ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA

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1 0 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ-UECE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA E DO FSH NO CULTIVO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO EM MEIO CONTENDO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO FORTALEZA CEARÁ 2015

2 1 ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA E DO FSH NO CULTIVO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO EM MEIO CONTENDO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. Claudio Cabral Campello. FORTALEZA CEARÁ 2015

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4 3 ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA E DO FSH NO CULTIVO DE FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO EM MEIO CONTENDO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Aprovada em: 17/07/2015 BANCA EXAMINADORA

5 4 A DEUS, SUSTENTÁCULO DIVINO, A MINHA FAMÍLIA, SUSTENTÁCULO TERRENO

6 5 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) por minha formação e capacitação profissional. A Deus, o sopro da vida, a seu filho Jesus, os divinos ensinamentos e ao Espírito Santo, a luz que me guia os passos a cada despertar. A minha mãe Anna Laura, grande amiga, irmã e companheira de jornada... o meu tudo! Amo você! Ao meu pai, pelo amor que me dedicou me fazendo quem sou. Aos meus irmãos Romeu e João Paulo, por me ensinarem diariamente a tolerância, a paciência e, principalmente, o amor! Pelo entendimento nas diferenças e o amor nas igualdades. Ao meu padrasto Gino, que me ajudou a chegar até aqui, com seu carinho e presteza. A minha avó Stela, que agora habita na morada do Pai, deixando saudades de um colo e um chamego que só avó sabe dar... A minha família, que sempre torceu pela realização deste sonho. A minha amiga Ana Maria, tia de coração, por todo o seu carinho e incentivo! A minha amiga Ana Dina, pelos deliciosos quitutes e pela grande amizade. À professora Lúcia de Fátima Lopes dos Santos, que me orientou com tanta maestria durante minha vida acadêmica, a quem tenho bastante carinho e admiração. Aos meus mestres, pelos conhecimentos transmitidos que pautarão minha vida profissional. Aos funcionários do PPGCV, em especial a Adriana, ao Sr. João e ao Cesár que desde o início me acolheram com carinho. Ao meu orientador, professor Cláudio Cabral, por quem tenho tamanha admiração, obrigada por toda a paciência, confiança e ensinamentos transmitidos. Ao prof. José Ricardo de Figueiredo e à profa. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, por todo auxílio e incentivo profissional, pela confiança depositada em mim.

7 6 À Carolina Maside Mielgo, por toda sua contribuição, incentivo, entusiasmo e amizade durante a finalização deste trabalho! Ao Carlos Henrique Lobo, por todo o conhecimento transmitido e amizade! Ao Dr. Felipe Zandonadi Brandão e ao Dr. Gary Apgar pela contribuição na realização deste trabalho. Aos membros da banca Dr. José Ricardo de Figueiredo, Dra. Valdevane Rocha Araújo e Dra. Carolina Maside Mielgo, pelo auxílio na finalização desse trabalho e por gentilmente terem aceitado ao convite de participar da minha banca examinadora. A minha equipe de trabalho, Denise Damasceno Guerreiro, Hudson Henrique Vieira Correia, Naiza Arcângela Ribeiro Sá, Valdevane Rocha Araújo e agregados (Johanna Leiva, Jesús Cadenas e Érica Leal), pela dedicação e apoio técnico durante os experimentos, por terem tornado esses momentos mais leves e agradáveis durante as madrugas! As minhas Bruxinhas Johanna Leiva Revilla, Denise Damasceno Guerreiro, Érica Suzane Leal e Andréa Moreira por toda a amizade e companheirismo nos momentos difíceis e pelos bons momentos que passamos juntas! Ao grupo religioso formado por professores e colegas do laboratório (grupo espírita), onde encontrei equilíbrio, sabedoria e força! A toda equipe do Lamofopa, que contribuíram direta ou indiretamente, por toda a amizade e carinho. Enfim, a todos vocês, meu muito obrigada!

