FACULDADE ASSIS GURGACZ CRISTIANE PERSEL

Transcrição

1 FACULDADE ASSIS GURGACZ CRISTIANE PERSEL ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE CANDIDA ALBICANS ISOLADA DE DIFERENTES AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES INTERNADOS EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE CASCAVEL, PARANÁ CASCAVEL 2011

2 2 FACULDADE ASSIS GURGACZ CRISTIANE PERSEL ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE CANDIDA ALBICANS ISOLADA DE DIFERENTES AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES INTERNADOS EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE CASCAVEL, PARANÁ Projeto de pesquisa apresentado ao Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas, da Faculdade Assis Gurgacz FAG, como requisito á obtenção do título de bacharel em Ciências Biológicas. Orientadora: Mr. Greicy Kiel CASCAVEL 2011

3 Sumário RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

4 4 ATIVIDADE HEMOLÍTICA DE CANDIDA ALBICANS ISOLADA DE DIFERENTES AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES DE UM HOSPITAL PÚBLICO DE CASCAVEL, PARANÁ Cristiane PERSEL 1 Greicy KIEL 2 RESUMO Candida albicans é a espécie mais diagnosticada e conhecida na área médica, sendo responsável pela maioria dos casos de infecções fúngicas em humanos. Libera diversos fatores de virulência para se estabelecer no sítio da infecção e possui maior capacidade hemolítica do que as outras espécies do gênero Candida. Entretanto são escassos os estudos sobre seus fatores. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de hemólise de cepas de Candida albicans isoladas de diferentes amostras clínicas. Para avaliar a atividade hemolítica foram utilizadas 30 cepas de Candida albicans isoladas de distintas amostras clínicas, as quais foram inoculadas em meio Ágar Sangue e incubadas a 37ºC por 72 horas. Paralelo a isso, as cepas foram induzidas a tratamento com soro fetal bovino para a formação do tubo germinativo, sendo em seguida inoculadas em meio Ágar Sangue e incubadas a 37 ºC por 72 horas. Os testes de atividade hemolítica com cepas de Candida albicans sem tubo germinativo mostraram que 80% (24/30) destas produziram algum tipo de hemólise, 50 % destas, hemólise completa. Resultados de aumento na atividade hemolítica de cepas de C. albicans após indução a tubo germinativo foram verificados em todas as amostras, onde 90% destas promoveram beta hemólise. Assim como a liberação de hemolisinas, a formação do tubo germinativo está relacionado com os fatores de virulência de Candida albicans. Todas as cepas de Candida albicans apresentaram algum tipo de hemólise, quando formaram o tubo germinativo, aumentaram sua capacidade hemolítica, promovendo em sua maioria beta hemólise, sendo um fator importante a ser considerado. 1-INTRODUÇÃO Candida albicans é considerada a principal levedura patogênica em humanos devido ao seu grande número de isolamentos em hospitais públicos de extensão mundial, sendo responsável pela maioria dos casos de infecções fúngicas em pacientes acometidos a longos períodos de internação, uma vez que a mesma se aproveita da baixa capacidade imunológica para se tornar 1-Acadêmica de Ciências Biológicas-Bacharelado. Faculdade Assis Gurgacz. tchane_@hotmail.com 2-Mestre em Microbiologia. Docente da Faculdade Assis Gurgacz. greicy@fag.edu.br

