UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS RAFAEL ROSSETTO DE SOUSA EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA 1 (IGF-I), MEIO DE BASE, DA INSULINA E FSH SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS ISOLADOS FORTALEZA 2013

2 RAFAEL ROSSETTO DE SOUSA EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA 1 (IGF-I), MEIO DE BASE, DA INSULINA E FSH SOBRE O DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS BOVINOS ISOLADOS Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. FORTALEZA 2013

3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho Bibliotecário Responsável Francisco Welton Silva Rios CRB-3/919 S725e Sousa, Rafael Rossetto de Efeito do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-I), meio de base, da insulina e FSH sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos isolados / Rafael Rossetto de Sousa CD-ROM. 121 f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol. CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm). Tese (doutorado) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias, Fortaleza, Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. Co-orientação: Profa. Dra. Márcia Viviane Alves Saraiva. 1. Bovino. 2. Cultivo in vitro. 3. Folículo pré-antral. I. Título. CDD: 633

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5 A minha íntima família Elvio, Nívia, Júnior, Andressa e Gerlane por tudo que representam em minha vida. Com amor, dedico.

6 AGRADECIMENTOS Agradeço inicialmente à Universidade Estadual do Ceará, à Faculdade de Veterinária e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela oportunidade de adquirir conhecimento e qualificação profissional e pela estrutura fornecida para realização dos trabalhos de tese. Ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais (LAMOFOPA) da Universidade Estadual do Ceará, pela acolhida e todo suporte técnico estrutural que permitiram a execução do presente trabalho com eficiência e eficácia, garantindo inovação e tecnologia. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concepção de bolsa de estudo, indispensável para a realização desse trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), à Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo suporte financeiro à todos os projetos do laboratório. Aos meus pilares e principais incentivadores do meu sucesso, Elvio, Nívia, Júnior, pelo apoio por toda a vida, que foram, são, e serão o meu maior e melhor exemplo de vida. Aos meus familiares que incentivaram e me apoiaram nessa longa jornada, agradeço a Andressa, Fábio, Diana, Felipe e Daniel pela força e otimismo que me transmitem, pelo companheirismo, admiração e principalmente pelo enorme carinho. Ao amor da minha vida Gerlane com sua família, Liduína, Fernandes, Fernando e Rachel, que se fizeram presentes nessa jornada, agradeço pelo imensurável carinho, amor, dedicação e pela força de sempre. As minhas amigas que se tornaram irmãs, Viviane e Tamara, por toda a amizade, conselhos e auxílio emocional durante o doutorado, transmitindo-me a confiança necessária para realização dos meus sonhos, além dos ótimos momentos compartilhados. Aos meus amigos Luciana e Pedro pelos eternos momentos vividos juntos. As minhas amigas Isadora, Ivina e Giovanna por compartilharem momentos de lazer e projetos de doutorado, somado as brincadeiras e angústias acrescentando tempero de bons sentimentos à nossa amizade. Ao meu amigo Cleidson Manoel, pelo exemplo de profissionalismo e superação, por tudo que aprendi com seus questionamentos e indagações.

7 Ao orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo e Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, pela oportunidade de execução deste projeto. Especialmente pelo incentivo, paciência e orientação durante todos os anos de convivência. Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello, um dos professores mais incríveis que tive a honra de conhecer, agradeço pelos sábios conselhos e orientações, pelo exemplo de ética e respeito ao próximo e compromisso com a ciência em sua total essência. Ao Prof. Dr. Marcelo Bertolini, que acompanhou esta caminhada desde o início se mostrando sempre disposto a me ajudar e a contribuir com o meu aprendizado. Ao Prof. Dr. Helio Blume, um dos grandes incentivadores dessa minha longa jornada de doutorado. Acima de tudo, pela amizade e exemplo de profissional competente. A todos os colegas que fizeram ou ainda fazem parte do LAMOFOPA, Mororó, Vitor Galindo, Leonardo Pinto, Marcella Melo Pinto, Juliana Celestino, Jamily Bruno, Fabrício Martins, Roberta Chaves, Valdevane Araújo, Ana Beatriz Duarte, Debora Sales, Johanna, Deborah Padilha, Anderson Almeida, Hiédely Luz, Lívia Wanderley, Rebeca Rocha, Laritza Lima, Anelise Alves, Patrícia, Allana Pessoa, Francisco Leo, Emmanuel, Aglailson, Renato, Luana, Marcelo, Lindemara, pela amizade, apoio, incentivo e bons momentos convividos ao longo desses anos. Aos co-autores do meu projeto de doutorado, Márcia Viviane Alves Saraiva, Isabel Bezerra Lima-Verde, Isadora Machado Teixeira Lima, Luciana Rocha Faustino, Giovanna Quintino Rodrigues, Ivina Rocha Brito, sem vocês não seria possível executar este trabalho, muito obrigado pela amizade e auxílio durante o doutorado. Ao amigo e companheiro Antônio César Camelo, por toda a sua presença e alegria distribuída em todos os momentos desta longa caminhada. À dedicação e competência de Adriana Maria Sales Albuquerque que sempre se mostrou solícita em atender às minhas dificuldades prontamente. À banca examinadora, em especial ao Dr. Mário e Dra. Juliana, por terem aceito prontamente o convite e, sobretudo pela sua prestimosa colaboração ao corrigir o presente trabalho. Há muito mais a quem agradecer... A todos aqueles que, embora não nomeados, me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por suas presenças afetivas em inesquecíveis momentos... Enfim, agradeço a DEUS, por ter me concedido a vida e sempre iluminar meus passos.