8 7 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de insulina, sozinha ou associada a concentrações fixa ou crescentes de FSH no cultivo in vitro de folículos préantrais caprinos isolados. Folículos secundários foram cultivados individualmente durante 18 dias em meio de base contendo 50 ng/ml de GH suplementado com insulina em baixa concentração (INS-LW: 10 ng/ml) ou alta concentração (INS-HG: 10 µg/ml) sozinha ou associada ao FSH em concentrações fixa (FSH100: 100 ng/ml) ou crescentes (FSH-SEQ: 100 ng/ml, dias 0 ao 6; 500 ng/ml, dias 6 ao 12; 1000 ng/ml, dias 12 ao 18 ). Após o cultivo, os seguintes pontos foram avaliados: morfologia e taxas de crescimento folicular, formação de antro, produção de estradiol (E2), expressão do mrna para os genes para FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17, 3ßHSD, bem como as taxas de viabilidade e de maturação oocitária. O tratamento INS-LW mostrou uma taxa mais elevada (P < 0,05) de folículos normais no dia 18 de cultivo. No entanto, aumento global (P < 0,05) no crescimento folicular, diâmetro oocitário e taxa de retomada da meiose foram obtidos utilizando INS-HG+FSH100. Os tratamentos INS-HG e INS-HG+FSH100 apresentaram maiores níveis de produção de estradiol e dos níveis de mrna para CYP19A1, CYP17, 3ßHSD quando comparado aos tratamentos INS-LW e INS-LW+FSH100. Em conclusão, na presença de GH, o meio básico suplementado com 10 µg/ml de insulina e 100 ng/ml de FSH durante todo o período de cultivo, melhorou o crescimento folicular e oocitário, a retomada da meiose oocitária e a produção de E2 a partir de foliculos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro. Palavras-chave: Cabra. Desenvolvimento follicular. Maturação oocitária. Hormônios. Esteroidogênese.

9 8 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of different insulin concentrations, alone or associated with either a fixed FSH concentration or increasing FSH concentrations on in vitro culture of isolated goat preantral follicles. Secondary follicles were individually cultured for 18 days in a basic medium containing 50 ng/ml GH supplemented with low insulin concentration (INS-LW: 10 ng/ml) or high insulin concentration (INS-HG: 10 µg/ml) alone or with a fixed FSH concentration (FSH100: 100 ng/ml) or with increasing FSH concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18). After culture the following end points were evaluated: follicle morphology and growth rates, antrum formation,, estradiol (E2) production, gene expression for FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17, 3ßHSD as well as oocyte viability and maturation. INS-LW treatment showed a higher (P < 0.05) incidence of normal follicles at day 18 of culture. However, overall higher (P < 0.05) follicular growth, oocyte diameter and meiotic resumption rates were obtained using INS-HG + FSH 100. INS-HG and INS-HG+FSH100 showed higher E2 production and mrna levels for CYP19A1, CYP17, 3ßHSD when compared to INS-LW and INS-LW+FSH100. In conclusion, in presence of GH, a basic medium supplemented with 10 µg/ml insulin and 100 µg/ml FSH throughout the culture period, improved follicular and oocyte growth, oocyte meiotic resumption and E2 production from isolated preantral caprine follicles cultured in vitro. Keywords: Goat. Follicle development. Oocyte maturation. Hormones. Steroidogenesis.

10 9 LISTA DE FIGURAS Revisão de Literatura Figura 1- Ilustração do ovário de mamíferos e suas estruturas. Adaptado de 18 Figura 2- Esquema ilustrativo da formação dos oócitos e folículos, destacando a relação dos processos de oogênese e foliculogênese na maioria dos mamíferos. LH, horônio luteinizante; MCI, massa celular interna Figura 3- Ilustração caracterizando a morfologia de folículos ovarianos préantrais (A, B e C) e antrais (D e E). (A) folículo primordial; (B) folículo primário; (C) folículo secundário; (D) folículo terciário; (E) folículo pré-ovulatório. 1. Oócito; 2. Células da granulosa; 3. Zona pelúcida; 4. Células da teca; 5. Células da teca interna; 6. Células da teca externa; 7. Antro; 8. Células do cumulus; 9. Lâmina basal Figura 4- A) Ilustração de um folículo de Graaf. Co, cumulus oophorus; Ge, epitélio germinativo; Lf, líquido folicular; Mg, membrana granulosa; Te, teca externa; Ti, teca interna. (B) Estrutura da parede do folículo de Graaf mostrando como as células granulosas são privadas de um suprimento sanguíneo pela membrana basal Capítulo 1 Figure 1- Percentage of antrum formation in caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days. Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/ml GH. A - B: Differs significantly among treatments within the same culture period (P < 0.05). a b: Differs significantly among culture periods within the same treatment (P < 0.05) Figure 2- Mean (± SEM) estradiol production (ng/ml) after culture medium of caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administred in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 48

