UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA HUMBERTO NESI

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1 UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA HUMBERTO NESI AVALIAÇÃO DO USO DE MEMBRANAS NA REGENERAÇÃO DE ALVÉOLOS EM DENTES RECÉM-EXTRAÍDOS: UM ESTUDO EM RATOS Tubarão 2012

2 HUMBERTO NESI AVALIAÇÃO DO USO DE MEMBRANAS NA REGENERAÇÃO DE ALVÉOLOS EM DENTES RECÉM-EXTRAÍDOS: UM ESTUDO EM RATOS Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências da Saúde, da Universidade do Sul de Santa Catarina, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Marcelo Tomás de Oliveira, Dr. Tubarão 2012

3 HUMBERTO NESI AVALIAÇÃO DO USO DE MEMBRANAS NA REGENERAÇÃO DE ALVÉOLOS EM DENTES RECÉM-EXTRAÍDOS: UM ESTUDO EM RATOS Esta dissertação foi julgada adequada à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências da Saúde da Universidade do Sul de Santa Catarina. Tubarão, 24 de setembro de Professor e orientador: Marcelo Tomás de Oliveira, Dr. Universidade do Sul de Santa Catarina. Professor: Gustavo Otoboni Molina, Dr. Universidade do Sul de Santa Catarina. Professor: Marco Aurélio Bianchini, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina.

4 Dedico este trabalho ao meu pai Joaquim Nesi, in memorian, que sempre me estimulou em persistir nos estudos, deixando aqui muita saudade, e um exemplo de honestidade, trabalho, retidão e amor a todas as coisas.

5 AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom de viver. A minha esposa Rúbia, pela ajuda e companheirismo em todos os momentos da elaboração desta obra, além do amor, dedicação e compreensão, foi decisiva para me ajudar a vencer os desafios dos anos recentes e uma excelente companheira. As minhas filhas, Eduarda e Luiza Helena, pela paciência em suportar momentos em que destilava mau-humor, cansaço e irritação. A minha mãe, D. Luiza, mulher forte, guerreira exemplo de luta e obstinação, que deu a seus 10 filhos condições de se desenvolverem com as mais valiosas virtudes humanas. Aos meus irmãos, irmãs, cunhadas e cunhadas, que sempre demonstraram um carinho especial por esta jornada que estava empreendendo. Aos meus colegas do mestrado, Fernando, Marcos, Jean, Rosso, Helena, Samantha e Romilton, que proporcionaram momentos inesquecíveis de alegria além do imensurável apoio moral nas horas difíceis. Ao meu amigo, orientador e Professor Marcelo, um obstinado na busca pelo saber. Seu estímulo, conselho e apoio foram vitais para que conseguisse chegar neste patamar. Ao colega e Professor Gustavo, sempre disposto em todos os momentos para executar, elaborar ou dirimir dúvidas no transcorrer dos trabalhos, exemplo de pessoa do bem. Ao Professor Luiz Kanis, pela disposição em ajudar, sempre engrandecendo o trabalho. Aos acadêmicos do curso de odontologia, que ajudaram no experimento em animais: Mariana, Fabiana, Gustavo e Heloisa. Aos demais professores do mestrado, pelo desprendimento em nos ensinar a ensinar. Às funcionárias Silvane e Franciéli, sempre prontas a nos ajudar. Enfim, a todos que de uma forma ou de outra participaram na elaboração deste trabalho. Muito obrigado!

6 RESUMO Objetivo: o objetivo deste estudo foi comparar o desempenho de diferentes tipos de membranas na infiltração de tecido conjuntivo em alvéolos de ratos pós-exodontia. Material e métodos: utilizaram-se 36 ratos divididos em quatro grupos (controle-gc, membrana teflon-gt, membrana de polipropileno-gp e membrana de celulose impregnada com doxiciclina-gcd). Os incisivos centrais superiores direito de cada animal foram extraídos e recobertos com a membrana selecionada exceção o controle onde não se utilizou membrana. Os animais foram sacrificados e obtiveramse lâminas da região da exodontia. Após a digitalização das amostras mensurou-se a profundidade de tecido conjuntivo invaginado. Resultado: não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p=0,0856) com desempenho superior das membranas de teflon em relação às demais. Conclusão: apesar de não haver diferença estatística significante, todas as membranas apresentaram um comportamento semelhante, onde se observou uma tendência de redução da profundidade de infiltração de tecido conjuntivo. Destacou-se o menor grau de infiltração observado no grupo das membranas de teflon. Palavras-chave: Regeneração óssea guiada. Membranas. Perda óssea.