5 5 patogênica, ocasionando altas taxas de mortalidade (GIOLO et al., 2010; COLOMBO; GUIMARRÃES, 2003). Além da imunodepressão do hospedeiro o estabelecimento da infecção está relacionado à participação ativa da levedura, expressando diversos fatores de virulência (GIOLO et al., 2010). A capacidade da levedura em aderir, infectar e causar doença, em conjunto, é definido como potencial de virulência. Os fatores de virulência são determinados geneticamente, porém expressos pelos microorganismos quando submetidos a certas condições (TAMURA et al., 2007). O gênero Candida produz diversos destes fatores, dentre os quais são mais estudados e se destacam as enzimas proteinases e lipases, que contribuem para a invasão no hospedeiro (SIDRIM; ROCHA, 2004), entretanto são escassos estudos sobre a atividade hemolítica, fator exibido por várias espécies de Candida spp. (RIBEIRO et al., 2004). A capacidade de adesão e formação de biofilme fortalecem o estabelecimento da levedura nos sítios da infecção e deste modo aumentam a adesão do micro-organismo nas células, com a formação do biofilme ajudam a comunidade a formar uma proteção contra as defesas imunes do hospedeiro (GIOLO et al.,2010). A formação de um tubo germinativo acontece a partir de uma pequena hifa originada de um blastoconídio, a qual pode ser sugerida como um fator de virulência, sendo que essas hifas apresentam maior poder de aderência nos tecidos (ÁLVAREZ et al., 2007). Wingeter et al., (2007), relatam a grande variabilidade das características patogênicas encontradas nos isolados de leveduras deste gênero, como um grave problema em relação a resistência de certas cepas deste fungo a certos antifúngicos, demonstrando a importância de uma monitoração para as possíveis mudanças nos padrões de sensibilidade e na distribuição das espécies patogênicas fúngicas (MÍMICA et al., 2009). Para Menezes et al., (2009), o aumento da resistência a antifúngicos é um alerta para a necessidade do desenvolvimento da estratégias que evitem a sua disseminação entre os fungos. As condições do enfermo e sua habilidade imune, assim como quando o diagnóstico de candidíase é bem feito diminui as chances de sua proliferação e de morte do paciente. Além do que, possibilita a introdução de um tratamento específico, resultando em uso racional de antimicrobianos, assim como

6 6 diminuição do tempo de internação, dos custos hospitalares e consequentemente gerando uma queda nas taxas de mortabilidade atribuída a infecções fúngicas por leveduras desse gênero (MÍMICA et al., 2009; GIOLO et al., 2010). Considerando este fator de virulência como uma característica invasiva de Candida spp., o estudo do perfil hemolítico das cepas de Candida albicans se torna viável para um melhor conhecimento no ambiente hospitalar. Deste modo, o presente estudo tem por objetivo analisar a atividade hemolítica de Candida albicans, comparando a hemólise promovida por isolados provenientes de diferentes materiais biológicos (sangue, secreção traqueal, urina, ponta de cateter e secreção vaginal) de pacientes de um hospital público. 2-MATERIAIS E MÉTODOS Para avaliar a atividade hemolítica, um total de 30 cepas de Candida albicans isoladas de diferentes amostras clínicas foram utilizadas. Destas: sete amostras eram de sangue, seis de secreção traqueal, seis de secreção vaginal, sete de urina e quatro de ponta de cateter. As amostras pertencem a micoteca do Laboratório de Micologia Clínica do Laboratório de Análises Clínicas, Ensino, Pesquisa e Extensão (LACEPE) e foram coletadas de pacientes do Hospital Universitário do Oeste do Paraná (HUOP) no período de 2006 a A produção de hemolisinas foi avaliada utilizando uma modificação do ensaio em placa descrito por Manns et al.,(1994). Uma alçada da cultura de cada cepa foi inoculada em Ágar Sabouraund Dextrose (HIMEDIA) suplementado com 1 % de extrato da levedura, com função de otimizar seu crescimento, e incubadas à 37 por 24 horas. Em seguida foram preparadas suspensões em salina estéril de acordo com a escala 2 (dois) de McFarland. A partir dessas suspensões 10 µl foram retirados e inoculados em meio de cultura Ágar Sangue (meio base (HIMEDIA), constituído de Cloreto de Sódio (5g/L), Triptose (10g/L), Ágar (15g/L) e suplementado com 7% de hemácias de carneiro (LABORCLIN) e 3 % de glicose (SYNTH), previamente preparado, de modo a formar um local de inóculo circular de 5 milímetros de diâmetro. As placas foram inoculadas e incubadas a 37 C por 72 horas.