11 10 Figure 3- Figure 4- to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) and GH (50 ng/ml). Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/ml GH. A C: Differs significantly among treatments within the same culture period (P < 0.05). a b: Differs significantly among culture periods within the same treatment (P < 0.05). Relative mean (± SEM) expression of mrna of FSHR (A), INSR (B), and GHR (C) in caprine preantral follicles cultured with insulin (INS- LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days. Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/ml GH. Different letters denote significant differences (P < 0.05) 49 Relative mean (± SEM) expression of mrna of 3βHSD (A), CYP19A1 (B), and CYP17 (C) in caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days. Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/ml GH. Different letters denote significant differences (P < 0.05)... 50

12 11 LISTA DE TABELAS Table 1- Oligonucleotide primers used for PCR analysis of goat follicles Table 2- Percentage of morphologically intact and extruded preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or in increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days Table 3- Mean (± SEM) diameter (µm) and follicular growth rate (µm) of caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or in increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days Table 4- Meiotic stages of caprine oocytes from preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or in increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days. 47 Table 5- Mean (± SEM) diameter (µm) of oocytes matured in vitro and oocyte recovery rate from caprine preantral follicles cultured with insulin (INS- LW: 10 ng/ml or INS-HG: 10 µg/ml), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/ml) or in increased concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/ml, days 0 to 6; 500 ng/ml, days 6 to 12; 1000 ng/ml days 12 to 18) for 18 days 47

13 12 LISTA DE ABREVIAÇÕES BSA Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) C Graus Celsius cdna Complementary DNA (DNA Complementar) CGs Células da granulosa CGPs Células germinativas primordiais Calceína - AM Calceína acetoximetil CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO 2 Carbon dioxide (Dióxido de Carbono) CYP17 Cytochrome P alpha hydroxylase CYP19A1 (Aromatase) COCs Cumulus oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito) D0/D6/D12/D18 Day 0/ day 6/ day 12 /day 18 (Dia 0/ dia 6/ dia 12/ dia 18) DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico) Dr. Doctor (Doutor) Dra. Doctor (Doutora) E2 Estradiol EGF Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal) FGF Fibroblast growth factor (Fator de crescimento de fibroblastos) FOPA Folículo pré-antral FSH Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante) FSH ng/ml FSH FSH-SEQ increasing FSH concentrations (FSH em concentrações crescentes) FSHR Receptor for FSH (Receptor para FSH) G Gauge GDF-9 Growth differentiation factor 9 (Fator de crescimento e diferenciação-9) GH Growth hormone (Hormônio do crescimento) GHR Receptor for GH (Receptor para GH) GV (VG) Germinal vesicle (Vesícula germinal) h Horas IGF-I Insulin-like growth factor-i (Fator de crescimento semelhante à insulina-i) INS Insulin (Insulina)

14 13 INS-HG High insulin concentration (alta concentração de insulina) INS-LW Low insulin concentration (baixa concentração de insulina) INSR Receptor for insulin (Receptor para insulina) IVC (CIV) In vitro culture (Cultivo in vitro) IVF (FIV) In vitro fertilization (Fertilização in vitro) IVM (MIV) In vitro maturation (Maturação in vitro) kg Quilograma LH Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante) LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais M Molar MEM Minimal essential medium (Meio essencial mínimo) Mm mili-molar mm milímetro mg Miligrama MI Metaphase I (Metáfase I) MII Metaphase II (Metáfase II) MCI Massa celular interna min Minutos ml Mililitro MOIFOPA Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais mrna Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro) ng Nanograma P < 0.05 Probabilidade de erro menor do que 5% p. Página PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase) pg Picograma PH potencial hidrogeniônico PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias PPIA Peptidylprolyl Isomerase A qpcr Quantitaive PCR RENORBIO Rede Nordeste de Biotecnologia RIA Radioimmunoassay (radioimunoensaio) rfsh Recombinant FSH (FSH recombinante)

15 14 RT-PCR Real time PCR (PCR em gtempo real) SAS Statistical analysis system (Sistema de análise estatística) s Second (Segundo) SEM Standard error of means (Erro padrão da média) T4 Tiroxina 4 TCM-199 Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199) U Unidade UECE Universidade Estadual do Ceará VGBD Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal) α-mem Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa) μg Microgramas μl Microlitro μm Micrômetro µm Micromolar 3βHSD 3β-hydroxysteroid dehydrogenase 2D Bidimensional 3D Tridimensional % Porcentagem ~ Aproximadamente < Menor = Igual > Maior Maior ou igual + Mais ± Mais ou Menos

16 15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIORÁFICA Ovário dos mamíferos Oogênese e foliculogênese Folículos ovarianos População e atresia folicular MOIFOPA Cultivo in vitro de folículos pré-antrais Insulina Hormônio folículo estimulante (FSH) Hormônio do crescimento (GH) JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos CAPÍTULO CONCLUSÃO PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS... 63

17 16 1 INTRODUÇÃO O desenvolvimento folicular depende de uma sequência complexa de interações celulares. No decorrer do desenvolvimento, o folículo pode atingir diversos estágios, desde pré-antral até folículo pré-ovulatório. No entanto, a maioria desses folículos morre em decorrência do processo de atresia (NAYUDU & OSBORN, 1992). Neste sentido, diversas biotecnologias vêm sendo desenvolvidas como alternativas para recuperar os folículos antes do processo de atresia. Dentre essas biotécnicas, a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) é uma dessas alternativas, uma vez que folículos são destinados ao cultivo in vitro (CIV), seguido da maturação e da fecundação in vitro (FIV) dos oócitos. Dentre os sistemas para cultivo folicular, pode-se destacar o cultivo de folículos isolados do córtex ovariano, o qual, além de possibilitar o acompanhamento individual dos folículos, permite uma maior perfusão do meio durante o cultivo (ABIR et al., 2006). Além do sistema de cultivo utilizado, a composição do meio é um fator chave para promover o desenvolvimento de folículos ovarianos pré-antrais in vitro a estágios mais avançados (PENG et al., 2010). Sabe-se que os folículos podem ser potencialmente influenciados pelos fatores de crescimento e hormônios produzidos pelas células do estroma, por outros folículos ou por eles mesmos (Fortune, 2003). Essas substâncias exercem importantes papeis no controle da foliculogênese inicial, atuando na ativação (SKINNER, 2005), no crescimento (OJEDA et al., 2000), na esteroidogênese (GREISEN et al., 2001), na inibição da atresia folicular (FORTUNE, 2003) e no estímulo à competência oocitária (ARAÚJO et al., 2011). Dentre os hormônios que podem potencialmente influenciar o crescimento e desenvolvimento folicular in vitro, destacam-se a insulina (INS), o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio do crescimento (GH). Baseado em estudos in vitro, a utilização de FSH, adicionado em momentos específicos do cultivo e de forma progressiva (100 ng/ml, do dia 0 ao 6; 500 ng/ml do dia 6 ao 12; 1000 ng/ml, do dia 12 ao 18) combinada à insulina na concentração 10 µg/ml promoveu melhores taxas de sobrevivência, de formação de antro, de crescimento e de retomada da meiose no cultivo de folículos pré-antrais isolados caprinos, (SARAIVA et al., 2011). A adição de GH (50 ng/ml) ao meio de cultivado mencionado anteriormente resultou na produção do primeiro embrião caprino a partir de folículo pré-antral crescido in vitro, sendo o melhor resultado reportado na literatura para a espécie caprina até o momento (MAGALHÃES et al., 2011). Em ambos estudos anteriores, a insulin foi utilizada em altas concentrações (10 µg/ml). No entanto, em outro estudo, a adição de baixas concentrações de

18 17 insulina (10 ng/ml) mostrou-se mais eficaz na manutenção da sobrevivência e na promoção do desenvolvimento folicular e na da retomada da meiose (CHAVES et al., 2012). Embora a insulina, o FSH e o GH tenham sido utilizados no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos, o equilíbrio adequado das concentrações de insulina e do FSH em meio de cultivo contendo GH ainda permanece desconhecido. Tendo em vista a importância do presente estudo, a revisão de literatura a seguir abordará aspectos relacionados ao (à): ovário dos mamíferos, oogênese e foliculogênese, folículos ovarianos, população e atresia folicular, MOIFOPA, cultivo in vitro de folículos préantrais, insulina (INS), hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio do crescimento (GH). 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 O ovário dos mamíferos O ovário da maioria dos mamíferos está dividido em duas regiões: 1) medular, localizada na porção mais interna; 2) cortical, localizada na porção mais externa (Fig. 1) (NASCIMENTO et al., 2008). Externamente, o córtex ovariano está circundado por epitélio germinativo. No córtex ovariano estão presentes os folículos ovarianos e/ou corpos lúteos em vários estágios de desenvolvimento. A medula ovariana, por sua vez, é composta por tecido conjuntivo fibroelástico, nervos e vasos sanguíneos e linfáticos (HAFEZ, 2004). Esta distribuição ocorre na maioria dos mamíferos. Entretanto, a égua tem a particularidade de apresentar a inversão entre essas duas regiões, de modo que o córtex está situado mais internamente e a medula, externamente (NASCIMENTO et al., 2008). O ovário exerce duas importantes funções fisiológicas: 1) gametogênica, liberação de oócitos maturos (ovulação) aptos a serem fecundados (BARNETT et al., 2006) e 2) endócrina, produção de hormônios, fatores de crescimento e peptídeos (HIRSHFIELD, 1991). Outra função importante exercida pelos folículos está relacionada à manutenção da viabilidade oocitária, assegurando o crescimento e a maturação dos oócitos.

19 18 Corpo lúteo (copo albicans) Túnica albugínea Folículo primário Córtex Oócito Células da granulosa Folículo secundário Mesovário e vasos sanguíneos Epitélio germinativo Folículo de Graaf Folículo primordial Antro Oócito Ligamento do ovário Medula Teca Oócito ovulado Zona pelúcida Corpo lúteo Desenvolvimento Corpo lúteo Figura 1. Ilustração do ovário de mamíferos e suas estruturas. Adaptado de Oogênese e foliculogênese A oogênese pode ser definida pelo processo de formação e de diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) da fêmea até a formação do oócito haplóide fecundado (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). A quantidade de oócitos presentes nos ovários adultos origina-se a partir de um número definido de CGP que são derivadas da massa celular interna do blastocisto durante o desenvolvimento embrionário (PICTON, 2000). O blastocisto é constituído pelo trofoblasto e pelo botão embrionário. O botão embrionário dará origem ao ectoderma, mesoderma e endoderma. O saco vitelínico tem origem a partir do endoderma, que, por sua vez, dará origem às CGP. Estas se multiplicam por mitose e diferenciam-se em oogônias (FIGUEIREDO et al., 2008). A população de oogônias se expande através de um número prédeterminado, espécie específica, de divisões mitóticas até que as células entrem em meiose e tornem-se os oócitos primários. Na primeira divisão meiótica das oogônias, estas estão localizadas nas zonas mais internas do córtex ovariano e durante o desenvolvimento seguem para zonas mais externas. Após o início da meiose, os oócitos primários progridem para as fases de leptóteno, zigóteno e paquíteno até atingir a fase de diplóteno, da primeira divisão meiótica. Ocorre um aumento no tamanho das células à medida que o desenvolvimento do oócito progride à fase de diplóteno. