reporter CAL2) de seu local de estoque, ou seja, das temperaturas de 2-8 C. Agite os frascos com as microesferas em Vortex na posição horizontal. 4. Dispense 5 gotas (aprox. 200 µl) da microesfera de calibração Classification (CAL1) em um tubo identificado de 1,5 ml, e dispense 5 gotas (aprox. 200 µl) da microesfera de calibração Reporter (CAL2) em outro tubo identificado de 1,5 ml. 5. Envolva os tubos contendo as microesferas com papel alumínio para protegêlas da luz. Permita às microesferas que sua temperatura chegue à temperatura ambiente. 6. Clique em Alcohol Flush na tela principal. Utilize 1,2 ml de isopropanol a 70% ou etanol a 70% para o fluxo com álcool. Este fluxo remove qualquer 14

15 pequena bolha de ar que esteja presente no interior do sistema. Clique OK quando estiver pronto para iniciar com o fluxo de álcool. 7. Clique em Calibrate na tela principal. A seguinte caixa de diálogo aparecerá: 8. Coloque o nome da pessoa que estiver efetuando a calibração no campo solicitado. 9. Selecione Product/Lot Number para as microesferas de calibração Classification e na sequência para Reporter. 10. Clique OK. A caixa de diálogo abaixo aparecerá: 15

16 11. Coloque o tubo contendo a microesfera de calibração Classification no suporte para amostra localizado na frente do aparelho. 12. Certifique-se de que Classification está selecionado e, então, clique Start. A barra de progresso mostrará o progresso da calibração. A calibração deverá levar menos que dois minutos. Se a posição no monitor do sistema mudar para Sample Empty antes da calibração se completar, a mensagem Calibration Failed aparecerá. Click OK e comece o processo novamente. Quando a calibração acabar para as microesferas de classificação, a mensagem Calibration Succeeded aparecerá. Os ajustes e qualquer comentário que for inserido serão incluídos no relatório de calibração. 16

17 13. Clique OK. 14. Coloque o tubo com as microesferas de calibração reporter (CAL2) no suporte de amostras. 15. Selecione Reporter e clique em Start. A barra de progresso lhe mostrará o progresso da calibração. A calibração deverá levar menos que dois minutos. Se a posição no monitor do sistema mudar para Sample Empty antes da calibração se completar, a mensagem Calibration Failed aparecerá. Click OK e comece o processo novamente. Quando a calibração acabar para as microesferas de classificação, a mensagem Calibration Succeeded aparecerá. Os ajustes e qualquer comentário que for inserido será incluído no relatório de calibração. 16. Clique OK. Obs.: as microesferas de calibração são muito concentradas. Cada vez que o instrumento for calibrado, ele deverá ser lavado com 4 ciclos de WASH utilizando o fluído de circulação (Sheath Fluid). Notar que entre as microesferas de calibração, deverá ser feita a lavagem por 3 vezes com o fluído de circulação. CÁLCULOS E OBTENÇÃO DOS RESULTADOS Cálculos As abreviações utilizadas nesta seção estão definidas abaixo: NBG ratio Razão do fundo normalizado, usado para determinar a força de cada reação anti-hla. S#N Valor fluorescente mediano amostra-específico para pérola #N. SNC Bead Valor fluorescente mediano amostra-específico para pérola controle negativo. BG#N Valor fluorescente mediano do fundo do soro NC para pérola #N. BGNC Bead Valor fluorescente mediano do fundo do soro NC para pérola do controle negativo. 17

18 NC Serum Soro controle negativo (catálogo da One Lambda # LS-NC) validade para um dado lote de pérola LabScreen. 1. Para LabScreen PRA ou LabScreen Single Antigen. NBG Ratio = S#N / SNC Bead BG#N / BGNC Bead 2. Para LabSreen Mixed: NBG Ratio = S#N / SNC Bead BG#N / BGNC Bead Determinação do Valor de Corte Positivo/Negativo 1. Para LabSreen PRA e LabSreen Mixed: a) Selecione a razão NBG que dá um significante Shith Over valor de fundo fluorescente quando o valor de fundo é obtido usando um soro controle negativo em 3.5 testes duplicados. Se preferir, teste 5-10 amostras de doadores do sexo masculino, não transplantados e que não tenham passado por transfusão para obter um valor médio de fundo. b) Valide o valor de corte usando de 5-10 amostras de alossoro referência com especificidade de anticorpo HLA definidos. Os valores da razão NGB para as reações de antígenos positivos esperados deverão estar acima do valor de corte. c) Reações positivo-negativas adicionais podem ser observadas. Se necessário, ajuste o corte do ensaio LabScreen para combinar com a sensibilidade de ensaio de detecção de anticorpo aceita anteriormente. 2. Para LabScreen Single Antigen: 18

19 a) Teste o soro controle negativo ou diversas amostras de soro negativo usando o (1.a) acima. b) Defina a faixa de trabalho: - Working Range = NBG Ratio Maximum NBG Ratio Minimum. c) Defina os pontos de corte dentro de faixa de trabalho: - Relative NBG Ratio cut-off = X% (Working Range) + NBG Ratio Minimum onde X% = porcentagem definida pelo usuário do ponto de corte dentro da faixa de trabalho positivo / negativo (1), área cinza (2), positivo fraco (4) e positivo forte (8). d) Ajuste o critério para definir reações positiva X negativa, por exemplo: (1) Se [ NBG Ratio max/ NBG Ratio min ] > 8, então aplique o cálculo em 2C. (2) Se [ NBG Ratio max/ NBG Ratio min ] < 8, e: i NBG Ratio max > 5, então razão NBG min deverá ser ajustada para a metade do NBG Ratio max e o corte relativo da razão NBG deverá ser recomputada (com em 2C) baseado no NBG Ratio min ajustado. As reações são então classificados conforme o escore acima. ii NGB Ratio max < 5 então a reação do soro teste com aquela bead (pérola) é negativa. Determina o escore de 1. e) Teste diferentes alossoros referência como no (1b) acima, usando a razão NBG relativa para validar o corte. (1) Estabeleça um corte de reatividade forte e fraca baseado na performance do alossoro referência, relativo a um ensaio estabelecido. 19

20 (2) Pode ser útil colocar os valores da razão no histograma para a visualização do padrão de reatividade HLA de cada soro. (3) Sensitividades maiores ou menores podem ser obtidos pelo ajuste do corte. Valores Esperados A. LabScreen PRA Classe I ou Classe II 1. A força de reatividade do soro teste de cada pérola pode ser comparada para distinguir reações forte positivas, fracas positivas e negativas. Reações de reatividade podem ser classificada dentro de diferentes faixas, se um sistema de escova é desejado. 2. Nossos dados mostram que razões de NBG > 1.5 no teste LabScreen PRA correlaciona bem com reações positivas pelo número de reações válidas para aquele soro teste. 3. Para determinar a especificidade do anticorpo HLA entre com o escove de reação dentro da planilha de leitura lote-específica para analisar o padrão de reação. B. LabSreen Mixed: 1. Faça a contagem das reações HLA de Classe I e Classe II separadamente, de acordo com a força de reatividade do soro para cada conjunto de pérolas. 2. Se qualquer uma das pérolas no ensaio das misturas é positiva, então o resultado deverá ser determinado como positivo. 3. Nossos dados mostram que razões de NBG > 2.2 no teste LabScreen mixed correlaciona bem com reações positivas no LAT mixed. C. LabSreen Single Antigen 1. O alossoro pode produzir razões de Sinal / Fundo que são maiores que aquelas abtidas no ensaio PRA estabelecendo o corte do ensaio usando uma razão realtiva do NBG (conforme em resultados, seção D-2C) é uma maneira de normalizar dos dados. 20

21 2. Nossos dados mostram que um corte positivo / negativo ou razão NBG calculada para cada soro teste dará resultados comparáveis ao ensaio LabScreen PRA. D. Orientações Gerais: 1. Cada contagem de beads deverá estar acima de 50. Uma contagem menor de pérolas pode ser devido à pérola de amostra durante as etapas de lavagens. Também pode ser devido à imprópria calibração ou entupimento no LabScan 100. Baixa contagem de beads pode também ser causada por pérolas fotobranqueadas que pulam para fora da região mapeada. 2. Valores do sinal são as médias de cada conjunto de pérolas vs. o soro teste. Um soro controle negativo deveria ser testado com a mesma bateria de amostras para estabelecer o valor (ou valores) do background para aquela corrida de teste. 3. Soro controle negativa (Lat # LS-NC da One Lambda ou outro equivalente) é recomendado. Usando qualquer outro soro controle negativo pode requerer ajuste nos valores de corte. 4. Pérolas de controle negativo (Ag ID = NC) não são revestidos com antígenos HLA. O valor médio pode variar junto com diferentes amostras de soros com alto fundo. Isso deve ser sempre menor que 1500 e menor ou igual que a metade do valor do PC (controle positivo). 5. Pérolas de controle positivo (Ag ID = PC) são beads (pérolas) revestidas com IgG humano purificado. Ela deve se ligar ao anticorpo secundário para produzir um sinal positivo. O valor do PC deverá estar acima de 500 e pelo menos duas vezes o valor do NC. E. Validação do Ensaio: 21

22 1. O valor de corte do sinal para fundo deve ser validado se um novo soro controle negativo for usado. 2. Para um dado soro, o valor do PC/NC deve ser maior que 2. Um valor de fundo da pérola NC para o soro teste, um sinal alto para a pérola HLA para o controle NS, ou um sinal baixo do anticorpo secundário ou o Sistema LabScan 100. Neste caso, os dados devem ser confirmados. 3. Cada usuário deve avaliar o desempenho do ensaio no seu laboratório para validar os valores selecionados de corte. LIMITAÇÕES DO PROCESSO A. O soro que contém contaminantes ou agregados pode entupir o LabScan 100 e gerar dados incorretos. Agregados no soro teste devem ser removidos por centrifugação ou por filtragem antes da realização do teste. B. Temperatura ambiente onde o LabScan 100 está localizado pode afetar a calibração da máquina. Se a temperatura ambiente muda, pode ser que a máquina precise ser recalibrada. Consulte o manual do fabricante para maiores informações. C. A aquisição precisa de dados depende do desempenho apropriado do LabScan 100. A máquina deve ser calibrada e mantida de modo apropriado. No caso de lavagem insuficiência do sistema, agregado da amostra podem causar entupimento na máquina e gerar dados inválidos. D. Determinação da especificidade do anticorpo até limitada aos antígenos HLA presentes em cada painel de pérolas. (Veja a planilha de leitura loteespecífica). CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE Recomenda-se que, a cada novo lote, sejam realizados testes com o uso de soros com anticorpos cuja reatividade seja previamente conhecida, a fim de 22

23 avaliar a correta caracterização dos anticorpos, bem como a porcentagem do painel reativo de anticorpo (PRA). VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES DEMOGRÁFICOS, EPIDEMIOLÓGICOS, ESTATÍSTICOS, DESEJÁVEIS, TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Usando os valores de referencia de corte em Expected Values, os ensaios LabScreen têm fornecido resultados comparáveis aos resultados do FlowPRA da One Lambda e aos ensaios da Lambda Antigen Tray. Entretanto, os padrões de anticorpo HLA podem ser um pouco complexos. Uma dada amostra teste pode conter diversas especificidades de anticorpos HLA de Classe I e de Classe II, cada uma com diferente avidez; entretanto, nem todas as especificidades serão reconhecidas em ensaios com menor sensitividade. Portanto, cada laboratório deverá estabelecer e validar os cortes do ensaio para seu próprio uso. Baseando-se em suas perícias em reconhecer os padrões CREG HLA e um avaliação do desempenho do ensaio usando alossoro HLA com especificidades definidas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS The Luminex 200 User s Manual, Luminex Corporation, PN R Pei, J-H Lee, T Chen S Rojo, and PI Terasaki. Flow Cytometric Detection of HLA Antibodies Using a Spectrum of Microbeads. Human Immunology 60, (1999) 23

24 R PEI, G WANG, C TARSITANI, S ROJO, T CHEN, S TAKEMURA, A LIU, J-H LEE. Simultaneous HLA class I and Class II antibodies secrrening with Flow cytometry. Human Immunology 59, (1998) RA BRAY, DA SINCLAIR, L WIMOTH-HOSEY, C LYONS, P CHAPMAN, J HOLCOMB. Significance of the flow cytometric PRA in the evaluation of patients awaiting renal transplantation. Department of Pathology, Emory University, Atlanta, GA. ASHI Abstract, IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE One Lambda, Inc Kittridge Street Canoga Park CA - EUA 24

25 REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: REVISÕES Revisão Descrição da Alteração Data 00 Elaboração 11/2006 Formatação, layout, produtos descontinuados, alteração nas condições de 01 armazenagem e transporte, inclusão das denominações comerciais de cada item da família, inclusão de número de registro e alteração de Responsável Técnica 02/ Alteração na apresentação comercial da família 02/ Alteração do DDG 09/ Revisão gramatical e ortográfica, formatação, alteração de Responsável Técnica 12/