7 ABSTRACT Objective: the aim of this study was to compare the behavior of different kinds of membrane over conjuntive tissue infiltration in the rat s aoveolus after extractions. Materials and methods: it was used 36 rats randomly divided in four groups (control- GC, Teflon membrane-gt, Polypropylene membrane-gp, Cellulose impregnated with doxiciclina-gcd). The upper right central incisor to each animal were extracted and recovered with selected membrane, excepted to control group where none membrane were used. The animals were sacrificed and laminas were obtained from each animal. After image digitalization the conjuntive invatination deep were measured. Results: there wasn t significative difference between groups (p value = 0,0856). Conclusion: All the membranes have reduced the depth of tissue infiltration. It should be noted the lowest degree of infiltration observed in the group of Teflon membranes. Keywords: Guided bone regeneration. Membranes. Bone loss.

8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Quadro 1 - Descritivo dos grupos e membranas utilizadas no estudo Imagem 1 - Desenho esquemático representativo de como foram realizadas as mensurações para comparação entre os grupos (D = comprimento em mm da maior profundidade encontrada) Imagem 2 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia e recobrimento do alvéolo com membranas de celulose impregnada em doxiciclina.. 24 Imagem 3 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia e recobrimento do alvéolo com membranas de polipropileno Imagem 4 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia e recobrimento do alvéolo com membranas de teflon Imagem 5 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia sem recobrimento do alvéolo por membranas (grupo controle)

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Representativa das médias e desvios-padrões dos resultados obtidos em cada grupo, e do valor de significância para analise estatística aplicada Tabela 2 - Representativa dos valores de profundidade de invaginação de tecido conjuntivo por amostra avaliada. Obs.: nd amostra perdida, onde houve perda dos animais no pós-operatório

10 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REPARO DO ALVÉOLO PÓS EXODONTIA REMODELAÇÃO DO REBORDO ALVEOLAR MANUTENÇÃO PÓS-EXODONTIA DO ALVÉOLO REGENERAÇÃO ÓSSEA GUIADA ( ROG) IMPLANTES IMEDIATOS ENXERTOS ÓSSEOS JUSTIFICATIVA OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAIS E MÉTODOS SELEÇÃO DA AMOSTRA PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS PREPARO DAS AMOSTRAS ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXO ANEXO A- Parecer do comitê de ética em pesquisa em animais da UNISUL... 35

11 10 1 INTRODUÇÃO Manter a arquitetura do osso alveolar durante o reparo pós-exodontia é um desafio a ser vencido. O processo de reparação alveolar está associado a uma remodelação tecidual que resulta em grande perda de volume ósseo (JAHANGRI, 1998). A reabsorção e o remodelamento do rebordo alveolar após a remoção do dente é um fenômeno natural da cicatrização, fisiologicamente indesejável e possivelmente inevitável que pode prejudicar a colocação do implante (LEKOVIC et al., 1998; YILMAZ; EFEOGLU; KILIC,1998). Esta situação é particularmente importante na região anterior da maxila, onde uma posição proeminente da raiz é geralmente acompanhada por uma parede vestibular extremamente fina e frágil que pode ser danificada durante a extração dentária (NEVINS et al., 2005). A perda óssea alveolar, nos doze meses subsequentes a extração dentária, está em torno de 40 a 60% do volume ósseo inicial, sendo que a perda vertical do rebordo alveolar tem sido mais acentuada na parede vestibular (ARAÚJO e LINDHE 2005; ARAÚJO,2009). Com o intuito de manter o osso alveolar, após a exodontia, estratégias têm sido adotadas para reduzir ou eliminar futuras intervenções cirúrgicas para aumento de rebordo, tais como: regeneração óssea guiada, enxertos ósseos, implantes dentários, utilizados separadamente ou associados (PROFF et al., 2006). 1.1 REPARO DO ALVÉOLO PÓS EXODONTIA Os contornos dos processos alveolares mudam continuamente após as extrações dentárias, porque ocorre reabsorção óssea e subsequente rearranjo estrutural (LAM, 1960). Este remodelamento acontece em duas fases. A reabsorção inicial é parte do processo de cicatrização e acontece mais rapidamente nos 3 primeiros meses (AMLER; JOHNSON; SALMAN,1960; LAM,1960; JOHNSON, 1969; SCHROPP et al., 2003 e PELEGRINE et al., 2010). Neste período, a neoformação óssea e quase a inteira perda de altura da crista alveolar acontecem simultaneamente com uma redução de aproximadamente dois terços da espessura do rebordo (JOHNSON, 1969; SCHROPP et al., 2003; ARAÚJO e LINDHE, 2005; VAN DER WEIJDEN et al., 2009). O processo continua nos 3 meses seguintes e,

