ATIVIDADE BACTERICIDA DA Copaifera sp. FRENTE a Staphylococcus spp. ISOLADOS DE MASTITE BOVINA. UNIPAR Umuarama PR

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1 ATIVIDADE BACTERICIDA DA Copaifera sp. FRENTE a Staphylococcus spp. ISOLADOS DE MASTITE BOVINA Francklin Gimenes Rodrigues 1 ; Noemila Débora Kozerski 2 ; Zilda Cristiani Gazim 3 ; daniela Dib Gonçalves 4 ; Lisiane de Almeida Martins 4 1 Mestrando em Ciência Animal UNIPAR Umuarama PR 2 Médica Veterinária UNIPAR Umuarama PR 3 Docente da Pós graduação (Mestrado em Biotecnologia Aplicada a Agricultura) UNIPAR Umuarama PR 4 Docente do Curso de Medicina Veterinária e Pós Graduação (Mestrado em Ciência Animal) UNIPAR Umuarama PR. Recebido em: 30/09/2013 Aprovado em: 08/11/2013 Publicado em: 01/12/2013 RESUMO Para aperfeiçoar o estado sanitário da glândula mamária bovina, é essencial o controle das mastites clínicas e subclínicas. A utilização de antimicrobianos é uma das medidas realizadas para o tratamento da patogenia, mas estudos evidenciam alta porcentagem de cepas resistentes, com seleção de micro-organismos, devido ao uso inadequado e não monitoramento de antibióticos, tornando-se assim um risco à saúde pública. O óleo-resina de copaíba é um produto natural e sua atividade antimicrobiana tem sido relatada por vários pesquisadores. Considerando o tratamento de mastites como segmento de um controle sanitário, objetivou-se avaliar o potencial de atividade antimicrobiana in vitro dos extratos do óleo de copaíba, frente ao gênero Staphylococcus spp. isoladas de mastite bovina, Foi utilizado óleo extraído da Copaíba em concentrações de 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% e 1,56%, testados frente a três diferentes grupos de Staphylococcus que foram, Staphylococcus coagulase negativa (STAPHCN), Staphylococcus aureus (STAPHA) e Staphylococcus coagulase positiva (STACP), no qual pode-se observar resultados satisfatórios em relação ao seu poder de inibição frente os micro-organismos testados, destacando em especial os resultados obtidos com STACP onde aproximadamente 50% das amostras demonstraram sensibilidade ao efeito inibidor de crescimento do óleo de Copaíba em concentrações superiores a 25%, ressaltando assim uma possível ação bactericida do óleo de Copaíba. O estudo ainda revelou que o óleo de Copaíba tem potencial para ser avaliado como uma alternativa ou até complemento aos antibióticos para o tratamento da mastite nos bovinos. PALAVRAS-CHAVE: Atividade bactericida; Copaifera sp; Óleo-resina; pecuária leiteira; Staphylococcus spp. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

2 BACTERIAL ACTIVITY OF Copaifera sp. FROM Staphylococcus spp. ISOLATED FROM BOVINE MASTITIS ABSTRACT To improve the health status of the mammary gland, is essential to the control of clinical or subclinical mastitis. The use of antibiotics is one of the measures taken to treat pathogenesis, but studies show a high percentage of resistant strains, with selection of micro-organisms due to inappropriate use of antibiotics and not monitoring, thus becoming a risk to public health. The oil-copal resin is a natural product and antimicrobial activity has been reported by several researchers. Considering the treatment of mastitis as segment of a sanitary control aimed to evaluate the potential of in vitro antimicrobial activity of extracts of copaiba oil against Staphylococcus spp isolated from bovine mastitis using it for oil extracted from Copaíba in concentrations of 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.125% and 1.56%, tested against three different sets of Staphylococcus which were coagulase-negative Staphylococcus (STAPHCN), Staphylococcus aureus (STAPHA) and coagulasepositive staphylococci (STACP), which can be observed satisfactory results in respect to its front inhibition of the microorganisms tested, highlighting in particular the results obtained with STACP where approximately 50% of the strains were susceptible to the growth inhibitory effect at concentrations copaiba oil greater than 25%, so emphasizing a possible bactericidal action of copaiba oil. The study also revealed that copaiba oil has the potential to be evaluated as an alternative