8 RESUMO Os objetivos do estudo da presente tese foram: 1) Verificar a eficiência do protocolo experimental de cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) utilizado na espécie caprina para a espécie bovina tanto na ausência como na presença do fator de crescimento semelhante à Insulina 1 (IGF-I) (Experimento 1); 2) Investigar o efeito de três diferentes meios de base comercial (α-mem, McCoy ou TCM199 ) sobre a viabilidade, formação de antro, crescimento e manutenção da ultraestrutura de FOPA bovinos (Experimento 2); 3) Avaliar os efeitos da adição de diferentes concentrações de insulina (5 ng/ml, 10 ng/ml, 5 µg/ml e 10 µg/ml) sobre a viabilidade, formação de antro e crescimento de FOPA bovinos (Experimento 3); 4) Verificar a influência do modo de adição de FSH, isto é, de forma fixa (FSH 100 ng/ml) ou em concentrações crescentes (D0-6: 1ng/mL; D6-12: 10 ng/ml; D12-18: 100 ng/ml - FSH Seq) sobre a viabilidade, morfologia, formação de antro, crescimento, ultraestrutura e produção de estradiol a partir de FOPA bovinos isolados e cultivados in vitro (Experimento 4). Folículos secundários caprinos (Experimento 1) e bovinos (Experimento 1, 2, 3 e 4) foram isolados por microdissecção e cultivados in vitro por 16 (Experimento 2) ou 18 dias (Experimento 1, 3 e 4) com regime de troca de meio a cada 2 (Experimento 1, 3 e 4) ou 4 dias (Experimento 2). No Experimento 1, a adição de IGF-I não afetou a sobrevivência folicular e formação de antro nas espécies caprina e bovina, no entanto, a extrusão folicular e a maturação oocitária foram obtidas apenas em caprinos. No Experimento 2, o meio de base TCM199 foi mais eficiente em preservar a viabilidade (P<0,05) e ultraestrutura folicular, resultando em maiores taxas de formação de antro (P<0,05) justificando a escolha do TCM199 como meio de base para o Experimento 3. Neste Experimento 3, a adição de 5 e 10 ng/ml de insulina promoveu um maior crescimento folicular quando comparados ao controle e aos demais tratamentos (P<0,05). Além disso, após 18 dias de cultivo, a adição de insulina em todas as concentrações testadas promoveu aumento significativo nas taxas de sobrevivência folicular quando comparadas ao controle, enquanto que o tratamento 10 ng/ml de insulina apresentou taxas significativamente superiores a todos os demais tratamentos avaliados. No Experimento 4, utilizando da melhor concentração de insulina obtida no Experimento 3 (insulina 10 ng/ml), a adição de FSH 100 ng/ml apresentou percentagem significativamente superior de viabilidade folicular quando comparado ao controle após 18 dias de cultivo. Os folículos cultivados na presença de FSH 100 ng/ml apresentaram diâmetros foliculares significativamente superiores ao controle e FSH Seq. Em conclusão, a utilização do meio de base TCM199 é eficiente em promover o desenvolvimento de FOPA

9 bovinos, os quais se comportam de forma diferenciada dos caprinos no cultivo in vitro. Além disso, a utilização de baixas concentrações de insulina (5 e 10 ng/ml) permite um maior crescimento folicular e a associação de insulina (10 ng/ml) e FSH (100 ng/ml) proporciona elevadas taxas de sobrevivência e de crescimento de FOPA bovinos. Palavras-chave: Insulina; FSH; FOPA; Bovinos; Caprinos.

10 ABSTRACT The objectives of present study were: 1) To verify the efficiency of the experimental protocol from goat preantral follicles (PF) in vitro culture to bovine specie, either in the absence or presence of the Insulin-like growth factor 1 (IGF-I) (Experiment 1); 2) To investigate the effect of three different commercial medium (α-mem, McCoy or TCM199 ) on viability, antrum formation, growth and maintenance of the ultrastructure of the bovine PF (Experiment 2); 3) To evaluate effects of adding different concentrations of insulin (5ng/mL, 10 ng/ml, 5 µg/ml and 10 µg/ml) on viability, antrum formation and growth of bovine PF (Experiment 3); 4) To investigate the influence of FSH addition mode, fixedly (FSH 100 ng/ml) or with increasing concentrations (D0-6: 1ng/mL; D6-12: 10 ng/ml; D12-18: 100 ng/ml - FSH Seq), on viability, morphology, antrum formation, growth, ultrastructure and estradiol production from bovine PF isolated and in vitro cultured (Experiment 4). Goat (Experiment 1) and bovine (Experiment 1, 2, 3 and 4) secondary follicles were isolated by microdissection and cultured in vitro for 16 (Experiment 2) or 18 days (Experiment 1, 3 and 4) with medium exchange every 2 (Experiment 1, 3 and 4) or 4 days (Experiment 2). On Experiment 1, the addition of IGF-I did not affect the follicular survival and the antral formation on bovine and caprine species, however, the follicular extrusion and oocyte maturation were hardly observed in goats. On Experiment 2 the TCM199 base medium was more efficient in preserving the viability (P<0.05) and the follicular ultrastructure, resulting in higher rates of antrum formation (P<0.05) witch justify the choice of TCM199 base medium for the Experiment 3. In this Experiment 3, the addition of 5 and 10 ng/ml insulin promoted a greater follicular growth when compared to control and other treatments (P <0.05). Moreover, after 18 days of cultivation, the addition of insulin at all concentrations tested caused a significant increase in the follicular survival rates compared to the control, whereas the treatment with 10 ng/ml of insulin present rates significantly higher than all other treatments. On Experiment 4, using the best insulin concentration obtained on Experiment 3 (insulin 10 ng/ml), the adding FSH 100 ng/ml showed a significantly higher percentage of follicle viability compared to control after 18 days of the culture. Follicles cultured in the presence of FSH 100 ng/ml showed follicular diameters significantly higher than the control and FSH Seq. In conclusion, the use of the basic medium TCM199 was effective to promote the development of bovine PF, which behave differently from goats cultured in vitro. Furthermore, the use of low insulin concentrations (5 and 10 ng/ml) allowed a greater follicular growth, and the addition of insulin (10 ng/ml) and FSH (100 ng/ml) provided higher rates of survival and growth of bovine PF. Keywords: Insulin; FSH; PF; Bovine; Goat.