12 11 entre 6 e 12 meses, parte deste osso neoformado sofre remodelamento de aproximadamente 50% e a redução em espessura do rebordo alveolar ocorre (SCHROPP et al., 2003). A segunda fase é contínua e mais lenta, ocorrendo ao longo da vida do indivíduo (LAM, 1960; VAN DER WEIJDEN; DELL ACQUA; SLOT, 2009). Foi a partir dos estudos de Amler, Johnson e Salman (1960) e Amler (1969) que se pode definir detalhadamente o processo de reparação alveolar em humanos. Estes estudos foram feitos em pacientes saudáveis, submetidos às exodontias. No processo de reparação, foram realizadas biópsias na porção central do alvéolo, com dois a três dias de intervalo, durante 50 dias. Foi determinada a sequência da reparação alveolar pós-exodontia: -1º dia: cessa hemorragia e formação do coágulo sanguíneo preenchendo alvéolo; -2º,3º dia: coágulo sanguíneo e formação do tecido de granulação; -4º dia: Substituição do coágulo sanguíneo por tecido de granulação. Início da formação de tecido conjuntivo e epitélio; -7º dia: substituição do tecido de granulação por tecido conjuntivo Início da formação de matriz óssea; -20º dia: presença de tecido conjuntivo, matriz óssea com alguma mineralização. Fusão do epitélio na oclusal; -40º dia : tecido conjuntivo, osso neoformado com mineralização parcial, ocupando 2/3 do alvéolo. Epitelização completa e madura. Fases fundamentais no processo do reparo alveolar, segundo Carvalho e Okamotto (1987): 1) Fase de Proliferação celular; 2) Fase de desenvolvimento do tecido conjuntivo; 3) Fase de maturação do tecido conjuntivo; 4) Fase de diferenciação óssea ou mineralização. Amler et al. (1960) e Amler (1969) observou nos cortes histológicos estudados que a neoformação do tecido ósseo inicia-se no ápice do alvéolo enquanto Boyne (1966) observou que a neoformacão óssea vinha a partir das paredes laterais.

13 12 No entanto Carvalho e Okamotto (1987) observaram que o processo de formação óssea é concêntrico principalmente às dispensas dos restos do ligamento periodontal. 1.2 REMODELAÇÃO DO REBORDO ALVEOLAR Remodelação do rebordo alveolar consiste na mudança da estrutura óssea do alvéolo dentário. Todo esse processo se dá simultaneamente ao reparo do alvéolo pós-exodôntico (ATWOOD, 1962). Por conseguinte, esta remodelação pós-exodontia resulta na redução do rebordo residual, como sendo uma importante entidade patológica oral (ATWOOD 1971). Este mesmo autor classifica os estágios da reabsorção no rebordo alveolar em: I antes da exodontia; II imediatamente pós-exodontia; III rebordo alto e arredondado; IV rebordo em forma de faca; V rebordo baixo e arredondado; VI rebordo negativo. Alguns autores relatam que a reabsorção óssea ocorre rapidamente nos primeiros 6 meses, continuando de forma mais lenta ao longo da vida (ATWOOD 1971; JANHANGIRI et.al,1998). Segundo esses mesmos autores a perda vertical do rebordo alveolar é mais acentuada na parede vestibular ocasionando uma mudança da crista do rebordo para uma posição mais palatal e/ou lingual (PIETROVISKI; MASSLER, 1967; ARAÚJO e LINDHE 2005). Vários fatores estão associados às causas da remodelação do rebordo alveolar: anatômicos, metabólicos, funcionais, protéticos, patológicos e traumáticos (ATWOOD 1962,1971). Acredita-se que a etiologia da remodelação óssea envolva mais de um dos fatores citados acima, tratando-se, pois, de um processo multifatorial. Sabe-se que a presença do rebordo alveolar está intimamente ligada a presença do elemento dental, portanto a atrofia por desuso é um consenso entre os autores, sendo a principal causa da perda de estrutura óssea (ATWOOD,1962,1972; IRINAKIS, 2006).

