LEUCEMIA LINFOCÍTICA AGUDA: PERFIL LABORATORIAL E A IMPORTÂNCIA DA IMUNOFENOTIPAGEM NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
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- Arthur Philippi Pacheco
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1 1 LEUCEMIA LINFOCÍTICA AGUDA: PERFIL LABORATORIAL E A IMPORTÂNCIA DA IMUNOFENOTIPAGEM NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL Nelisa Luiza dos Santos*, Denise Oliveira Guimarães** Resumo As leucemias agudas são neoplasias hematológicas que se apresentam de duas formas, a leucemia linfóide aguda (LLA) e a leucemia mielóide aguda (LMA), e posteriormente são diferenciadas em subtipos. A LLA se caracteriza como o resultado do acumulo de precursores linfoides imaturos (linfoblasto) na medula óssea, e sangue periférico. Ela compreende 70% a 80% das leucemias agudas em crianças (entre 2 a 5 anos), e apenas 20% em adultos. Para seu diagnóstico e tratamento certas características clinicas e laboratoriais possui valor prognóstico e servem para distingui-las em grupos diferentes de risco. Para diagnóstico e classificação da LLA utiliza-se de análises morfológicas, citoquímicas, citogenéticas e imunofenotípicas. Métodos esses que apresentam diferentes especificidades e sensibilidade, destacando o ultimo como o método que eleva para 99% o percentual de casos corretamente classificados. Classificações juntamente com o diagnóstico em fase inicial da doença tem grande importância clínica principalmente porque define a terapêutica a ser empregada e a sobrevida do paciente. As pesquisas e trabalhos acerca de diagnósticos laboratoriais, são cada vez mais necessárias e pertinentes, visto que técnicas como essas são cada vez de maior constância em uma rotina laboratorial. Palavras-chave: imunofenotipagem; leucemia linfoide aguda; diagnóstico diferencial; citometria de fluxo; exames laboratoriais. ACUTE LYMPHOCYTIC LEUKEMIA: LABORATORY PROFILE AND THE IMPORTANCE OF IMUNOPHENOTHING IN DIFFERENTIAL DIAGNOSIS Abstract Acute leukemias are hematological malignancies that present in two forms, acute lymphocytic leukemia (ALL) and acute myeloid leukemia (AML), and are later distinguished in subtypes. ALL is characterized as the result of the accumulation of immature lymphoid precursors (lymphoblasts) in the bone marrow, and peripheral blood. It comprises 70% to 80% of acute leukemias in children (between 2 and 5 years), and only 20% in adults. For its diagnosis and treatment certain clinical and laboratory characteristics have prognostic value and serve to distinguish them in different groups of risk. For diagnosis and classification of ALL, morphological, cytochemical, cytogenetic and immunophenotypic analyzes are used. These methods present different specificities and sensitivity, highlighting the latter as the method that increases the percentage of correctly classified cases to 99%. Classifications together with the early diagnosis of the disease have great clinical importance mainly because it defines the therapy to be employed and the patient's survival. Research and work on laboratory diagnoses are increasingly necessary and pertinent, since techniques such as these are increasingly more constant in a laboratory routine. Keywords: immunophenotyping; acute lymphoid leukemia; differential diagnosis; flow cytometry; laboratory tests. *Acadêmica do 7º período do Curso de Biomedicina na Fundação Presidente Antônio Carlos FUPAC Uberlândia MG nelisa_luiza@hotmail.com ** Biomédica, Mestre em Ciências da Saúde pela Universidade Federal de Uberlândia-UFU, Profª. do Curso de Biomedicina na Fundação Presidente Antônio Carlos FUPAC Uberlândia-MG denise-og@hotmail.com
2 2 Introdução A leucemia é o câncer dos tecidos formadores de sangue e que decorre através da incapacidade de diferenciação das células blásticas, e envolve multiplicação e disseminação descontrolada de células anormais e imaturas. Células atípicas quanto a seus processos de diferenciação, maturação celular e proliferação, que podem levar a morte do indivíduo acometido (QUIXABEIRA; SADDI, 2008). A produção de células normais capacitadas para exercer suas funções, é impedida nesses casos pelo excesso de blastos na medula óssea (COSTA, 2016). O Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2018) estima que em um ano, sejam diagnosticados em média novos casos de leucemia em homens e em mulheres. Isso representa aproximadamente 10% de novos casos para cada 100 mil habitantes. Neoplasias hematológicas representa