7 7 Paralelo a este procedimento 10 µl das suspensões foram colocadas em 500 µl de soro fetal bovino e incubadas por 24 horas à 37 C. Após a formação do tubo germinativo formados a partir das cepas, 10 µl foram retirados e inoculados em meio Ágar Sangue previamente preparado, de modo a formar um local de inóculo circular de 5 milímetros de diâmetro, em seguida as placas foram incubadas à 37 C por 72 horas. A presença de um halo translúcido distinto em torno do local do inóculo indicou atividade hemolítica positiva. Essa hemólise induzida foi categorizada de acordo com a nomenclatura microbiológica convencional, como: completa (beta), parcial (alfa) ou não hemólise (gama). Como controle de hemólise positiva total foi utilizado uma cepa de Staphylococcus aureus isolada em hemocultura. 3-RESULTADOS E DISCUSSÃO As leveduras do gênero Candida liberam fatores hemolíticos com o objetivo de disponibilizar fontes de ferro a partir da lise de hemácias no sítio da infecção no hospedeiro. Tal levedura possui a capacidade de utilizar ferro derivado de hemoglobina, por meio da produção de um fator responsável pela lise dos eritrócitos, uma habilidade compartilhada por C. tropicalis e representa uma vantagem adaptativa das espécies para o estabelecimento e proliferação de infecções em seus hospedeiros (MANNS et al., 1994). A figura 1 ilustra a hemólise total promovida por Candida albicans em meio Ágar Sangue após 72 horas de incubação a 37ºC.

8 8 Figura 1- Hemólise promovida por Candida albicans em meio Àgar Sangue, após 72 horas. Os testes de atividade hemolítica com cepas de Candida albicans sem tubo germinativo mostraram que 80% (24/30) destas produziram algum tipo de hemólise sendo que, 50% (12/24) promoveram hemólise alfa (parcial) e 50% (12/24) promoveram hemólise beta (completa) em Ágar Sangue (Tabela 01). Tabela 01: Atividade hemolítica de cepas de Candida albicans isoladas de diferentes amostras clínicas. Sem tubo germinativo (N/%) Com tubo germinativo (N/%) Origem α β γ α β γ N Secreção Traqueal 2 (33,3) 2 (33,4) 2 (33,3) 2 (33,3) 4 (66,7) - 6 Secreção Vaginal 6 (100) (16,7) 5 (83,3) - 6 Sangue 1 (14,3) 3 (42,85) 3 (42,85) - 7 (100) - 7 Urina 2 (28,6) 4 (57,1) 1 (14,3) - 7 (100) - 7 Ponta de 1 (25) 3 (75) (100) - 4 Cáteter Total 12 (40) 12 (40) 6 (20) 3 (10) 27 (90) - 30 hemólise). Legenda: α: alfa (hemólise parcial); β: beta (hemólise completa); γ: gama (não Luo et al.,(2001), estudaram 15 amostras de C. albicans e observaram que todas promoveram beta hemólise, resultados semelhantes fora obtidos por Yenisehirli et al., (2010), que observaram atividade hemolítica de 147 cepas de Candida albicans isoladas de diferentes amostras clínicas, as quais todas apresentaram hemólise completa. Por sua vez, outras espécies de Candida apresentam variados graus de hemólise.

9 9 Para França et al.,(2010), a ocorrência de hemólise nos sítios de infecção pode favorecer a proliferação da levedura. Tais autores relataram em um estudo a capacidade hemolítica de Candida tropicalis, isolada de distintas amostras clinicas, em promover hemólise, concordando com dados de Rörig et al., (2009), sobre as leveduras do gênero Candida, as quais demonstraram habilidade da espécie em disponibilizar potenciais de ferro a partir da lise de hemácias. A atividade hemolítica completa ou beta hemólise foi observada em 57% (4/7) em cepas de C. albicans isoladas de urina e 75% (3/4) das cepas provenientes de ponta de cateter. Por outro lado as cepas provenientes de secreção vaginal não apresentaram beta hemólise apenas hemólise parcial. Segundo Álvares et al., (2007), os tubos germinativos estão relacionados com os fatores de virulência da espécie em estudo, sendo que estas estruturas favorecem a aderência nos tecidos do hospedeiro. Após serem induzidas a tratamento prévio com soro fetal bovino, as 30 cepas formaram o tubo germinativo e 100% destas amostras apresentaram hemólise, das quais 90% hemólise completa e 10% hemólise parcial. A presença do tubo germinativo permitiu que, 83,3% das amostras analisadas provenientes de secreção vaginal apresentassem beta hemólise. Resultados tais que indicam um aumento na atividade hemolítica das cepas, o que foi verificado nas cepas de urina, sangue e ponta de cateter, apresentando atividade beta hemolítica em 100% destas cepas. Não há relatos de atividade hemolítica em cepas de Candida albicans com tubo germinativo. Estes resultados sugerem que com a formação do tubo germinativo ocorra um aumento na sua patogenicidade em virtude do aumento em sua capacidade hemolítica. 4-CONCLUSÃO As cepas de Candida albicans isoladas de distintas amostras clínicas apresentaram algum tipo de hemólise, quando submetidas a tratamento com soro fetal bovino formaram o tubo germinativo e aumentaram sua capacidade hemolítica.