14 MANUTENÇÃO PÓS-EXODONTIA DO ALVÉOLO Sabe-se que as dimensões do rebordo são extremamente importantes, pois é mais vantajoso preservar a dimensão do mesmo pós-exodontia em vez de reconstruí-lo depois. Assim, a manutenção de suas dimensões ideais, vertical e horizontal, diminui a morbidade para o paciente (IASELLA et.al., 2003). Portanto, técnicas que assegurem em conjunto com a colocação de implantes dentários, parecem ser essenciais em manter suas estruturas, otimizando o sucesso da reabilitação estética e funcional (DARBY; CHEN; BUSER, 2009). Vários estudos têm sido realizados sugerindo métodos para facilitar a formação óssea em alvéolos de dentes recém-extraídos, minimizando dessa forma a perda de altura e espessura do vestíbulo lingual (PELEGRINE et al., 2010). Estes estudos com regeneração óssea guiada com ou sem material de enxerto (BARONE et.al., 2008), enxertos com substituto ósseo (IASELLA et.al., 2003), plasma rico em fatores de crescimento (ANITUA, 1999), colocação imediata de implantes em alvéolos pós-exodontias, esta com resultados controversos (BOTTICELLI et al., 2008; ARAÚJO; WENNSTROM; LINDHE, 2006). 1.4 REGENERAÇÃO ÓSSEA GUIADA (ROG) A regeneração óssea guiada foi introduzida como uma técnica terapêutica que busca a nova formação do tecido ósseo reabsorvido através do uso de membranas (DAHLIN et al, 1988). A definição de regeneração óssea guiada foi elaborada com base no princípio da regeneração tecidual guiada, onde certos tecidos se regeneram quando células com esta capacidade povoam o defeito durante o reparo, sendo assim a exclusão mecânica do tecido mole permite que células osteogênicas estimulem a formação de tecido ósseo (BOYNE,1966). As membranas comumente são confeccionadas por materiais classificados em reabsorvíveis e não reabsorvíveis, independentemente disto, estas devem apresentar biocompatibilidade, semipermiabilidade clínica e capacidade de manutenção do espaço. Apesar das membranas não reabsorvíveis serem mais utilizadas para a regeneração óssea, o fato de requerer uma segunda intervenção cirúrgica levou o desenvolvimento de materiais reabsorvíveis. Mas, o tempo para

15 14 degradação dos diferentes materiais é difícil de ser controlado, o que pode comprometer a cicatrização e o processo de regeneração, assim, a membrana de politetrafluoretileno expandido (PTFEe) ainda é vista como o padrão áureo, e portanto os novos materiais deveriam ter os seus resultados comparados aos do PTFEe. (HAMMERLE; JUNG, 2003). As membranas não reabsorvíveis podem ser constituídas por politetrafluoretileno expandido (PTFEe), PTFE reforçado com titânio, PTFEe de alta densidade, ou malhas de titânio (JOVANOVIC; NEVINS, 1995; BARTEE, 2001; IRINAKIS, 2006) e as de polipropileno (SALOMÃO; ALVAREZ; SIQUEIRA, 2010). As membranas de polipropileno em forma de tela são utilizadas em medicina e esse material é considerado biocompatível, sem consequências deletérias ao organismo. Seu uso na cavidade oral contribui para estabilizar o coágulo e regenerar o rebordo alveolar pós-exodontia (SALOMÃO E SIQUEIRA, 2009). Já as membranas reabsorvíveis são divididas em duas categorias: naturais e sintéticas. As naturais são feitas de vários tipos de colágeno de origem animal. As sintéticas são à base de polímeros, como o poliéster alefático, o ácido polilático (PLA) e o ácido poliglicólico (PGA) ou de copolímeros como o ácido polilático-co-glicólico (PLGA) (IRINAKIS, 2006). Atualmente a membrana de celulose, outro tipo de membrana não reabsorvível vem sendo utilizada para diversos fins: substituta de pele, curativo de feridas cirúrgicas de papilas mamárias de vacas, curativo para cirurgia periodontais, reconstrução vascular e substituta da dura- máter (DAHLIN, 1988). A barreira física a base de celulose é considerada uma membrana biosintética. Ela é sintetizada pela bactéria acetobacter xylinum pelo processo de fermentação, a camada de redes de microfibrilas de celulose cristalina prensadas, metabolizadas pelas bactérias conferem rigidez a membrana (DAHLIN, 1988). A membrana de celulose é desenvolvida em âmbito nacional e devido a sua biotecnologia tem a vantagem de ser de baixo custo (IMBRONITO; CHAVEZ; TODESCAM, 2001). Os procedimentos de preservação do alvéolo dental pós-extração tem sido testado por diferentes estudos com utilização de membrana associada a enxertos ou apenas membrana, mostrando redução das alterações no rebordo comparadas com extração. Segundo esse modelo experimental comparou-se a