11 LISTA DE FIGURAS Revisão Bibliográfica Figura 1: Desenho esquemático do ovário em mamífero representando vasos sanguíneos na região medular e folículos ovarianos (primordial, primário, secundário, terciário e pré-ovulatório), corpo lúteo e álbicans na região cortical... Figura 2 Desenho esquemático dos processos de oogênese e foliculogênese... Figura 3 - Ovário Artificial: obtenção de embriões a partir de folículos pré-antrais... Figura 4 Ilustração dos sistemas empregados para cultivo in vitro de folículos préantrais... Figura 5 Cascata de ativação das vias de sinalização MAPK e Pi3K sob ação do IGF- I. 1 IGF-I e IGFBP disponível para conjugação; 2 Conjugação IGF-I e IGFBP; 3 Transporte do complexo IGFI/IGFBP até IGFR-I; 4 Liberação da IGFBP; 5 Ativação da via Pi3K e MAPK; 6 Mediação dos processos de proliferação e sobrevivência folicular pelas vias Pi3K e MAPK e diferenciação folicular pela MAPK... Figura 6: Esquema ilustrativo da atuação do FSH via receptor. Adaptado de SARAIVA et al., 2010a Capítulo 1 Figura 1. Etapas do processo de ativação e desenvolvimento folicular... Figura 2. Principais equipamentos utilizados no isolamento mecânico de folículos préantrais. A: Tissue chopper; B: Míxer; C: Tesoura cirúrgica; D: Fórceps; E: Agulhas dissecantes... Figura 3. Quadro ilustrativo dos principais avanços obtidos com o cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies nos últimos 12 anos Capítulo 2 Figure 1. Photomicrography showing antrum formation during IVC of caprine (panels A1-A4) and bovine (panels B1-B4) preantral follicles. Mean increase in follicular diameter is presented in panel C.. 62

12 Figure 2. A: Meiosis resumption and oocyte morphology after 18 days IVC; only caprine COCs reached sufficient diameter to be submitted to IVM. B: Cumulus expansion (B1), MII oocyte (B2), morphologically normal mature oocyte (B3) and chromatin configuration of a caprine mature oocyte (B4) Capítulo 3 Figure 1- (A) Percentages of viable pre-antral follicles before (control) and after 16 days of in vitro culture (IVC) in McCoy, TCM199 or α-minimum essential medium (α- MEM). (B E) Light microscopic images of normal (B) and degenerating (D) follicles as confirmed by epifluorescence microscopy of viable calcein-am stained (C) and nonviable ethidium stained (E) follicles. (F I) Transmission electron microscopy revealed normal pre-antral follicles after IVC in the presence of α-mem (F) and TCM199 (G), whereas McCoy medium lead to granulosa cells detachment from oocyte (H) and follicles exhibited signals of vacuolization in the ooplasm (I). (J) Increase in follicular diameter at days 0, 8 and 16 of IVC. (K M) Follicular antrum formation during IVC in the presence of TCM199. (N) Percentage of follicles presenting antrum formation after IVC in the presence of McCoy, TCM199 and α-mem Capítulo 4 Figure 1: Evaluation of follicular viability after 18 days using fluorescent markers analyzed in serial sections by Confocal Microscopy, demonstrating both non-viable (A) and viable (B) isolated follicles cultured in either the absence (control) or the presence of 10 ng/ml insulin, respectively. Note: areas labeled in green and red indicate viable and non-viable cells, respectively.... Figure 2: Percentages of viability (A) and antrum formation (B) of bovine follicles cultured in vitro for 18 days in either the absence or presence of insulin... Figure 3 Evaluation of follicular viability after an in vitro culture for 18 days as characterized by non-viable and viable follicles in the control medium (A1), with FSH 100 (B1) and with FSH Seq (C1) using fluorescent markers (A2, B2 and C2). Note: areas labeled in green and red indicate viable and non-viable cells, respectively... Figure 4 Percentage of viability (A) and antrum formation (B) of bovine follicles cultured in vitro for 18 days in the absence (Control) or the presence of FSH added at a fixed (FSH 100) or increasing (FSH Seq) concentrations Figure 5 Morphological analyses by stereomicroscope (1) and optical microscope (classical histology; 2) after 18 days of in vitro culture using Control medium (A), FSH with fixed (B) and increasing (C) concentrations

13 Figure 6 Ultrastructural analyses of preantral follicles cultured in vitro for 18 days characterizing degenerated follicles in the Control (A) and normal follicles in the presence of FSH 100 (B) or FSH Seq (C) in the culture medium.. Figure 7 Mean values of estradiol secretion measured in the follicular culture medium, collected on days 6, 12 and 18 in the Control group, FSH 100 and FSH Seq 83 84

14 LISTA DE TABELAS Revisão Bibliográfica Tabela 1 Principais substâncias testadas no cultivo in situ pela equipe do LAMOFOPA... Tabela 2 Principais resultados obtidos com a adição de FSH ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais de ruminantes domésticos Capítulo 1 Tabela 1. Quantidade de FOPAS isolados por ovário em diferentes métodos de isolamento e espécies Capítulo 2 Table 1. Mean percentage (± SEM) of follicular survival, antrum formation and follicular extrusion in bovine and caprine preantral follicles during 18-days IVC. 61 Capítulo 4 Table 1: Progression of follicular diameter and the rate of daily growth in the insulin treatments during the 18 days of the in vitro culture.. 80 Table 2: Progression of follicular diameter and the rate of daily growth in the different treatments during 18 days of in vitro culture.. 82

15 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS %: Percentage (Porcentagem) ~: aproximadamente <: Menor =: Igual >: Maior ±: Mais ou menos : Menor ou igual : Maior ou igual : Registro C: Graus Celsius µg: Microgramas µl: Microlitros µm: Micrômetros 3D: three-dimensional (tridimensional) BMP: Bone morphogenetic protein (Proteína morfogenética óssea) BSA: Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CE: Ceará CG: Células da granulosa CGP: Células germinativas primordiais CIV: Cultivo in vitro CO 2 : Dióxido de carbono COCs: Cumulus-oocyte complexes (Complexos cúmulus oócito) DF: Distrito Federal DNA: Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico) Dr.: Doutor E2: Estradiol EGF: Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal) FAVET: Faculdade de Veterinária FGF: Fibroblast growth fator (Fator de crescimento fibroblástico) Fig.: Figure (Figura)