10 10 São necessários novos estudos e parâmetros para avaliar o grau de virulência de cada um destes fatores para um melhor entendimento dos mecanismos, regulação e importância dentro dos processos infecciosos em relação à ocorrência do tubo germinativo e produção de hemolisinas como importantes fatores de virulência de Candida albicans. 5- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ÁLVARES, C.A.; SVIDZINSKI, T.I.E.; CONSOLARO, M.E.L. Candidíase vulvovaginal: fatores predisponentes do hospedeiro e virulência das leveduras. Jornal Brasileiro de Patologia e medicina Laboratorial. V. 43, n. 5, p , COLOMBO, A.L.; GUIMARAES, T. Epidemiologia das infecções hematogênicas por Candida spp. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V. 36, n. 5, p , FRANÇA, E.J.G.; FÁVERO, D.; SCREMIN, H.; OLIVEIRA, M.; FURLANETO- MAIA, L.; QUESADA, R.M. B.; FURLANETO, M.C. Hemólise produzida por Candida tropicalis isoladas de amostras clínicas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V. 43, n. 3, p , GIOLO, M.P.; SVIDZINSKI, T.I.E. Fisiopatogenia, epidemiologia e diagnóstico laboratorial da candidemia. Jornal Brasileiro de Patologia e medicina Laboratorial. V. 46, n. 3, p , LUO, G.; SAMARANAYAKE, L.P.; YAU, J.Y.Y. Candida Species Exhibit Differential In Vitro Hemolytic Activities. Journal of clinical microbiology. Vol. 39, n. 8, p , MANNS, J.A.; MOSSER, D.M.; BUCKLEY, H.R. Production of a hemolytic factor by Candida albicans. Infect and Immunity. V. 66, n. 11, MENEZES, E.A.; MENDES, L.G.; CUNHA, F.A. Resistência a antifúngicos de Candida tropicalis isoladas no Estado do Ceará. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V. 42, n. 3, p , MÍMICA, L.M.J.; UEDA, S.M.Y.; MARTINO, M.D.V.; NAVARINI, A.; MARTINI, I.J. Diagnóstico de Infecção por Candida: avaliação de teste de identificação de espécies e caracterização do perfil de susceptibilidade. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. V. 45, n. 1, p , RIBEIRO, E.L.; GUIMARRÃES, R.I.; INÁCIO, M.C.C.; FERREIRA,W.M.; CARDOSO,C.G.; DIAS, S.M.S.; NAVES, P.L.F. Aspectos das leveduras de

11 11 Candida vinculadas as infecções nosocomiais. Newslab. V. 64, n. 3, p , RÖRIG, K.C.O.; COLACITE, J.; ABEGG, M..A. Produção de fatores de virulência in vitro por espécies patogênicas do gênero Candida. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V.42, n.2, p , SIDRIM,J.J.C.; ROCHA,M.F.G.; Micologia Médica a Luz de Autores Conteporrâneos. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan S/A, 2004, 388 p. TAMURA, N.K.; NEGRI, M.F.N.; BONASSOLI, L.A.; SVIDZINSKI, T.I.E. Fatores de virulência de Candida spp isoladas de cateteres venosos e mãos de servidores hospitalares. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V. 40, n. 01, p , WINGETER, M.A.; GUILHERMETTI, E.; SHINOBU, C.S.; TAKAKI, I.; SVIDZINSKI, T.I.E. Identificação microbiológica e sensibilidade in vitro de Candida isoladas da cavidade oral de indivíduos HIV positivos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. V. 40, n. 3, p , YENISEHIRLI, G., BULUT, Y., TUNCOGLU, E. Phospholipase, proteinase and hemolytic activities of Candida albicans isolates obtained from clinical specimens. Mikrobivol Bul. V. 44, n. 01, p , 2010.