em média de 30% dos tumores que acometem indivíduos até os 15 anos. Diferencia-se e classifica uma leucemia de acordo com a célula de origem e seu grau de maturação (MICHEL, 2008). Existem diversas formas para a classificação das leucemias, que tem como finalidade primordial separar as leucemias mielóides (LM) das leucemias linfoides (LL), agudas e crônicas, principalmente quando há pouca ou nenhuma diferenciação entre os blastos (ZAGO; et al., 2013). Baseadas em métodos diagnósticos morfológicos, citoquímicos, citogenéticos e imunofenotípicos, conseguimos a distinção e assim a classificação das leucemias (PIER, 2008). Um dos diagnósticos existentes entre as leucemias de acordo com sua linhagem é a leucemia linfoide aguda (LLA), e é nessa classificação que se baseou esta pesquisa, LLA que compreende 70% dos casos em criança e é a forma mais comum de câncer na infância, descrita com o melhor prognóstico entre as leucemias se diagnosticada, classificada e tratada precocemente (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014). De acordo com o grupo Franco-Americano-Britânico (FAB), a LLA é dividida em tipo B e tipo T, e em subtipos L1, L2 e L3, porém a OMS (Organização Mundial da Saúde) não reconhece esses subtipos, classificando apenas em tipo B e tipo T (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014). Para determinar um diagnóstico conciso e o mais exato possível de uma leucemia, após achados no exame de hemograma, é utilizado análises morfológicas através do mielograma para classificação, e também a citoquímica das células imaturas que nos fornece várias informações e é fundamental para diferenciação entre LLA e a leucemia mielóide aguda (LMA). Contudo a
3 3 falta de detalhes exatos desses dois critérios e a dificuldade encontrada para classificar alguns pacientes têm levado à busca de outros parâmetros que não só diagnosticam, mas também classificam, diferenciam, e determinam grau de maturação celular (BAPTISTA, 2012). A análise de blastos para diagnosticar e diferenciar o tipo de leucemia linfocítica aguda (B ou T), e avaliar presença de alterações cromossômicas que podem vir a ser numéricas ou estruturais, é feita através da citogenética juntamente com a imunofenotipagem (PEZZINI; CASTRO, 2014). Quanto às classificações fenotípicas das células leucêmicas normalmente são feitas através do exame da imunofenotipagem por citometria de fluxo (CMF). Método que utiliza anticorpos monoclonais (AcMo), garantindo alta sensibilidade e especificidade, que permitem prognosticar o estágio de maturação celular. Dessa forma determina-se o tipo celular e posteriormente classifica-se o tipo de leucemia desenvolvido. Comparado a microscopia essa técnica apresenta diversas vantagens, além da alta sensibilidade e especificidade, é um exame rápido e preciso, sendo fundamental para o paciente aumentando as chances de sobrevida (COSTA, 2016). Diante disso temos que alterações cromossômicas (citogenética), quando associadas ao painel de imunofenotipagem, apresentam papeis relevantes no diagnóstico da LLA (FARIAS; CASTRO, 2004). Entender a importância da imunofenotipagem como exame diferencial para LLA torna-se ainda mais evidente diante das recentes pesquisas que constataram que o estudo imunofenotípico eleva para 99% o percentual de casos corretamente classificados e constitui a referência mais importante para a classificação das leucemias (SILVEIRA; ARRAES, 2008). Através de uma revisão bibliográfica, de artigos científicos datados entre os anos de 1985 e 2018, no banco de dados da SciELO (Scientific Electronic Library Online), BVS (Biblioteca Virtual em Saúde), e no site do Ministério da Saúde. Assim buscando entender como a aplicação da imunofenotipagem por citometria de fluxo em fase inicial da LLA traz consigo um prognóstico favorável para o paciente, aumentando sua sobrevida. E ainda descrever a origem da LLA e avaliar a eficiência das diversas formas diagnósticas existentes quando comparadas com imunofenotipagem por citometria de fluxo como exame diagnóstico diferencial para a patologia. Utilizando-se das palavras-chave: imunofenotipagem; leucemia linfoide aguda; diagnóstico diferencial; citometria de fluxo; exames laboratoriais. Para o profissional biomédico e a área de conhecimento envolvida nas análises clínicas, as pesquisas e trabalhos acerca de diagnósticos laboratoriais, são cada vez mais necessárias e pertinentes, visto que técnicas como essas são cada vez de maior constância em uma rotina laboratorial.