16 FINEP: Financiadora de Estudos e Projetos FIV: Fecundação in vitro FOPA: Folículos ovarianos pré-antrais FSH 100: Follicle stimulating hormone added at a fixed FSH Seq: Follicle stimulating hormone added increasing concentration FSH: Follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante) FSHr: Recombinant follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante recombinante) FSH-R: Follicle stimulating hormone receptor (Receptor do hormônio folículo estimulante) GC: Granulosa cells GDF-9: Growth diferentiation fator -9 (Fator de crescimento e diferenciação-9) GFP: Green Fluorescent protein (Proteína fluorescente verde) GH: Growth hormone (Hormônio do crescimento) GLM: General linear models GLUT: Proteína transportadora de glicose GnRH: Gonadotropin-releasing hormone (Hormônio liberador de gonadrotofina) GV: Germinal vesicle (Vesícula germinativa) GVBD: Germinal vesicle break down (Quebra da vesícula germinativa) h: Hours (horas) IETS: International Embryo Transfer Society IGFBP: Insulin-like growth factor binding protein (proteínas transportadoas de IGF) IGF-I: Insulin-like growth factor-i (Fator de crescimento semelhante à insulina-i) IGFR-I e II Receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo I e II ITP: Instituto de Tecnologia e Pesquisa ITS: Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio) IVC: in vitro culture IVM: in vitro maturation (Maturação in vitro) KGF: Keratinocyte growth factor (Fator de crescimento keratinócito) KL: Kit ligand kv: Kilovolt L: Litro LAMOFOPA: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais

17 LH: Luteinizing hormone (Hormônio luteinizante) LIF: Leukemia inhibitory factor (Fator inibidor de leucemia) MEM: Minimal essential medium (Meio essencial mínimo) MEM + : Supplemented minimal essential medium (Meio essencial mínimo suplementado) MET: Microscopia Eletrônica de Transmissão mg: miligramas min: Minutos ml: Mililitros ml: Mililitros mm: Milímetro MOIFOPA: Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais ng: nanograma NGF Nerve growth factor (Fator de crescimento do nervo) nm: Nanômetro OPU: ovum pickup P<0.05: Probabilidade de erro menor do que 5% P4: Progesterone PCR: Polimerase chain reaction (Reação em cadeia polimerase) PDGF: Platelet derived growth factor (Fator de crescimento derivado de plaquetas) PE: Pernambuco PF: Preantral follicles pfsh: Porcine follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante porcino) pg: Picograma ph: potencial hidrogeniônico PPGCV: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Prof.: Professor qpcr: Quantitative Polymerase chain reaction (Reação em cadeia polimerase quantitativa) RENORBIO: Rede Nordeste de Biotecnologia RIA: Radioimmunoassay RNAm: Ribonucleic acid messenger (Ácido ribonucléico mensageiro) s: Segundos

18 SAS: Statistical analysis system SE: Sergipe SEM: Standart error of the mean (Erro padrão médio) SNK: Student-Newman-Keuls SP: São Paulo ST: Somatotrofina STAR: Steroidogenic acute regulatory protein (Proteína de regulação aguda da esteroidogênese) TCM-199: Tissue Culture Medium (Meio de cultivo de tecido - 199) TEM: Transmission electronic microscopy (Microscopia eletrônica de transmissão) TGF-α: Transforming growth factor alfa (Fator de crescimento transformante alfa) TGF-β: Transforming growth factor beta (Fator de crescimento transformante beta) UECE: Universidade Estadual do Ceará UNIT: Universidade Tiradentes USA: United States of America (Estados Unidos da América) VEGF: Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento do endotélio vascular) VIP: Vasoactive intestinal peptide (Peptídeo intestinal vasoativo) ZP: Zona pellucida (Zona pelúcida) α-mem Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa) α-mem+: Supplemented alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa suplementado)

19 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Caracterização dos Ovários em Mamíferos Oogênese e Foliculogênese Ovariana Folículos Pré-antrais Folículos Antrais Neo-oogênese A Biotécnica de MOIFOPA e suas Aplicações Cultivo in vitro de Folículos Pré-antrais Importância da Composição do Meio de Cultivo in vitro Folicular Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1 (IGF-I) Insulina Hormônio Folículo Estimulante (FSH) Técnicas de Avaliação da Viabilidade e Crescimento Folicular in vitro Histologia Clássica Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Microscopia de Fluorescência Dosagem Hormonal JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVO Objetivo Geral Objetivos Específicos CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 96

20 20 1. INTRODUÇÃO O desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas, tais como a sincronização de estro, superovulação, fecundação in vitro (FIV) e transferência de embriões têm criado oportunidades extraordinárias para a reprodução animal proporcionando uma grande evolução na multiplicação de animais de elevado potencial econômico. Na espécie bovina, a técnica de produção in vitro de embriões, provenientes da ovum pickup (OPU), tem sido utilizada como instrumento importante para diminuir o intervalo entre gerações e acelerar o melhoramento genético animal. No Brasil, esta técnica resultou na produção e transferência de mais de embriões bovinos, ou seja, 85% dos embriões produzidos in vitro em todo o mundo no ano de 2011 (EMBRYOTRANSFER NEWSLETTER - IETS, 2012). Contudo, a produção de embriões a partir de fêmeas de alto valor genético pode ser ainda mais eficiente, especialmente quando se considera que ovário bovino contém milhares de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (FOPA). Sabendo-se que é possível, através da biotécnica de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais (MOIFOPA), isolar cerca de FOPA de um ovário bovino (BEM et al., 1997), o desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro que possibilitem o crescimento destes folículos poderia revolucionar a produção in vitro de embriões nesta espécie. Em detrimento aos avanços obtidos com a manipulação dos folículos antrais, na espécie bovina, poucos esforços são concentrados no estudo do desenvolvimento folicular inicial. Excelentes resultados têm sido obtidos em outras espécies domésticas com a produção de embriões a partir de FOPA (SARAIVA et al., 2010b; ARUNAKUMARI; SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010; GUPTA et al., 2008). O estudo comparativo entre espécies pode acelerar o avanço nas pesquisas uma vez que protocolos bem sucedidos em caprinos podem ser testados em bovinos lançando mão de substâncias que possibilitem o desenvolvimento folicular pré-antral em ambas as espécies. O passo inicial para estabelecer um sistema de cultivo eficiente é definir a composição ideal do meio de base para a suplementação com hormônios e fatores de crescimento. Nesse contexto, inúmeras pesquisas vêm sendo desenvolvidas a fim de aprimorar as técnicas de cultivo in vitro de FOPA em bovinos, além de melhor compreender a foliculogênese ovariana nesta espécie, ainda pouco elucidada. Com base nessas pesquisas, tem sido demonstrado o envolvimento de diferentes substâncias na regulação do desenvolvimento de FOPA durante o cultivo in vitro. Dentre essas substâncias, destacam-se o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-I), a

21 21 Insulina e o hormônio folículo estimulante (FSH), as quais exercem um papel bem definido no controle e na regulação da foliculogênese em diversas espécies (FORTUNE, 2003). Para uma melhor compreensão da presente tese, serão abordados, na revisão bibliográfica, aspectos relacionados ao ovário dos mamíferos, oogênese e foliculogênese, neofoliculogênese, biotécnica de MOIFOPA e suas aplicações, importância do cultivo in vitro de FOPA, com destaque para o IGF-I, Insulina e FSH

22 22 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Caracterização dos Ovários em Mamíferos O principal órgão do sistema reprodutor das fêmeas mamíferas é o ovário que se divide em duas regiões: medular e cortical. A região medular é constituída de vasos sanguíneos, linfáticos e nervos, os quais são responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário (CORMACK, 1991). A região cortical é composta principalmente por folículos ovarianos e corpos lúteos em diferentes estágios de desenvolvimento e regressão (Figura 1) (SILVA, 2005). Figura 1: Desenho esquemático do ovário em mamífero representando vasos sanguíneos na região medular e folículos ovarianos (primordial, primário, secundário, terciário e préovulatório), corpo lúteo e álbicans na região cortical. O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário e é constituído por uma célula germinativa (oócito), circundado por células somáticas (células da granulosa e tecais). Os folículos ovarianos desempenham duas funções principais: uma endócrina e outra exócrina ou gametogênica. A primeira refere-se à síntese e secreção de hormônios e outros peptídeos

23 23 essenciais para o desenvolvimento folicular, ciclicidade estral/menstrual, bem como pela manutenção do trato reprodutivo (HIRSHFIELD, 1991). A segunda resulta no desenvolvimento do oócito imaturo até a sua maturação e consequente ovulação (SAUMANDE, 1991). O folículo ovariano é responsável por proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação oocitária (CORTVRINDT; SMITZ, 2001) Oogênese e Foliculogênese Ovariana A oogênese pode ser definida como o conjunto de processos que compreende o desenvolvimento e a diferenciação das células germinativas primordiais da fêmea até a formação do oócito haploide fecundado (Figura 2) (RUSSE, 1983). Durante o período embrionário, as células germinativas primordiais de origem extragonadal migram para o ovário primitivo, multiplicam-se ativamente e se diferenciam em oogônias (PEPLING, 2006). As oogônias, que sofreram sucessivas mitoses, posteriormente entrarão na primeira divisão meiótica (estágio de prófase I) e passarão a ser denominadas oócitos primários (SUH; SONNTAG; ERICKSON, 2002). Na maioria dos cordados, todas as divisões das oogônias completam-se e elas entram em prófase meiótica durante a vida embrionária (ruminantes, roedores, suínos, humanos) ou logo após (carnívoros, coelhos e lebres) (DE LOS REYES et al., 2005). O processo meiótico é interrompido no estádio de diplóteno da prófase da primeira divisão da meiose também denominado de vesícula germinativa (SAUMANDE, 1991). Esta é a primeira parada da meiose, o núcleo permanecerá nesse estádio pelo menos até a puberdade. Na puberdade, em razão de liberações pré-ovulatórias do LH algumas horas antes da ovulação, a meiose é retomada e o núcleo oocitário entra em diacinese (ADASHI, 1994). Nesse momento, a meiose progride finalizando a prófase I, metáfase I, anáfase I e telófase I ocorrendo a expulsão do primeiro corpúsculo polar resultando na formação do oócito secundário, assim denominado por estar na segunda divisão da meiose (SAUMANDE, 1991). Ocorrerá então a segunda parada da meiose e o núcleo do oócito ficará em metáfase II e só retomará a meiose se for fecundado pelo espermatozoide. Após a ovulação, caso seja fecundado, o oócito completará a segunda divisão da meiose, expulsará o segundo corpúsculo polar culminando com a formação do oócito haplóide fecundado, marcando assim o fim da meiose (RUSSE, 1983). A foliculogênese pode ser definida como o processo de formação, crescimento e maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com a

24 24 obtenção do folículo pré-ovulatório (Figura 2) (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Durante o seu desenvolvimento o folículo ovariano sofre constantes modificações em sua morfologia, tendo como principais características o crescimento do oócito, a proliferação e a diferenciação das células da granulosa e da teca, bem como o aparecimento da cavidade antral (BRISTOL- GOULD; WOODRUFF, 2006). Diante dessas mudanças morfológicas pode-se verificar que a população folicular nos ovários é bastante heterogênea variando entre as espécies (SAUMANDE, 1991). Dessa forma, é possível classificar os folículos ovarianos de acordo com o estádio de desenvolvimento em pré-antrais (primordiais, primários e secundários) ou antrais (terciários e pré-ovulatórios) (HULSHOF et al., 1994a). Figura 2 Desenho esquemático dos processos de oogênese e foliculogênese Folículos Pré-antrais Os folículos primordiais constituem o pool de reserva folicular, compreendendo cerca de 95% de toda população folicular presente nos ovários dos mamíferos e possuem oócitos primários circundados por uma camada de 4-8 células da pré-granulosa, de formato pavimentoso. Na maioria destes folículos, as células da pré-granulosa param de se multiplicar e entram em um período de quiescência até receberem sinais para entrar no pool de folículos em crescimento, porém, alguns podem ser estimulados a crescer imediatamente (MCGEE; HSUE, 2000). O processo pelo qual o folículo primordial sai do pool de reserva e inicia a fase de crescimento é denominado de ativação folicular, caracterizado por diversas mudanças morfológicas que incluem o aumento do diâmetro oocitário, a proliferação das células da granulosa, bem como a mudança de formato destas células de pavimentosas para cúbicas