16 15 ROG com utilização de osso particulado de origem suína e membrana colágena com simples extração em 40 pacientes. Os resultados demonstraram que a técnica de preservação limitou significantemente a reabsorção do tecido ósseo após a extração comparado aos casos onde não foi realizado ROG. Além disso, análise histológicas mostraram porcentagem superior de trabeculado ósseo e tecido mineralizado nos sítios testes comparados aos controles, simples extração, após 7 meses das extrações dentárias (BARONE et al, 2008). A preservação após as extrações também foi avaliada sem a utilização de enxerto ósseo. Um total de 276 extrações (276 pacientes) apenas uma membrana de PTFE densa (PTFEd) foi utilizada. Os parâmetros clínicos foram obtidos pósextração e 12 meses após a cirurgia. A biópsia de tecido ósseo foi colhida em 10 casos representativos durante a instalação dos implantes após 12 meses da ROG. Uma significante regeneração óssea nos alvéolos pode ser percebida nas análises histológicas (HOFFMANN et al, 2008). 1.5 IMPLANTES IMEDIATOS A colocação imediata de implantes em alvéolos de dentes recémextraídos também tem sido indicada, porém com resultados controversos (ARAÚJO; WENNSTROM; LINDHE, 2006; BOTTICELLI et al, 2008). Esta técnica pode ter resultados negativos pela falta de fechamento de tecido mole, presença de infecção e defeitos entre o tecido ósseo e os implantes (PELEGRINE et al, 2010). Em estudos clínicos recentes e pré-clínicos, constatou-se que implantes colocados em alvéolos de dentes recém-extraídos falharam em evitar a remodelação óssea que ocorre nas paredes dos alvéolos, especialmente na parede vestibular, o que resulta em uma perda marginal de ósseo-integração (PELEGRINE et al., 2010; ARAÚJO; WENNSTROM; LINDHE, 2006). Alguns autores em seus experimentos concluíram que a espessura da tábua óssea vestibular tem uma influência significante em determinar a quantidade de reabsorção, sendo que o mínimo de 2mm de espessura tem sido sugerido para que se mantenha instável (SPRAY et al, 2005; HUYNH-BA et al, 2010). Recomenda-se um espaço de pelo menos 1mm entre a tábua óssea e o implante para indicar o uso de ROG ou preenchimento ósseo (LANG et.al, 2007). Estudos clínicos mostraram que, mesmo no uso de diferentes técnicas

17 16 regenerativas, a remodelação da parede vestibular continua, mas em quantidade menor (CHEN; DARBY; REYNOLDS, 2007). 1.6 ENXERTOS ÓSSEOS O uso de materiais de enxerto em alvéolos de dentes recém-extraídos tem sido questionado porque eles podem vir a interferir no processo normal de cicatrização (SERINO et al, 2008; DE COSTER; BROWAEYS; DE BRUYN, 2009). Partículas residuais do material enxertado podem ser encontradas circundadas em tecido conjuntivo ou tecido ósseo, no interior dos alvéolos, até 6 a 9 meses após sua inserção (NEVINS et.al, 2005; BUSER et al., 1998). Esta interferência está interligada ao processo de reabsorção destes materiais enxertados nos sítios dos implantes, que envolvem uma resposta de células gigantes a um corpo estranho com ativação em um estágio posterior de um processo osteoclástico (SERINO et al, 2008). A formação do tecido ósseo no interior do alvéolo enxertado não pode ser demonstrada histologicamente em humanos antes de 6 meses de cicatrização. A demonstração de profundidade de sondagem de bolsa reduzida e a imagem radiográfica dos materiais de enxerto têm extrapolado os achados histológicos de animais, e podem levar a uma falsa conclusão que o enxerto foi ósseo incorporado (NORTON; WILSON, 2002). Um material para ser utilizado na regeneração óssea deve ter como característica ao menos uma das três funções básicas: osteogenicidade, osteocondução e osteoindução. Atividade osteogênica é a formação do tecido ósseo a partir de células vivas, isto ocorre quando osteoblastos viáveis são transplantados na área a ser regenerada (PERRY, 1999). Já a propriedade osteocondutora fornece um arcabouço estrutural durante a regeneração óssea. Esta função é análoga a um andaime. E, capacidade osteoindutiva é a habilidade de recrutar células-tronco mesenquimais do leito receptor e levá-las a se diferenciarem em osteoblastos (PERRY, 1999).

18 17 2 JUSTIFICATIVA Visto que as dimensões do rebordo são tão cruciais, seria vantajoso preservá-lo pós-extração em vez de reconstruí-lo depois, assegurando assim a manutenção das suas dimensões ideais, vertical e horizontal, diminuindo a morbidade para o paciente (IASELLA et al., 2003). Desta forma métodos que asseguram a preservação, o aumento ou a reconstrução da altura, espessura e qualidade do rebordo alveolar imediatamente após a extração dentária com procedimentos de regeneração óssea, parecem ser essenciais para manter suas dimensões verticais e horizontais. Isto reduziria de fato a necessidade de um enxerto tardio, simplificando e otimizando o sucesso da reabilitação in loco (DARBY; CHEN; BUSER, 2009). Além disso, salienta-se que poucos trabalhos sobre o tema foram encontrados na literatura avaliando estes aspectos, e resultados neste sentido podem apontar novas perspectivas de pesquisas ou até mesmo de formas de tratamento utilizando as membranas em questão em pacientes com perdas dentárias. Estes poderiam assim, contribuir futuramente no tratamento e obtenção de melhores resultados clínicos dos mesmos, minimizando o desfecho desfavorável destas sequelas.