4 4 Referencial Teórico Hematopoiese Células sanguíneas são originadas de um processo denominado hematopoiese (Figura 1). Processo que a partir de um precursor comum pluripotente (stem-cell ou célula-tronco), origina células sanguíneas necessárias à vida humana. A hematopoiese é iniciada na fase embrionária, continuado em vida fetal e posteriormente (a partir da 24ª semana) na medula óssea (MO) é sua fase mais ativa até o fim da vida (BERTHO; FERRAZ, 2013). Células-tronco pluripotentes sofrem estímulos por citocinas específicas, as interleucinas e fatores estimuladores de colônias para dar origem aos precursores mielóides e linfoides, chamados também de células multipotentes diferenciadas, que por sua vez dão origem a monócitos, eosinófilos, neutrófilos, basófilos, eritrócitos, Natural Killer (NK) e os linfócitos (ARENAS, 2009). Figura 1- Formação das células sanguíneas em nível de Medula Óssea. Fonte: Disponível em: Portal São Francisco Biologia - Hematopoiese. Particularmente os linfócitos são conhecidos como um dos defensores do organismo, são células agranulares caracterizados por possuir núcleo regular e classificados em linfócitos B e
5 5 linfócitos T (HSU et al., 2016). Durante a fase de produção e maturação dos linfócitos B e T, respectivamente na medula óssea e timo, ocorre expressões de proteínas de membrana que permitem prognosticar o estágio de maturação celular e expressão dos receptores dos antígenos que são importantes tanto na produção, regulação, manutenção e liberação para a corrente sanguínea (CS) dessas células, aonde poderão ir para os órgãos linfoides secundários para cumprirem a função de atuantes em uma resposta imune contra antígenos circulantes (BRAND et al., 2009). Neoplasia hematólogica: leucemia A leucemia é o câncer dos tecidos formadores das células sanguíneas e que decorre através da indiferenciação das células blásticas ou proliferação de uma única célula durante a hematopoiese, envolve multiplicação e disseminação descontrolada de células anormais e imaturas que compromete o sistema normal da corrente sanguínea (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). Existem tipos diferentes de células, e, portanto, diversas formas de leucemias, principalmente quando há pouca ou nenhuma diferenciação entre os blastos, são neoplasias que diferem entre si com relação à linhagem celular comprometida, apresentação clínica e laboratorial, curso e resposta à terapia (ZAGO; et at., 2013). Diferencia-se e classifica uma leucemia de acordo com a célula de origem e seu grau de maturação. Através desses parâmetros temos cinco categorias de acordo com a Associação Brasileira de Leucemia e Linfoma (ABRALLE, 2009), e são elas: leucemia bifenotípica, leucemia mielóide crônica (LMC), leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia linfoide crônica (LLC) e leucemia linfoide aguda (LLA) que por sua vez tem o melhor prognóstico entre as cinco categorias (MICHEL, 2008). A doença é classificada como aguda e crônica, tomando-se como base o grau de maturação da população celular envolvida. Leucemias agudas são o tipo mais comum na infância (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). A distinção entre leucemias agudas e leucemias crônicas é feita através do comportamento de casos não tratados, o paciente invariavelmente irá a óbito em meses quando apresentada a forma aguda da doença, enquanto que o paciente poderá sobreviver por alguns anos, se no caso a doença se apresentar de forma crônica (PAN, 2011). As leucemias crônicas são caracterizadas por progressão lenta e por aumento de células maduras na corrente sanguínea, mas anormais. Geralmente acomete pessoas mais velhas
6 6 (BENNET, 1985). Já as agudas caracterizam-se pela multiplicação desordenada das células linfóides imaturas (linfoblastos) (LORENZI, 2002; LOGGETTO; BENITES, 2007). As leucemias agudas se apresentam de duas formas, a leucemia linfóide aguda (LLA) e a leucemia mielóide aguda (LMA), e posteriormente são distintas em subtipos, sendo o diagnóstico diferencial em fase inicial de extrema importância no prognóstico (DANTAS, et al., 2015). A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma doença grave, e no Brasil, as crianças e jovens com leucemia linfática aguda (LLA) entram em remissão completa da doença em 70% a 80% dos casos tratados precocemente (ALMEIDA, 2009). Leucemia linfóide aguda (LLA) Descrito como um distúrbio maligno das células progenitoras que afetam linfócitos maduros (T e B) e seus progenitores na medula óssea, a leucemia linfóide aguda apresenta início abrupto, com sinais e sintomas de depressão na medula óssea, e é o câncer que resulta do acometimento dos precursores hematopoiético linfoides (linfoblastos) em fase inicial de maturação e origina células incapazes de se diferenciar e com proliferação descontrolada, e em sua fase aguda pode levar o paciente a óbito em poucos meses (HAMERSCHLAK, 2012). A leucemia linfoide aguda (LLA), compreende 70% a 80% das leucemias agudas em crianças (entre 2 a 5 anos), e apenas 20% em adultos. A LLA é muito mais comum em pessoas brancas do sexo masculino. No Brasil, de novos casos de câncer abaixo de 15 anos, 6 são LLA. Dados apontam que crianças apresentam maior taxa de sobrevida (PAN, 2011). Segundo Michel (2008), As crianças do sexo masculino e indivíduos com ataxiatelangiectasia, trissomia do cromossomo 21, síndrome de Bloom e neurofribomatose tipo I tem maior susceptibilidade de desenvolver a doença. O percentual de cura da LLA é em torno de 80%, e isso decorre devido a melhora no diagnóstico em fase inicial, através dos diagnósticos diferenciais e utilização de tratamentos adaptados ao grupo de risco de cada paciente (DANTAS, et al., 2015). Os precursores hematopoiéticos linfoides os linfoblastos, em condições normais, sofrem processo de multiplicação e diferenciação progressiva até o estágio de linfócito maduro (FIGURA 2; FIGURA 3).
7 7 Figura 2- processo de multiplicação e diferenciação progressiva até o estágio de linfócito maduro Fonte: (PALMER, et al., 2015). Figura 3- amostra de sangue periférico com presença de linfócitos. Fonte: (PALMER, et al., 2015). A perda dessa capacidade de diferenciação e maturação associada a uma multiplicação desordenada faz com que essas células imaturas façam uma hipercelularidade na medula óssea e sangue periférico (FARIAS; CASTRO, 2004). Devido a essa invasão acentuada de células, a formação normal das células brancas (série granulocítica), vermelhas (série eritrocítica) como também das plaquetas (série megacariocítica) são comprometidas (COSTA, 2016). Esse tipo de leucemia advém dessa proliferação desordenada das células linfóides imaturas (linfoblastos) (FIGURA 4) (LORENZI, 2002; LOGGETTO; BENITES, 2007).