or supplement to antibiotics for the treatment of mastitis in cattle. KEYWORDS: Bactericidal activity, Copaifera sp., Dairy, Food, Oleoresin Poisoning, Staphylococcus spp.. INTRODUÇÃO Assim como demais segmentos da atual sociedade, a produção de leite tem se mostrado cada vez mais competitiva. Portanto, é de suma importância qualificar e quantificar os fatores que possam influenciá-la, visando ganhos efetivos na qualidade e quantidade do leite produzido, na tentativa de suprir a demanda nacional (COLDEBELLA et al., 2004; PICOLI et al., 2013). Entre os problemas sanitários mais frequentes observados na pecuária leiteira, a mastite é uma enfermidade que se destaca, acarretando prejuízos econômicos, e por determinar alterações sobre a composição e as características físico-químicas do leite, acompanhadas por um aumento na contagem de células somáticas (MULLER, 2002). Bactérias do gênero Staphylococcus spp. estão entre os principais agentes etiológicos da mastite bovina e são frequentemente resistentes aos antimicrobianos, em especial aos beta-lactâmicos, limitando assim, a escolha do antibiótico para o tratamento das infecções causadas por este agente (DALL AGNOL et al., 2013) Sendo assim, é de fundamental importância manter testes como análises microbiológicas e perfil de resistência a antimicrobianos, para evitar resistência de cepas, reforçando a importância do uso adequado e monitorado de antibióticos, já que estes micro-organismos podem ser disseminados pelo leite e se transformarem em sério problema de saúde pública (AGOSTINIS et al., 2012). O óleo de copaíba é extraído de várias espécies do gênero Copaifera ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

3 (Leguminosae-Caesalpinoideae), através de perfurações realizadas em seus troncos. Além das inúmeras aplicações do óleo em cosméticos e outras indústrias, ainda há uma série de indicações para seu uso terapêutico.existem hoje descritas algumas dezenas de propriedades medicinais diferentes, que vem sendo em alguns casos comprovadas cientificamente, como atividade antimicrobiana, antiinflamatória, anti-neoplásica, entre outras. Estudos recentes têm demonstrado também grande potencial de uso do óleo de copaíba na odontologia, na composição de cimentos endodônticos e na prevenção e combate da doença periodontal (PIERRE et al., 2009). Segundo ALENCAR (1982), o óleo é o produto da desintoxicação do organismo vegetal, e que funciona como defesa da planta contra animais, fungos e bactérias. A utilização do óleo de copaíba originou-se da utilização empírica, pela observação do comportamento de certos animais que, quando feridos, esfregavamse nos troncos das copaifeiras (MACIEL et al., 2002) e atualmente possui comprovada ação anti-inflamatória, antibacteriana, antifúngica e antiedêmica realizada em diversos estudos (VEIGA JUNIOR & PINTO, 2002; OLIVEIRA et al., 2006; RAMOS, 2006). Quanto às características físico-químicas do óleo-resina da Copaifera multijuga Hayne, podemos afirmar que trata-se de um líquido transparente, viscoso e fluido, com cheiro forte e odor de cumarina, sabor acre e amargo. Pode ser armazenado por até dois anos sem alterar as suas propriedades, podendo transformar-se em resina, se exposto ao ar e à luz (MENDONÇA & ONOFRE, 2009). Este período longo de armazenamento torna-se favorável, em se tratando da utilização nas mastites, visto que há necessidade de estocagem nas propriedades leiteiras. Considerando todas estas atividades e benefícios já relatados por diferentes pesquisadores quanto à utilização do óleo de Copaíba, este trabalho teve o objetivo de analisar a atividade bactericida do óleo de Copaíba e verificar o mecanismo de inibição do crescimento em Staphylococcus coagulase negativa, Staphylococcus coagulase positiva e Staphylococcus aureus para estabelecer tratamentos alternativos para a mastite bovina. Material botânico MATERIAL E MÉTODOS O óleo da Copaífera originário da região centro-oeste foi doado pelo Laboratório de Farmacotécnica da Universidade Paranaense, Umuarama PR, o qual foi extraído diretamente de troncos das árvores através de pequenas perfurações. A incisão no tronco das árvores fornece o óleo de copaíba, na forma de um óleo-resina de coloração amarela a marrom, que é utilizado industrialmente em vernizes e lacas, na restauração de pinturas antigas, como fixador de odor em fragrâncias e como aromatizante em alimentos (TAPPIN et al., 2004). Micro-organismos Após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