25 25 (RUSSE, 1983). O controle da ativação de folículos primordiais envolve uma comunicação bidirecional entre o oócito e suas células somáticas circundantes (EPPIG, 2001). Os folículos são denominados de primários quando o oócito primário passa a ser circundado por uma camada completa de células da granulosa de formato cúbico (GOUGEON; BUSSO, 2000). Em fetos de caprinos, ovinos e bovinos, o aparecimento de folículos primários, ocorre aos 71, 100 e 140 dias de gestação, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RUSSE, 1983). Durante o crescimento destes folículos, as células da granulosa se proliferam e há um aumento do oócito em tamanho e conteúdo protéico (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998). Nesta fase, os folículos iniciam a expressão das proteínas, que irão formar a zona pelúcida (LEE, 2000), a qual se encontra localizada entre o oócito e as células da granulosa (BECKERS et al., 1996). Os folículos secundários são caracterizados pela presença de duas ou mais camadas de células da granulosa de formato cúbico ao redor do oócito primário. A presença destes folículos pode ser observada em fetos caprinos, ovinos e bovinos aos 80, 120 e 210 dias de gestação, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RUSSE, 1983). Nesta fase, o núcleo do oócito começa a assumir uma posição excêntrica e as organelas começam a se mover para a periferia. A zona pelúcida é claramente identificada e o oócito entra em fase de crescimento intensivo aumentando seu volume como resultado do acúmulo de água, íons, carboidratos, proteínas e lipídeos (FAIR et al., 1997). Em seguida, as células da teca, recrutadas a partir do estroma intersticial, formam uma camada em torno das células da granulosa (PETERS, 1979). Essa progressão parece ser controlada por hormônios, peptídeos e fatores de crescimento intraovarianos (FORTUNE, 2003; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005) Folículos Antrais Com o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido denominada antro. (DRIANCOURT, 2001). A partir deste estádio, os folículos passam a ser denominados terciários e, com o desenvolvimento folicular, a produção de fluido antral é intensificada pelo aumento da vascularização e permeabilidade dos vasos sanguíneos e produção de substâncias de alto peso molecular pelas células da granulosa que resulta no acúmulo de líquido e consequente aumento do tamanho folicular (CLARKE et al., 2006; SCHOENFELDER; EINSPANIER, 2003). Dentre as várias substâncias presentes no fuído folicular, destacam-se

26 26 as gonadotrofinas, hormônios esteroides, enzimas, lipoproteínas, bem como fatores de crescimento intraovarianos (WU; TIAN, 2007). Após a formação do antro, os folículos terciários avançados passam a ser dependentes de gonadotrofinas e ainda possuem um oócito primário. Ao atingirem 2-3 mm de diâmetro, são recrutados a se desenvolverem, o que caracteriza a emergência da onda folicular (ADAMS et al., 2008) que pode variar de duas a três ondas de crescimento folicular para a espécie bovina (GINTHER et al., 1989). Durante o desenvolvimento dos folículos antrais ocorre as fases de recrutamento, seleção e dominância (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Acredita-se que a dominância folicular inicia-se quando os folículos maiores passam a produzir altos níveis do IGF-I, estradiol e inibina, responsáveis por modular a liberação de FSH pela adenohipófise (DRIANCOURT, 2001). Após o completo estabelecimento da dominância folicular, os folículos crescem rapidamente e em poucos dias atingem o diâmetro médio de mm nas vacas e, em seguida, ocorre a ovulação do complexo cumulus-oócito em resposta ao pico de LH, propiciando a manutenção da fertilidade das fêmeas mamíferas (DRUMMOND, 2006). O folículo pré-ovulatório, na maioria das espécies domésticas, possui um oócito secundário o qual completará sua meiose após a fusão com o espermatozóide e expulsão do segundo corpúsculo polar como citado no tópico 2.2 (DE LOS REYES et al., 2005) Neo-oogênese O conhecimento de que a população folicular é estabelecida ainda na vida fetal em primatas e ruminantes (BETTERIDGE et al., 1989), ou logo após o nascimento em roedores (HIRSHFIELD, 1991) como mencionado no tópico 2.2, tem sido questionado nos últimos anos. De acordo com Oktem e Urman (2010), durante a vida de fêmeas mamíferas não há o aumento do número de oócitos além do estabelecido inicialmente durante a formação dos ovários. No entanto, uma série de estudos recentes têm desafiado esta afirmação, mostrando a formação de novas células germinativas em mulheres (BUKOVSKI et al., 2004) e em camundongos fêmea adultas (JOHNSON et al., 2004). Recentemente, Zou et al. (2009) produziram descendentes saudáveis proveniente de oócitos fecundados in vitro derivados de células tronco germinativas femininas em pequenos roedores. Estes resultados fornecem evidências convincentes para a existência de células tronco germinativas em fêmeas mamíferas adultas, que em condições experimentais, são plenamente capazes de gerar oócitos

27 27 que podem ser fertilizados e produzir descendentes viáveis (OKTEM; URMAN, 2010). O paradigma de que a população folicular é pré-estabelecida na vida fetal ou logo após o nascimento é mutável, uma vez que são necessárias comprovações científicas para a teoria da neo-oogênese em mamíferos. Entretanto, independente da neo-oogênese, a população folicular pode variar entre espécies e indivíduos de aproximadamente na camundonga (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000) até na mulher (ERICKSON, 1986). Além disso, durante a vida reprodutiva das fêmeas, ocorre uma redução gradativa no número de FOPA devido ao processo de ovulação ou morte folicular, uma vez que estes representam a grande totalidade da população folicular ovariana (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000) A Biotécnica de MOIFOPA e suas Aplicações A MOIFOPA, também conhecida como Ovário artificial, consiste no isolamento ou resgate de FOPA a partir de ovários antes que estes entrem em atresia, visando à criopreservação e/ou cultivo folicular na tentativa de promover o crescimento, a maturação e a fecundação in vitro de oócitos derivados de FOPA crescidos in vitro (Figura 3) (FIGUEIREDO et al., 2007). Esta biotécnica apresenta-se como uma excelente ferramenta que permite acompanhar o crescimento de folículos ovarianos desde a fase pré-antral até a fase antral, contribuindo dessa forma para um melhor entendimento acerca do funcionamento do ovário (FIGUEIREDO et al., 2008). Figura 3 - Ovário Artificial: obtenção de embriões a partir de folículos pré-antrais.