8 8 Figura 4 Células blásticas de paciente com LLA (aspirado de medula óssea). Proliferação desordenada das células linfóides imaturas (linfoblastos) Fonte: (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). Etiologia da LLA Não se sabe ao certo a etiologia das leucemias, vários autores, entretanto deixam claro que fatores ambientais e hereditários podem estar ligados a origem dessa doença, e também fatores vindos das interações entre hospedeiro e agentes químicos, físicos, biológicos e virais (MICHEL, 2008). Embora a sua causa não seja conhecida é muito provável que não resulte de um dano único, mas sim do acúmulo de vários processos (COSTA, 2016). A aquisição de múltiplas alterações genéticas nas células pré-leucêmicas altera o controle celular das mesmas causando acúmulos de clones B ou T imaturos na medula óssea, que suprime a hematopoiese normal, processo que pode acometer o indivíduo até mesmo na vida intrauterina (ALMEIDA, 2009). Sinais e sintomas da LLA Os principais sintomas da leucemia decorrem do acúmulo dessas células na medula óssea, prejudicando ou impedindo a produção dos glóbulos vermelhos (causando anemia), dos glóbulos brancos (causando infecções) e das plaquetas (causando hemorragias). Depois de instalada, a doença progride rapidamente, exigindo urgência no tratamento (CRIST; SMITHSON, 2001). A característica de manifestação clínica da LLA consistem em febre branda, adenomegalias, manifestações hemorrágicas, sudorese noturna, palidez, fadiga, dor óssea entre outros. A chamada tríade clinica das leucemias agudas e em especial a LLA, apresenta diminuição dos leucócitos funcionais, hemácias e plaquetas, assim o médico procede solicitando exames laboratoriais que o auxiliarão a corroborar com o clínico que o paciente
9 9 apresenta, e assim fechar o diagnóstico, decidindo por fim a melhor terapia para seu paciente (COSTA, 2016). Classificações LLA Classificações junto com o diagnóstico em fase inicial da doença tem grande importância clínica principalmente porque define a terapêutica a ser empregada (FARIAS; CASTRO, 2004). A LLA pode ser classificada de várias maneiras diferentes, as primeiras classificações feitas na década de 70 utilizavam-se de investigações citomorfológicas e citoquímicas (ALMEIDA, 2009). Essa neoplasia hematológica que acomete os linfoblastos e que podem ser tanto os linfócitos precursores B (pré B), quanto T (pré T), origina a classificação do grupo Franco- Americano-Britânico (FAB), que subdivide primariamente em tipo T ou tipo B pelas características imunofenotípicas dos linfoblastos, detectando-se o nível de diferenciação do processo leucêmico, e em subtipos L1, L2 e L3 (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014), que enfatizaremos e veremos mais adiante por ser o método mais utilizado para a classificação da LLA utilizando achados morfológicos, imunológicos e citogenéticos. Segundo Dantas e colaboradores (2015), LLA pré-b são responsáveis por mais ou menos 85% dos casos, enquanto 15% são representados por células pré-t. Em relação a morfologia e com base no diâmetro das células, protuberância dos nucléolos e quantidade de citoplasma, o grupo Francês-Americano-Britânico (FAB), desenvolveu a classificação das leucemias agudas. Classificando assim a LLA em três subtipos morfológicos (L1, L2, L3). Descritas e apresentadas na tabela abaixo. Tabela 1 Classificação morfológica (FAB) da Leucemia Linfóide Aguda Fonte: retirado de SILVEIRA; ARRAES (2008).
10 10 Descrevendo-os da seguinte maneira: - subtipo L1 os linfoblastos apresentam-se pequenos, com contorno nuclear regular, sem nucléolos, com pouco citoplasma, sem basofilia. (Figura 5), sendo o subtipo mais comum em crianças; e consiste em torno de 85% dos casos. - subtipo L2 (10% dos casos), os blastos apresentam células de tamanhos diversos cujo citoplasma varia de tamanho e basofilia, podendo apresentar nucléolos e irregularidades de contorno (Figura 6); - por último subtipo L3, apresenta células grandes com nucléolos, forte basofilia citoplasmática e vacúolos, sendo considerada a forma leucêmica do linfócito de Burkitt, com blastos mais raros, compreendendo de 1 a 2% das LLA (Figura 7). É uma variante da LLA de células B que necessita de um enfoque terapêutico especial (MICHEL, 2008). Figura 5 - Leucemia linfóide aguda, subtipo L1 células primitivas imaturas, pequenas, citoplasma escasso e núcleos arredondados regulares. Fonte: (ABRALLE, 2009). Figura 6 - Leucemia linfóide aguda, subtipo L2 células primitivas imaturas, que variam de tamanho e quantidade de citoplasma; basofilia variável; núcleos e contornos variados. Fonte: (ABRALLE, 2009).
11 11 Figura 7 - Leucemia linfóide aguda, subtipo L3; células primitivas imaturas com citoplasma de coloração azul intensa; numerosos vácuolos perinucleares pequenos; aspecto associado geralmente com o tipo de células B (LLA- B); Fonte: (ABRALLE, 2009). Mesmo a morfologia sendo o diagnóstico central da LLA, depois de anos passou-se a incorporar junto a ela outros critérios para um delineamento mais preciso da linhagem, sendo mais coerente com a realidade do paciente (ALMEIDA, 2009). Linfoblastos apresentam marcadores imunológicos denominados CDs (cluster of differentiation), um conjunto de moléculas marcadoras da superfície celular usado para diferenciar variados tipos de células, que permitem prognosticar o estágio de maturação celular e são específicos, então determina-se o tipo celular e posteriormente classifica o tipo de leucemia desenvolvido utilizando esses CDs, elevando o percentual de casos corretamente diagnosticados (COSTA, 2016). Tabela 2 Classificação imunofenotípica e as características imunológicas de LLA Fonte: Adaptado de (FARIAS, CASTRO 2004)
12 12 Diante desses critérios acima a LLA é assim classificada: través da morfologia e aprimorada de acordo com o painel imunofenotípicos para elevação do prognóstico favorável para o paciente, aumentando sua sobrevida (DONGEN; ORFAO, 2012). Diagnóstico da leucemia linfoide aguda Para o diagnóstico é necessário o médico correlacionar o exame clinico-fisico com exames laboratoriais como: hemograma, coagulograma, bioquímicas, sorologias, punção liquórica, desidrogenase lática, raio-x de tórax, esfregaço sanguíneo da medula óssea (mielograma), citogenética e imunofenotipagem por citometria de fluxo para diferenciação das linhagens leucêmicas, exames que são conclusivos para diagnosticar, e classificar a leucemia linfoide se feito em conjunto (DONGEN; ORFAO, 2012). Cada exame exibe sua importância para o diagnóstico da doença. Entretanto evidências deixam claro que a imunofenotipagem por citometria de fluxo (CMF) de acordo com a expressão de antígenos específicos, permite um diagnóstico bastante preciso e rápido, classificando até o nível de diferenciação dos blastos. Resultados dados por CMF constataram que o estudo imunofenotípico eleva para 99% o percentual de casos corretamente classificados e constitui o parâmetro mais importante para a classificação das leucemias (SILVEIRA; ARRAES, 2008) Hemograma Inicialmente o hemograma completo é o exame hematológico que primeiro aponta achados para suspeita da LLA, ele é um exame rápido e simples para a contagem global de células sanguíneas e que também avalia a qualidade dessas células (BAPTISTA, 2012). Devido à infiltração medular por células leucêmicas, mostrará alterações microscópicas na contagem e qualidade das células, porém não tem um padrão único, podendo revelar anemias normocíticas e normocrômicas, trombocitopenia (diminuição das plaquetas), normalmente uma leucocitose, casualmente uma leucopenia, sendo que nesse último os blastos são menos numerosos em sangue periférico e em uma leucocitose células blásticas chegam a constituir uma maioria (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). Linfoblastos são células em maioria em pacientes com LLA até mesmo em sangue periférico, porém esse exame sozinho não consegue nos dar critérios suficientes nem fenótipos necessários para determinação da leucemia linfocítica aguda, pois devido ao diagnóstico da LLA ser um processo complexo, muitas são as variáveis que parecem influenciá-lo, por possuir
13 13 aparições em hemograma muito inespecíficos semelhantes ao de outras patologias benignas e malignas comuns da idade (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). Fazendo-se necessário exames complementares para o diagnóstico (BEZERRA et al., 2011) Mielograma e Citoquímica Utilizado para avaliar a medula óssea e identificar alterações que nela existe (celularidade/maturação), o esfregaço de sangue medular (punção aspirativa com agulha apropriada em osso onde existe atividade hematopoética) é feito pois o diagnóstico e classificação da LLA fundamenta-se em critérios morfológicos e na demonstração e na presença de mais de 20% de linfoblastos na medula óssea de acordo com a classificação da OMS/2001, e blastos acima de 30% de acordo com o grupo FAB (BRAND et al., 2009). Uma medula óssea hipercelular, com substituição de elementos medulares normais por células leucêmicas, é uma característica presente em pacientes com LLA; Megacariócitos diminuídos ou ausentes são observados em nível de sangue medular, com precursores mielóides e eritróides residuais em normalidade, podendo assim diagnosticar uma leucemia linfoide aguda, mas não podendo sub classifica-la com clareza (DONGEN; ORFAO 2012). O biomédico microscopista que está apto a ler e analisar o esfregaço sanguíneo e/ ou medular deverá descrever as características morfológicas das células observadas indicando se há presença de blastos granulares ou agranulares, essa descrição é importante para que o médico hematologista possa laudar o exame e solicite exames mais específicos para classificação diferencial, pois esse exame também não exime critérios suficientes para determinar a