4 Experimentação Animal (CEPEEA/UNIPAR), com o número de registro 22559/2011, foram utilizados Staphylococcus spp. isolados de animais com mastite clínica ou subclínica, animais esses pertencentes a várias propriedades da região noroeste do Paraná. Todas as amostras foram repicadas e padronizadas de acordo com o tubo 0,5 da escala McFarland correspondendo à concentração de aproximadamente 10 8 Unidades Formadoras de Colônias - (UFC/mL), compreendendo um total de 122 amostras analisadas, sendo 27 de Staphylococcus aureus, 23 de Staphylococcus coagulase positiva e 72 de Staphyloccus coagulase negativa. Preparação das soluções do óleo resina Em um Becker 50 ml, adicionou-se 0,4g de Tween 80, em seguida, com auxílio de um bastão de vidro foi acrescentado o óleo de copaíba de acordo com as diluições, 50,0%, 25,0%, 12,5%, 6,3%, 3,1% e 1,6%, e adicionado água osmose reversa estéril para atingir o volume final de 25 ml. Atividade bactericida Em cada microplaca, compostas por 96 poços de fundo chato, foram testados quatro micro-organismos em triplicata e sendo ainda, em duplicata, testados os controles negativos (as diferentes concentrações do óleo, o meio BHI, o Tween 80) e os controles positivos (cada uma das amostras de micro-organismos testadas) (GAZIM et al., 2010). Em cada orifício foram dispostos 100µL do meio BHI, 100µL das diluições do óleo de copaíba e 5µL da solução bacteriana, sempre em triplicata. As placas foram homogeneizadas e incubadas a 37 C durante 24 horas (GAZIM et al., 2010). A leitura foi procedida após a adição de 5µL de cloreto de trifeniltetrazólio, diluído a 10% em água osmose reversa e incubado durante 10 minutos. Considerouse crescimento de bactérias na concentração inibitória mínima, os poços que apresentavam qualquer intensidade da tonalidade rósea, após a incubação. Análise Estatística Os resultados deste trabalho foram tabulados e submetidos à análise estatística, onde as frequências de crescimento ou não dos diferentes microorganismos submetidos a diferentes concentrações do óleo foram comparadas, entre os micro-organismos para uma mesma diluição e entre as diluições para um mesmo micro-organismo, pelo teste de Qui-quadrado ou G de Williams, utilizando-se o programa Biostat 5.0. Diferenças significativas foram avaliadas entre as proporções pelo cálculo do intervalo de confiança a 95% para a diferença entre proporções (diluições). Foram considerados significantes valores de P<0,05 e intervalos de confiança que não incluíam o valor zero (AYRES et al., 2007). RESULTADOS Ao testar 122 isolados de Staphylococcus spp. de mastite subclínica, foi possível verificar que houve atividade bactericida nas diferentes diluições frente ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

5 aos três grupos de Staphylococcus testados, os quais consistiram em Staphylococcus coagulase negativa (STAPHCN) (43,1% a 4,2%), Staphylococcus aureus (STAPHA) (40,7% a 3,7%) e Staphylococcus coagulase positiva (STACP) (47,8%), em diferentes diluições, como demonstra a Tabela 01. Tabela 01. Diluição (%) Frequência absoluta (N) e relativa (%) de amostras sem crescimento (SC) segundo o micro-organismo e a diluição de óleo de copaíba testados, Umuarama, PR, STAPHCN (n=72) STAPHA (n=27) STACP (n=23) SC SC SC N % N % N % 50,0 47,8 A 31 43,1 Aa 11 40,7 Aa 11 a 25,0 47,8 A 31 43,1 Aa 11 40,7 Aa 11 a 12, ,1 Ba 4 14,8 Ba 0 0,0 Bb 6,25 5 6,9 Ba 1 3,7 Ba 0 0,0 Ba 3,12 4 5,6 Ba 1 3,7 Ba 0 0,0 Ba 1,56 3 4,2 Ba 1 3,7 Ba 0 0,0 Ba *Lê-se: STAPHCN= Staphylococcus coagulase negativa; STAPHA= Staphylococcus aureus; STACP= Staphylococcus coagulase positiva. Estatística: Para um mesmo micro-organismo e condição de crescimento frequências relativas seguidas de letras maiúsculas diferentes indicam diferenças pelo teste de diferença entre duas proporções (teste de Qui-quadrado ou G de Williams). Para uma mesma diluição e condição de crescimento, frequências relativas