28 28 Atualmente a biotécnica de MOIFOPA tem auxiliado no desenvolvimento de pesquisas fundamentais contribuindo para elucidação da foliculogênese inicial, através de estudos que buscam testar o efeito de diferentes substâncias (matriz extracelular, hormônios e fatores de crescimento), cujo efeito individual ou associado tem sido avaliado e/ou controlado em diversos experimentos. Além disso, a MOIFOPA é de grande interesse para a reprodução humana assistida, pois, além de evitar a utilização de intensas estimulações ovarianas em programas de fecundação in vitro (HAIDARI; SALEHNIA; VALOJERDI, 2008) poderá ser utilizada como alternativa para mulheres com riscos de falha ovariana precoce ou submetidas a tratamentos que levem à infertilidade. O desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro de FOPA poderá ser usado ainda para testes de toxicidade de substâncias que possam interferir nos processos reprodutivos em mamíferos (FIGUEIREDO et al., 2008). Em animais, apesar desta biotécnica ainda não ter aplicabilidade comercial, poderá contribuir futuramente para o aumento da produtividade de animais de alto valor genético, ou mesmo auxiliar na preservação de espécies ameaçadas de extinção. Somado a isso, contribuirá significativamente para o bem-estar animal, por se tratar de um modelo exclusivamente in vitro, pois representará uma alternativa aos procedimentos que fazem o uso de animais vivos para experimentação (FIGUEIREDO et al., 2008) Cultivo in vitro de Folículos Pré-Antrais O desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro de FOPA que possibilitem a obtenção de oócitos maduros fertilizáveis poderia revolucionar as diferentes biotécnicas envolvidas com a reprodução assistida, pois a disponibilidade de oócitos ainda representa um grande empecilho para o sucesso destas (TELFER et al., 2008). Em adição, oócitos obtidos a partir do cultivo in vitro de FOPA podem ser utilizados para melhorar o potencial reprodutivo de animais geneticamente superiores ou em vias de extinção, bem como auxiliar no tratamento de infertilidade em humanos. Os sistemas de cultivo in vitro disponíveis para FOPA incluem o cultivo de ovário inteiro (EPPIG; O'BRIEN, 1996), fragmentos do córtex ovariano (SILVA et al., 2004a) e cultivo de folículos isolados (SARAIVA et al., 2010b) conforme ilustrado na figura 4.

29 29 Figura 4 Ilustração dos sistemas empregados para cultivo in vitro de folículos pré-antrais. Através do cultivo in vitro de ovários inteiros, foi possível a obtenção de crias de camundongos a partir de folículos primordiais desenvolvidos in vitro (O BRIEN et al., 2003). Apesar destes resultados satisfatórios em animais de laboratório, em animais domésticos não é possível realizar o cultivo in vitro de ovários inteiros, devido às suas dimensões. Diante disso, os sistemas de cultivo rotineiramente adotados são: o cultivo de FOPA inclusos no fragmento ovariano (cultivo in situ) ou na forma isolada (cultivo isolado). Em adição, pode ainda ser realizado um cultivo em dois passos, no qual é realizado primeiramente o cultivo in situ, permitindo a ativação e desenvolvimento do folículo primordial até estágio de secundário, para posteriormente ser isolado e cultivado até o estágio antral (TELFER et al., 2008). O cultivo in vitro de pequenos fragmentos de córtex ovariano (cultivo in situ) onde estão presentes principalmente folículos primordiais, tem por objetivo estudar a ativação folicular, bem como o crescimento de folículos primários (SILVA et al., 2004a). Além da praticidade, o cultivo de fragmentos de córtex ovariano tem a vantagem de manter o contato celular e a integridade tridimensional dos folículos (ABIR et al., 1999, 2006). Utilizando o cultivo in situ, nossa equipe testou os efeitos da adição e da concentração de diferentes substâncias ao meio de cultivo conforme demonstrado na tabela 1.

30 30 Tabela 1 Principais substâncias testadas no cultivo in situ pela equipe do LAMOFOPA. SUBSTÂNCIA AUTORES / ANO DE PUBLICAÇÃO Ácido ascórbico ROSSETTO et al., 2009 Ácido indol acético MATOS et al., 2006 Água de coco SILVA et al., 2004b; MARTINS et al., 2005 Androstenediona LIMA-VERDE et al., 2010b Ativina-A e Folistatina SILVA et al., 2006 BMP-15 CELESTINO et al., 2011a BMP-6 ARAÚJO et al., 2010a BMP-7 ARAÚJO et al., 2010b EGF SILVA et al., 2004a Estradiol LIMA-VERDE et al., 2010a FGF-10 CHAVES et al., 2010a FGF-2 MATOS et al., 2007b FSH MATOS et al., 2007a; MAGALHÃES et al., 2009a, 2009b GDF-9 MARTINS et al., 2010 KGF FAUSTINO et al., 2011 KL CELESTINO et al., 2010 LH SARAIVA et al., 2008 Melatonina ROCHA et al., 2013 NGF CHAVES et al., 2010b Soro Fetal Bovino BRUNO et al., 2008 VEGF BRUNO et al., 2009 VIP BRUNO et al., 2010 α-tocoferol LIMA-VERDE et al., 2009 Através de métodos mecânicos e/ou enzimáticos é possível isolar um grande número de folículos pré-antrais intactos de diferentes espécies (vacas: FIGUEIREDO et al., 1993; cabras: LUCCI et al., 1999; ovelhas: CECCONI et al., 1999; ratas: ZHAO, 2000; camundongos fêmeas: PESTY et al., 2007) visando o cultivo in vitro de folículos isolados. Os folículos isolados por sua vez podem ser cultivados em modelo bidimensional, no qual são cultivados diretamente sobre a placa de cultivo ou sobre uma matriz, ou ainda em modelo tridimensional (DEMEESTERE et al., 2005), no qual os folículos são totalmente inclusos em uma matriz extracelular. Utilizando o sistema de cultivo in vitro de FOPA isolados, nossa equipe de pesquisa pôde verificar o efeito de diferentes tensões de oxigênio (SILVA et al., 2010), regime de troca de meio (MAGALHÃES et al., 2011a), diferentes formas de cultivo in vitro de folículos isolados (individual ou em grupo) (DUARTE et al., 2011), bem como o efeito da adição de diferentes suplementos ao meio de cultivo, como albumina sérica bovina - BSA (RODRIGUES et al., 2010) e ácido ascórbico (SILVA et al., 2011a). Além disso, foi avaliado o efeito de hormônios como o FSH (SARAIVA et al., 2011), hormônio do crescimento - GH (MAGALHÃES et al., 2011b) e LH (SILVA et al., 2011b), bem como de fatores de