subclassificação da patologia de acordo com painel imunofenotípico, que traz consigo um diagnóstico mais preciso e sensível, apenas classifica morfologicamente como vimos anteriormente, o material aspirado da medula óssea deve ser submetido a coloração citoquímicas (SILVEIRA; ARRAES, 2008). Utilizada como uma técnica de coloração para auxílio diagnóstico a Citoquímica consiste em usar importantes corantes para diferenciar as leucemias linfoblásticas agudas (LLA) das demais leucemias (TABELA 3) (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). O ácido periódico - Shiff (PAS), a peroxidase ou o Sudan Black B são alguns dos principais corantes utilizados. (BEZERRA at al., 2011). O glicogênio da célula é corado pelo PAS. Os linfoblastos frequentemente demonstram um padrão de positividade nas formas de anéis concêntricos ou em bloco grosseiro, sendo que na linhagem linfocítica B uma reação PAS positiva é mais frequente do que na de linhagem T. As reações de mieloperoxidase e Sudan black são úteis para estabelecer e confirmar diagnóstico
14 14 de LMA, já que são reações negativas nas leucemias linfóides e é fortemente positiva em células da série granulocítica e fracamente positiva em monócitos, definindo assim o diagnóstico das leucemias mielóides agudas (LMA) e a separando da LLA (BAPTISTA, 2012). Tabela 3 Reações citoquímicas que diferenciam as LLA das LMA Fonte: retirado de (OLIVEIRA; DINIZ; VIANA, 2004). Sendo assim utilizado para diferenciação apenas de LLA e LMA, nos dando critérios para apenas distinguir as duas leucemias agudas e não seus subtipos (SILVEIRA; ARRAES, 2008) Citogenética Convencional Outro exame necessário no diagnóstico de uma LLA para determinação de padrão genético da leucemia é a citogenética convencional, e outras técnicas de biologia molecular (HALLEK et al., 2008). As análises citogenéticas são preconizadas pela OMS pois leva a compreensão dos mecanismos envolvidos na malignidade e para encontrar genes de importância biológica. É um exame mais refinado que investiga as mutações cromossômicas pela análise do cariótipo e revela alterações de expressão gênica numéricas dos cromossomos pela determinação da ploidia ou alterações estruturais, entre elas as inversões, deleções, translocações (QUIXABEIRA; SADDI, 2008). Na LLA, assim como nas outras leucemias, a determinação do cariótipo é mais importante para a avaliação do prognóstico do que para diagnóstico diferencial (REGO; SANTOS, 2009). As células leucêmicas podem ser classificadas em hipodiplóides (<46 cromossomos), diplóides (46 cromossomos) e hiperdiplóides (> 46 cromossomos). As hiperdiplóides de
15 15 Linhagem B (> 50 cromossomos) são encontradas em torno de 20% das crianças com LLA e têm uma boa resposta clínica. As hipodiplóides têm pior prognóstico. Uma ou mais anormalidades cromossômicas são apresentadas em 70% dos casos de LLA. A mais comum destas é o Cromossomo Ph (Philadelphia), translocação dos braços longos dos cromossomos 22/9, encontrado entre 3-5% das crianças com LLA (HARRISON et al., 2010). O estudo da ploidia é de utilidade prognóstica, pois determina-se o genótipo das amostras com suspeitas de leucemia. A técnica nos oferece também outras informações como por exemplo, o estadiamento da neoplasia, evidencias de linhagem celular, entre outras, porém por ser um exame que utiliza material colhido diretamente da medula óssea o torna uma técnica invasiva, além do mais precisa-se fazer a coleta do material quando este estiver em processo de metáfase e que os cromossomos alcancem o máximo de condensação e alinhamento, pois senão torna-se de difícil visualização a presença das anormalidades (SILVEIRA; ARRAES, 2008) Imunofenotipagem por citometria de fluxo multiparamétrica (CMF) Quando se trata de diagnóstico diferencial e utilização de tratamentos adaptados ao grupo de risco de cada paciente a imunofenotipagem é fundamental para agregar ao diagnóstico morfológico a determinação da linhagem (B ou T) e estágio de maturação dos linfoblastos (DONGEN; ORFAO; 2014). Imunofenotipagem por CMF é um exame que consiste em diferenciação através de AcMo (anticorpo monoclonal), quando encontra-se células que são muitos semelhantes em seu aspecto físico quando observadas ao microscópio óptico, porém células que possuem diferentes moléculas em sua membrana ou citoplasma que as diferem uma das outras (COSTA, 2016). Vários estudos o descrevem como método diagnóstico que eleva a determinação diagnóstica correta para 99% dos casos, é indispensável para o entendimento, tratamento, prognóstico e acompanhamento da doença (REGO; SANTOS, 2009). Através da técnica de CMF conta-se, examina-se e é possível classificar partículas microscópicas e que são suspensas em meio liquido em fluxo, refere-se então citometria de fluxo multiparamétricas, pois é possível fazer avaliação simultaneamente de vários parâmetros (BAPTISTA, 2012). Vários descritores apontam que essa técnica possui objetividade, sensibilidade, rapidez e precisão na análise das características celulares, incluindo o conteúdo de DNA, detecção e quantificação de antígenos celulares, análise de resistência celular a drogas e a análise de conteúdo citoplasmático (PIER, 2008).
16 16 A realização desta técnica para diagnóstico de LLA, pode ser feita através de dois principais materiais biológicos: sangue periférico e medula óssea, por isso caracteriza-se como uma vantagem em comparação aos outros exames, mielograma e citogenética, podendo ser feita assim que se diagnostica o paciente, melhorando o diagnostico em fase inicial (SOUTO, 2011). É necessário a utilização de um painel de AcMo (anticorpo monoclonal) que pode ser criado a partir da suspeita de diagnóstico do médico especialista. A imunofenotipagem baseia-se na reação antígeno-anticorpo, utilizando-se anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014). O painel para fenotipagem das células leucêmicas consta na literatura que varia de um lugar para outro, contudo existem marcadores que são essenciais para a determinação da linhagem celular envolvida (COSTA, 2016). Então sugere-se um painel mínimo de combinações de anticorpos e fluorocromos para a imunofenotipagem, desenvolvido pelo grupo Euroflow, atualmente referência para os casos de neoplasias hematológicas o painel fenotípico para LLA-B expressa marcadores HLA-DR, TdT, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22c, CD79a/b, Kappa ou Lambda e IgM. Já o painel fenotípico de LLA-T expressa CD1a, CD2, CD4, CD45, CD45RA, CD99, HLADE, TCRαβ, TCRγδ, CD3 Cit/Sm (COSTA, 2016). São preconizados alguns itens para a execução da imunofenotipagem. Primeiramente precisa-se que as células da medula óssea, linfonodo ou do sangue sejam recém coletadas, para que desse modo produzam resultados em poucas horas. O material coletado deve ser cuidadosamente misturado com anticoagulante (EDTA, heparina ou ACD) e rapidamente transportado, em temperatura ambiente, para o laboratório que realizará a citometria de fluxo e preferencialmente, deve ser analisado até 24 horas após a coleta. Esse material deve ser separado para análises pelo gradiente de centrifugação (RAWSTRON, 2015). Inicialmente, de acordo com a expressão de antígenos específicos que as células leucêmicas apresentam e utilizando os paneis fenotípicos pode-se classificar a linhagem T ou B, e de acordo com as características imunofenotípicas dos linfoblastos caracterizamos o nível de diferenciação em que se encontra o processo leucêmico, isso é de grande importância pois dessa forma casos são classificados baseados nas características individuais de cada paciente e em fase inicial (CHIARETTI; ZINI; BASSAN, 2014). O citômetro de fluxo juntamente com o painel da imunofenotipagem permite que a amostra seja analisada de forma rápida e eficiente, com maior quantidade de detalhes, pois as células em suspensão passam em fileiras em fluido de revestimento dentro do citômetro, individualmente são analisadas através da dispersão da luz dos fluorocromos que tem como objetivo classificar as células de acordo com a sua morfologia e granulosidade (característica
17 17 intracitoplasmática) através dos AcMo, e logo após através de software específico identificar em uma mesma amostra populações celulares distintas com maior número de especificidade (QUIXABEIRA; SADDI, 2008). Segundo Chiaretti, Zini e Bassan (2014), a imunofenotipagem por citometria de fluxo, tornou-se um exame importantíssimo para determinação de diagnósticos corretamente classificados devido a sua alta sensibilidade e especificidade. Vários estudos têm demonstrado resultados satisfatórios na utilização dessa caracterização imunofenotípica da clonalidade celular, Iwamoto e colaboradores (2011), avaliaram através desse exame a expressão de antígenos em crianças com LLA. Foram observados que os marcadores CD3Cit e CD7 apresentaram positividade para todos os casos. E os antígenos CD2, CD5 e TdT, apresentaram-se em 80% das LLA-T. Esse resultado nos mostra o quanto houve um crescimento considerável na identificação e análises de estruturas biológicas de difícil visualização, quando se comparado por exemplo a microscopia. É de grande relevância utilizar a imunofenotipagem por CMF para elevar o percentual de casos corretamente classificados, é importante analisar melhor a natureza celular, e obter precisão nas análises (SILVEIRA; ARRAES, 2008). A análise precisa da região intra e extracitoplasmática das células, assim como a caracterização mais adequadas dos eventos imunológicos e moleculares fundamenta a saúde e a doença, com isso pode-se compreender melhor cada advento do processo leucêmico (NAOUM, 2001). Como este diagnóstico está cada vez mais presente dentro de grandes centros laboratoriais, Craig e colaboradores (2008), intitula a citometria de fluxo uma ferramenta importantíssima para a imunofenotipagem, e ressalta a importância de os profissionais biomédicos possuírem conhecimentos elevados sobre as características das linhagens celulares em estudo. Outra grande vantagem é que essa técnica possui uma ampla aplicação para o diagnóstico e investigação para fins de resultados de pesquisas (SILVEIRA; ARRAES, 2008). Entretanto também existem algumas desvantagens na técnica, dentre elas a perda celular (por fragilidade no momento da preparação) e trabalhar com material a fresco com um número considerável de células neoplásicas (NAOUM, 2001). Outra limitação e um grande desafio é encontrar profissionais treinados para realização do procedimento e padronizar protocolos para tornar o prognóstico menos confuso para o laboratorista (CRAIG, 2008). Mas vemos que nada é tão grande quando se comparada as vantagens dessa técnica rápida e precisa.