seguidas de letras minúsculas diferentes indicam diferenças pelo teste de diferença entre duas proporções. O óleo de Copaíba nas concentrações de 25% e 50% inibiu o crescimento de 43,1% dos STAPHCN; 40,7% dos STAPHA e 47,8% dos STACP, porém não foram detectadas variações na porcentagem de amostras inibidas quando comparadas nas concentrações do óleo de 25% e 50%, obtendo sempre os mesmos resultados. Nas demais diluições não foram detectadas inibições do crescimento bacteriano ou esta foi muito reduzida. DISCUSSÃO As propriedades terapêuticas dos princípios e medicamentos fitoterápicos começam a ganhar cada vez mais espaço no tratamento veterinário, profissionais adeptos da fitoterapia revelam alta frequência de sucessos em tratamento de parasitoses e enfermidades infecciosas, inclusive em tratamentos de mastites (AGOSTINIS et al., 2012), o que pôde ser confirmado no presente trabalho, onde todos os grupos de Staphyloccocus testados apresentaram em maior ou menor grau resultados satisfatórios referentes ao poder de inibição das diferentes concentrações do óleo de Copaíba, porém podemos destacar o poder inibitório do óleo quando testado com STACP, onde na concentração de 25% mostrou-se satisfatório poder inibitório, onde 47,8% das amostras testadas não apresentaram crescimento. Por outro lado, STAPHCN e STAPHA apresentaram efeitos de inibição frente ao óleo em suas concentrações mais baixas, de 1,56% e 3,12% onde uma pequena parte das amostras testadas não apresentou crescimento. Resultados semelhantes não foram encontrados nas amostras de STACP, onde só foi possível encontrar ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

6 efeitos inibitórios a partir da concentração de 12,5% do óleo de copaíba. Podemos destacar ainda que, em todas as subespécies de Staphylococcus testadas não houve variação de crescimento, quando comparadas às concentrações do óleo de 25% e 50%, obtendo resultado igual em ambas às concentrações de acordo com cada grupo de bactéria. Ao comparar os resultados encontrados no presente experimento com os relatos da literatura sobre a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Copaíba, pude-se encontrar resultados semelhantes, como os de PACHECO et al. (2006) que relatam que o óleo resina de Copaifera spp. resulta em diferentes níveis de inibição contra as bactérias Gram-positivas, mostrando atividade significativa contra Bacillus subtilis e S. aureus, quando comparado com cloranfenicol usado como controle. Vários trabalhos da literatura, também relatam resultados confirmando o efeito bactericida do óleo essencial de Copaíba, quando testado com outros microorganismos (BASKARAN et al., 2009; LIMA, 2012; MENDONÇA & ONOFRE, 2009). De acordo com PIERRI et al. (2012), o óleo de copaíba apresentou ação antimicrobiana contra a estirpe bacteriana de Streptococcus mutans na concentração de 10% e foram encontrados resultados favoráveis em concentrações ainda mais baixas do óleo de Copaíba, quando comparado com o presente trabalho, mas que são facilmente justificadas pelo fato de se tratarem de micro-oganismos diferentes, porém deve ser salientado que ambos os micro-organismos pertencentem ao grupo das bactérias Gram positivas. Em estudo in vitro, realizado com objetivo de investigar o efeito antimicrobiano de derivados de plantas, como moléculas de cinamaldeído, eugenol, carvacrol, timol, contra S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. aureus e E. coli, ou seja, principais patógenos da mastite, obtiveram-se concentrações baixas e eficazes contra estes patógenos, com Concentração inibitória Mínima (MIC) de 0,05%, 0,4%, 0,45%, 0,45%e 0,1%, respectivamente (BASKARAN et al., 2009). Já no presente estudo, observa-se uma inibição do crescimento, porém em concentrações bem mais elevadas, acima de 12,5%. Esta variação deve-se provavelmente ao fato do presente trabalho testar a atividade bactericida total dos princípios ativos do óleo da copaíba. Apesar de existir um grande número de trabalhos relatando na literatura a composição química do óleo essencial de Copaíba, ainda não se sabe ao certo qual ou quais substâncias são responsáveis pelo efeito bactericida, provavelmente devido a uma combinação de sesquiterpenos e diterpernos ácidos, o que se sabe é que esses compostos quando isolados, não são capazes de apresentarem efeitos de tamanha escala, quando comparados com o extrato bruto. Ao se comparar o efeito bactericida do óleo de Copaíba, com outros óleos essenciais, como o caso do óleo de Piper Amalogo, resultados semelhantes também foram encontrados. Através da técnica de microdiluição em caldo (MIC), ficou evidente o poder inibitório do óleo essencial de Piper amalago nas concentrações de 5%(10µg/mL) e 10%(20µg/mL), destacando que que o óleo na menor concentração (10µg/mL) apresentou maior efetividade frente às bactérias Gram-positivas, cerca de 50% (LIMA, 2012). Estes resultados mostram-se muito semelhantes ao encontrado no presente trabalho quando testado o grupo STACP, obtendo 47,8% das amostras testadas inibidas de seu crescimento quando em contato com óleo de Copaíba, porém em concentrações maiores de 25% e 50%. Atualmente, o grande problema relacionado à mastite bovina, não está só no prejuízo econômico do pecuarista pela dificuldade na cura dos animais, está em ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

7 casos extremos, ao fato da mastite bovina ser fatal acarretando assim grandes perdas no setor. A mastite bovina também é um problema de saúde pública, visto que o principal micro-organismo causador da patologia são os do grupo de Staphylococcus spp. que tem a capacidade de produzir toxinas extracelulares, ainda no processo de mastite pré-clínica. Estas toxinas ao serem consumidas pelo ser humano através do leite contaminado podem causar severa intoxicação alimentar, acarretando quadro de náuseas, vômitos, diarréia, dores abdominais, entre outros (AGOSTINIS et al., 2012; MARQUES et al., 2013). As infecções intramamárias causadas por Staphylococcus aureus apresentam implicações importantes em Saúde Pública, tendo em vista que as toxinas podem ser excretadas no leite e permanecer estáveis nos produtos oferecidos ao consumo. A simples presença de cepas toxigênicas de Staphylococcus aureus no leite não implica, necessariamente, a ocorrência de intoxicações em seres humanos, porém o risco existe e é maior para crianças, principalmente de tenra idade (FAGUNDES & LIVEIRA, 2004). A dificuldade no controle e tratamento da mastite, aliada à existência de estudos prévios que relatam a presença de substâncias em plantas nativas com atividade antimicrobiana, torna promissora a pesquisa com extratos e compostos de origem vegetal (RIOS & RECCIO, 2005), considerando que estes princípios controlam a multiplicação de micro-organismos ou permite até sua eliminação total do leite, sem a necessidade de desprezar o leite durante o tratamento, que tem um aspecto vinculado à saúde pública muito relevante. Ainda são necessários mais estudos para entender as causas da variação nos resultados entre os diferentes grupos de Staphylococcus, e determinar a sua relativa importância para estudos futuros, principalmente no que se refere à atividade bactericida de cada um dos componentes do óleo. CONCLUSÃO Verificou-se que o óleo de Copaíba apresentou efeito inibidor de crescimento quando testado in vitro, frente os três grupos de staphylococcus testados, ou seja, Staphylococcus coagulase negativa, Staphylococcus aureus e Staphylococcus coagulase positiva, onde aproximadamente 45% das amostras foram inibidas de seu crescimento natural em concentrações de 25% e 50% do óleo de Copaíba, demonstrando que o mesmo apresenta potencial para o tratamento alternativo ou até como droga quando associado aos antibióticos de uso comum no tratamento de mastite bovina. REFERÊNCIAS AGOSTINIS, R. O. ; MELLO, P. L.; MARTINS, L. A. Importância do mapeamento e monitoramento do perfil de resistência e detecção dos genes de resistência de Staphylococcus spp. relacionados a mastite bovina. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia da UNIPAR, v. 15, n.1, p , ALENCAR, J. Estudos silviculturais de uma população natural de Copaifera multijuga Hayne Leguminosae na Amazônia central. 2 produção de óleo resina. Acta Amazônica, v. 12, n. 1, p , ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p

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