31 31 crescimento tais como: o EGF (CELESTINO et al., 2011b), IGF-I (MAGALHÃES- PADILHA et al., 2012), fator inibidor da leucemia - LIF (LUZ et al., 2012), KL (LIMA et al., 2011), dentre outros. Além dos resultados obtidos por nossa equipe, um notável progresso tem sido observado no cultivo in vitro de FOPA em diferentes espécies nas ultimas décadas (ver Capítulo I) Importância da Composição do Meio de Cultivo in vitro Folicular Para o cultivo in vitro de FOPA são utilizados diferentes meios comerciais, os quais podem influenciar o desenvolvimento dos folículos ovarianos, estimulando a sobrevivência e o crescimento folicular. Dentre os meios de cultivo de base comumente utilizados para FOPA, destacam-se o Meio Essencial Mínimo (MEM) simples (ROSSETTO et al., 2009) ou alfamodificado (α-mem SARAIVA et al., 2010b), o Meio de Cultivo Tecidual 199 (TCM199 ITOH et al., 2002), e os meios Waymouth (MURUVI et al., 2005) e McCoy s (MCLAUGHLIN; TELFER, 2010). A composição do meio de base é fundamental para o sucesso do cultivo in vitro de folículos ovarianos, e pode ser influenciada pela adição de diferentes substâncias, tais como hormônios e fatores de crescimento (PICTON et al., 2008). Dentre as substâncias adicionadas ao meio de cultivo in vitro de FOPA destaca-se o soro, o qual é composto por proteínas, aminoácidos, carboidratos, hormônios, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular (DEMEESTERE et al., 2005). Para suprir as necessidades proteicas na ausência de soro, opta-se pela suplementação com albuminas séricas purificadas, como a albumina sérica bovina (BSA), ao meio de cultivo in vitro (PICTON et al., 2008), uma vez que a composição indefinida do soro pode mascarar efeitos de outras substâncias adicionados ao mesmo. O efeito estimulante de diversas substâncias presentes no meio de cultivo in vitro pode acelerar o crescimento folicular além de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) provenientes do metabolismo celular (THOMAS et al., 2001). O incremento de substâncias antioxidantes ao meio de cultivo in vitro, como o ácido ascórbico, pode controlar a ação das EROs e atuar sobre a foliculogênese, promovendo a redução da apoptose em FOPA (MURRAY et al., 2001) e consequentemente manter a viabilidade folicular após cultivo de longa duração (ROSSETTO et al., 2009; SILVA et al., 2011a). Além disso, a adição de piruvato, glutamina, hipoxantina, insulina, transferrina e selênio tem proporcionado o

32 32 aumento no percentual de folículos morfologicamente normais cultivados in vitro e estimulado o seu crescimento (DEMEESTERE et al., 2005). A utilização de hormônios e fatores de crescimento no meio de cultivo folicular tem proporcionado o desenvolvimento in vitro dos FOPA. Entretanto, os requerimentos nutricionais destes folículos podem variar ao longo do seu desenvolvimento, necessitando de diferentes substâncias em quantidades e momentos específicos. Tais substâncias podem ser adicionadas ao cultivo isoladamente ou associadas, originando meios de cultivo nãodinâmicos (quando as substâncias são adicionadas simultaneamente em concentrações fixas) ou dinâmicos (quando cada substância, ou combinação de substâncias, ou ainda, concentrações distintas são adicionadas em momentos diferentes do cultivo para suprir as necessidades específicas dos diferentes estágios foliculares). Nesse contexto, diversos autores têm investigado os efeitos da concentração, momento de adição e associação ou não destas substâncias (hormônios e fatores de crescimento), no cultivo in vitro de FOPA tanto de animais de laboratório como em animais domésticos. Dentre estes fatores que atuam no desenvolvimento dos folículos ovarianos, destacam-se o IGF-I, Insulina e FSH Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1 (IGF-I) A regulação do funcionamento ovariano em mamíferos envolve a participação de diferentes elementos que compõem o sistema de fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF). Dentre estes elementos podem-se incluir os fatores I e II (IGF-I e IGF-II), os receptores do tipo I e II (IGFR-I e IGFR-II) para os IGFs e uma superfamília de proteínas transportadoras (IGFBPs) para esses fatores de crescimento (GIUDICE, 1992; LEROITH et al., 1995). A biodisponibilidade e consequente ação dos IGF são reguladas em parte pelas IGFBP, que se ligam aos IGF com grande afinidade, designadas de IGFBP-1 até IGFBP-6 (RAJARAM; BAYLINK; MOHAN, 1997). O IGF-I é um polipeptídeo composto por 70 aminoácidos, estruturalmente e funcionalmente relacionado à insulina, conhecido por sua capacidade em promover o crescimento e a diferenciação celular podendo ser sintetizado em diversos tecidos, nos quais exerce importantes funções autócrinas e parácrinas (DAUGHADAY; ROTWEIN, 1989). Os IGF (I e II) possuem dois tipos de receptores, IGFR-1 e IGFR-2. Esses receptores são do tipo tirosina quinase transmembrana e possuem uma elevada homologia com o receptor de insulina. O IGFR-1 é composto por duas subunidades extracelulares α e duas