19 18 3. OBJETIVO 3.1 GERAL Avaliar um novo tipo de membrana (membrana de celulose impregnada em doxiciclina) que busque contribuir para melhorar o prognóstico pós-operatório da estrutura óssea alveolar pós-exodontia. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Comparar o desempenho histométrico em ratos de diferentes membranas na remodelação óssea pós-exodontia; Mensurar o tecido conjuntivo invaginado no alvéolo; Testar uma nova membrana.

20 19 4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 SELEÇÃO DA AMOSTRA Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com os princípios éticos para pesquisas em animais, conforme parecer aprovado pelo Comitê de Ética em Animais da Universidade do Sul de Santa Catarina (Anexo 1). Para a realização deste estudo, foram selecionados 36 ratos (Rattusnorvergicus, Albinus, Wistar) machos, com peso entre 180 e 200 gramas, e idade variando entre 50 e 70 dias, provenientes do biotério geral da Universidade do Sul de Santa Catarina - Campus Tubarão. Estes foram mantidos em gaiolas individuais semimetabólicas em condições controladas de iluminação (12 horas de luz/12 horas de escuro) e temperatura (21 a 25 C) e alimentados com ração sólida balanceada. Estes animais foram divididos em 4 grupos. Os três primeiros grupos foram submetidos à cirurgia de exodontia seguida de regeneração óssea guiada, em alvéolo de dente recém-extraído, pelo uso de membranas. O grupo controle foi submetido à cirurgia de exodontia pelo método convencional, ou seja, sem uso de membranas. O quadro 1 apresenta as membranas utilizadas no presente estudo. Duas são produtos comercializados e uma desenvolvida nos laboratórios de química industrial da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL). Quadro 1 - Descritivo dos grupos e membranas utilizadas no estudo. Grupo Fabricante Composição básica 1 (GCD) Teste (UNISUL) celulose impregnada em doxiciclina 2. (GP) INP(Bone heal) Polipropileno 3 (GT) Gore-tex (PTFE) Teflon Fonte:Elaboraçõa do autor, Para a membrana de celulose (teste) utilizaram-se os seguintes materiais: Acetato de celulose butirato (ACB) (AldrichChemistry), policaprolactona-triol (PCL-T)

21 20 (AldrichChemical), doxiciclina (Dx) (Henrifarma Produtos Químicos e Farmacêuticos LTDA). O processo de obtenção destas membranas seguiu as recomendações de Marques e Kanis (2012). As proporções de ACB/PCL-T/Dx (8:2:1), as quais foram solubilizadas em 20 ml de acetona a temperatura ambiente. Após a dissolução total, a solução foi vertida sobre placa petri e, essas foram colocadas em capela de fluxo sob temperatura ambiente para a evaporação total do solvente até a formação da membrana. Já as membranas controle Teflon (Gore-tex PTFE) e Polipropileno (INP, Bone heal) são produtos comerciais e foram cedidas pelos fabricantes para o presente estudo. 4.2 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS Para a realização dos procedimentos cirúrgicos inicialmente anestesiaram-se os animais com quetamina + cloridrato de xilazina à 2%. A via de administração foi intraperitoneal e a dosagem 0,3ml para cada 100 gramas de peso corporal. Utilizou-se também anestesias locais infiltrativas de Mepivacaína 2% com epinefrina 1:100000, com finalidades hemostáticas e para melhor manipulação dos ratos, estes foram sedados pela inalação de éter sulfúrico. Após a antissepsia extraíram-se os incisivos superiores direito de cada um dos animais. Para tal, utilizou-se uma alavanca reta especialmente desenvolvida para aplicação nos animais. Ato contínuo a exodontia, os alvéolos dos dentes extraídos foram curetados, e lavados com soro fisiológico. Independentemente do grupo a que pertenciam à sutura foi feita com fio de nylon 5,0 de agulha de secção triangular de 1,5cm. Excetuando-se o grupo controle, onde se procedeu apenas a sutura dos bordos gengivais, cada animal de acordo com o grupo a que pertenciam, tiveram a área cirúrgica recoberta pela membrana selecionada, junto ao periósteo. No grupo onde estava prevista a antibioticoterapia os animais receberam penicilina, na dosagem 0,2 ml para cada 100 gramas de peso corporal. No pós-operatório imediato, foi utilizado antibiótico sistêmico, intramuscular, Pentabiótico (0,5ml/kg).

22 PREPARO DAS AMOSTRAS Após 30 dias dos procedimentos cirúrgicos experimentais, os animais foram sacrificados por inalação de éter sulfúrico+ pentobarbital sódico a 3 %, na dose 150mg/kg, por via intraperitoneal, sendo os 4 grupos sacrificados em um mesmo período. Os animais foram decapitados e as mandíbulas separadas das maxilas, em seguida, com auxílio de uma lanceta, separou-se a maxila esquerda da maxila direita, realizando uma incisão na altura do plano sagital mediano, acompanhando a sutura intermaxilar. Um corte com tesoura reta foi realizado, tangenciando a face distal dos molares, com a finalidade de obter o alvéolo experimental e suas estruturas anexas. A seguir as amostras foram descalcificadas por 4 dias em solução de citrato de sódio a 20% e ácido fórmico a 30%, lavadas por 24 horas em água corrente, desidratadas, diafanizadas. Incluíu-se em parafina de maneira a permitir cortes seriados longitudinais no sentido vestíbulo-lingual. Corou-se com hematoxilina-eosina. Removeram-se as amostras das áreas cirúrgicas em blocos (alvéolo e tecidos circunvizinhos moles e duros). A seguir, as amostras foram descalcificadas por 4 dias em solução de citrato de sódio a 20% e ácido fórmico a 30%, lavadas por 24 horas em água corrente, desidratadas, diafanizadas. Incluíram-se os blocos em parafina, posicionados de maneira a permitir cortes longitudinais de 6µm de espessura, os quais foram corados por hematoxilina-eosina (HE). Foram obtidas 108 lâminas com três cortes cada uma. 4.4 ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA Para análise histométrica foi selecionada uma imagem de cada animal (corte central). Com auxilio de uma lupa Carl Zeis Stemi DV4 sob aumento de 8 vezes, a qual acoplou-se uma câmera digital (Canon EOS Rebell), capturou-se uma imagem de cada lâmina selecionada. Estas imagens foram levadas a um computador e inseridas num software chamado Image J (Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA), onde se mensurou a maior profundidade de tecido conjuntivo invaginado nos alvéolos, a partir da crista óssea alveolar (Imagem 1).

23 22 Imagem 1 - Desenho esquemático representativo de como foram realizadas as mensurações para comparação entre os grupos (D = comprimento em mm da maior profundidade encontrada). Fonte: Elaboração do autor, Os resultados relativos à maior profundidade de penetração de infiltrado conjuntivo medido a partir da crista óssea alveolar foram dispostos em uma planilha excell e analisados estatisticamente pelo teste ANOVA one way e ao teste Tuckey para comparações entre os grupos, ao nível de significância de 5%.

24 23 5. RESULTADOS Os resultados relativos à média dos grupos pesquisados estão dispostos na tabela 1. Nela pode-se observar que apesar da redução nas médias de infiltração tecidual, ocorrida em todas as membranas testadas, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. Tabela 1 - Representativa das médias e desvios-padrões dos resultados obtidos em cada grupo, e do valor de significância para analise estatística aplicada Grupo GCD GP GT GC Mean 1,57 1,67 1,42 2,67 Std. Deviation 0,55 1,33 0,38 1,85 Anova one way - p value 0,0856 Fonte: Elaboração do autor, A tabela 2 apresenta todos os valores mensurados em cada grupo, onde se obteve as médias apresentadas na tabela 1. Tabela 2 - Representativa dos valores de profundidade de invaginação de tecido conjuntivo por amostra avaliada. Obs.: nd amostra perdida, onde houve perda dos animais no pós-operatório. CONTROLE POLIPROPILENO DOXACICLINA TEFLON 1 1,484 1,03 1,156 0,59 2 4,746 3,5 1,413 2,09 3 2,95 1,9 1,575 1,09 4 2,238 1,3 1,033 2,16 5 1,879 2,9 1,231 1,8 6 1, ,196 1,4 7 1,084 0,3 1,38 0,8 8 4,939 2,4 Nd Nd 9 2,727 1,7 Nd Nd Fonte: Elaboração do autor, 2012.

25 24 As figuras de número 2 ao número 5 apresentam imagens selecionadas em cada grupo pesquisado. Imagem 2 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia e recobrimento do alvéolo com membranas de celulose impregnada em doxiciclina. Fonte: Elaboração do autor, Imagem 3 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia e recobrimento do alvéolo com membranas de polipropileno. Fonte: Elaboração do autor, 2012.

26 25 Imagem 4 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia e recobrimento do alvéolo com membranas de teflon. Fonte: Elaboração do autor, Imagem 5 - Lâmina obtida de corte do alvéolo de ratos submetidos à exodontia sem recobrimento do alvéolo por membranas (grupo controle). Fonte: Elaboração do autor, 2012.