18 18 Conclusão Portanto, diante da revisão bibliográfica estudada para confecção deste artigo foi possível verificar os achados laboratoriais e eficácia dos diversos exames utilizados no diagnóstico da LLA. Cada exame exibe sua importância no diagnóstico de tal patologia, sendo que o diagnóstico específico laboratorial das leucemias linfoides agudas requer sempre a citologia, a citoquímica e a imunofenotipagem. Vemos através desse que tornou-se uma ferramenta indispensável o uso da imunofenotipagem por CMF para o diagnóstico e classificação da LLA, pois o método baseia-se na habilidade única de detectar anormalidades imunofenotípicas, determinar a imaturidade da população leucêmica e ainda a definição correta da linhagem celular e subtipos, em quantidades mínimas de amostras em sangue periférico ou medula óssea. Com isso casos de difícil diagnóstico conseguem ser esclarecidos e classificados, através de múltiplos parâmetros analisando regiões intra e extra citoplasmaticas, que a microscopia não consegue visualizar. O uso dos marcadores celulares tem papel importante por ajudar na determinação da estratégia a ser utilizada no tratamento, delineando mais precisamente a linhagem celular envolvida seu estágio de maturação, sendo mais coerente com a realidade do paciente. A imunofenotipagem e as técnicas citogenéticas têm contribuído de maneira fundamental para a compreensão da biologia molecular e do tratamento da LLA. Existem ainda muitos desafios a serem superados pela imunofenotipagem por citometria de fluxo, um deles senão o maior é padronizar protocolos e painéis imunofenotípicos, para tornar a técnica 100% eficiente, e atualizações de profissionais treinados, no mais é uma técnica sensível, rápida e específica, que aplicada em fase inicial traz consigo boas chances aos pacientes. A população biomédica ainda carece do entendimento mais profundo desta metodologia e do conhecimento dos marcadores antigênicos necessários para a alta qualidade da imunofenotipagem, por isso fica aqui minha sugestão para mais estudos referentes a métodos laboratoriais de diagnósticos diferencial da LLA. A interpretação dos resultados deve compreender a história clínica do paciente e os outros testes diagnósticos realizados. Pois, de um diagnóstico correto e preciso dependerá a escolha do tratamento adequado e o prognóstico da doença de cada paciente.
19 19 REFERÊNCIAS ABRALLE, 2009.; Associação Brasileira De Linfoma e Leucemia (ABRALLE). O que é leucemia. Disponível em: < Acesso em: 31 jan de ALMEIDA, T. J. B.; Avanços e perspectivas para o diagnóstico da Leucemia Linfóide Aguda Candombá [Internet], v. 5, n. 1, p Jan Jun ARENAS, G. C.; Plasma rico em plaquetas e fatores de crescimento. Bióloga. São Paulo, BAPTISTA, E. M. E.; Imunofenotipagem por citometria de fluxo f. Mestrado (Análises Clínicas e Saúde Pública Especialidade de Hematologia e Imunoterapia), Porto, Portugual, BENNET, J.M. The classification of the acute leukemia: Cytochemical and morphologic considerations. Neoplastic diseases of the blood, Ed PH. New York: Churchill, Livingstone, BERTHO, A. L.; FERRAZ, R.;. Citometria de fluxo: princípios metodológicos de funcionamento. In: Citometria de Fluxo; aplicações no laboratório clínico e na pesquisa. Editora Atheneu, São Paulo, BEZERRA, A.M.P.S. et al.; Correlation between flow cytometry and histologic findings: tem year experience in the investigation of lymphoproliferative diseases. Einstein, São Paulo, v. 9, n.2, p , BRAND, H. et al.; Leucemia de células T do adulto. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, Recife, v. 31, n. 5, p , abril, CHIARETTI, S.; ZINI, G.; BASSAN, R.; Diagnosis and subclassification of acute lymphoblastic leucemia. Mediterranean Journal of Hematology and Infectious Diseases, v. 6, n. 1, Oct COSTA, R. S.; Diagnóstico diferencial das leucemias linfóides através da imunofenotipagem por citometria de fluxo: revisão CRAIG, F. E. et al.; Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms: Review article. Blood, Pittsburg, v. 111, n. 8, p , CRIST, W.M., SMITHSON, W.A.; LEUKEMIAS. Fundamentos de Nelson tratado de pediatria, 2. ed. Espanã: Mc Graw-Hill Interamericana, 2001, p DANTAS, G. K. S., et al.; Diagnóstico diferencial da leucemia linfóide aguda em pacientes infanto-juvenis. Revista da Universidade Vale do Rio Verde, v. 13, n. 2, p. 3-18, 2015.
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