27 26 6. DISCUSSÃO Manter a arquitetura do rebordo alveolar é fundamental para uma reabilitação satisfatória seja no aspecto funcional e/ou estético. A regeneração óssea guiada tem sido sugerida como alternativa para manter o osso alveolar, após a exodontia. Esta se baseia na seleção tecidual na área do reparo. A utilização de barreiras mecânicas, tais como, as membranas parecem favorecer este processo. A tabela 1 apresenta o desempenho de três tipos de membranas quanto ao controle de invaginarão tecidual para o interior do alvéolo pós-exodontia. Nela pode-se observar que apesar de não haver significância estatística, um comportamento mais favorável, com médias de infiltração menores foi obtido para qualquer um dos tipos de membrana testados. Estes resultados são corroborados por diversos autores (BUSER,1998; SALOMÃO, 2009). Outro detalhe a ser observado na tabela 1 diz respeito ao comportamento uniforme quanto ao desempenho das membranas pesquisadas. Atualmente existem diversos tipos de membranas disponíveis no mercado. As mais utilizadas e que servem como padrão de referência são as não reabsorvíveis, mais especificamente teflon (PTFE) e polipropileno. Razão pela qual, estas foram avaliadas no presente estudo. Além destas, utilizaram-se membranas de celulose impregnadas com antibiótico tipo doxiciclina, desenvolvidas no laboratório de tecnologia farmacêutica. A composição básica desta membrana é de acetato de celulose butirato (70%) e policatrolactona-triol (30%), o que confere além da resistência mecânica, adequada tolerância biológica, características manipulatórias e econômicas extremamente interessantes. No caso destas membranas impregnou-se antibiótico do tipo doxiciclina, isto se deveu ao fato de que em estudos prévios observou-se a manutenção das propriedades, além da redução do processo inflamatório no entorno da membrana e a consequente diminuição da colonização bacteriana sobre a mesma. A escolha por este antibiótico, o qual é um derivado sintético da tetraciclina, deveu-se ao fato de sua compatibilidade com a celulose permitindo sua difusão através da mesma. Além disso, estes medicamentos possuem um amplo espectro de ação, e atuam contra microrganismos aeróbicos e anaeróbicos, gram-

28 27 positivos e gram-negativos, os quais colonizam frequentemente a cavidade bucal (BORGES, 2008). Pesquisas em animais, como o presente estudo apresentam limitações. Entretanto o uso de animais, como os ratos, tem como vantagem a fácil manipulação, baixo custo e uma resposta tecidual baixa e eficiente. Especialmente quando se trabalha nas regiões crânio-mandibulares. Assim sendo, inúmeros trabalhos sobre cicatrização e reparação de tecidos ósseos utilizam ratos como modelo experimental (NANAMI et al, 2011). Apesar de nossos resultados apontarem na direção de que o uso de membranas pode trazer resultados positivos ao reparo ósseo, estes devem ser vistos com ponderação. Devem-se considerar as limitações do presente estudo e direcionar pesquisas no sentido de solucionar as dúvidas que permanecem a respeito do assunto. Neste caso pode-se relacionar desde dúvidas quanto ao tipo ideal de membrana, objeto de nosso estudo, quanto a melhoramentos da composição das existentes, tais como a impregnação com produtos medicamentosos que facilitem o processo cicatricial, ou até a definição da melhor técnica de aplicação. A impregnação das membranas com produtos medicamentosos é uma proposta nova que este estudo apresenta. No caso foi adicionado um antibiótico, mas sugere-se que outros produtos sejam avaliados, tais como: antissépticos, analgésicos, anti-inflamatórios entre outros. Especificamente, quanto à técnica de aplicação, cabe destacar a pertinente discussão na literatura sobre onde deve ser posicionada a membrana. No presente estudo, a membrana ficou totalmente submersa no tecido conjuntivo, fixada junto ao periósteo, seguindo o recomendado por Lundgren et al. (1998), que sugerem o recobrimento total por tecido mole, onde reduzir-se-á a contaminação bacteriana, principalmente aquela resultante do acúmulo de placa sobre a membrana. Entretanto, autores como Barboza et al. (2010), Salomão e Siqueira (2009) e Barber et al. (2007), relatam que as membranas podem ficar intencionalmente expostas ao meio bucal sem consequências deletérias no reparo. Preferencialmente, estudos com modelo de ensaios clínicos randomizados devem ser conduzidos de maneira a solucionar estes questionamentos in vivo, avaliando-se desde a resposta inflamatória dos tecidos

29 28 adjacentes ate a melhor técnica de aplicação clinica, esclarecendo dúvidas quanto ao sitio de colocação da membrana (exposta ou não ao meio bucal) e a maneira de estabiliza-la sobre o alvéolo.

30 29 7 CONCLUSÃO De acordo com a metodologia aplicada pode-se concluir que todas as membranas apresentaram um comportamento semelhante, onde se observou uma redução da profundidade de infiltração de tecido conjuntivo. Neste caso destacou-se o menor grau de infiltração observado no grupo das membranas de teflon.

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35 ANEXO 34

36 ANEXO A- Parecer do comitê de ética em pesquisa em animais da UNISUL 35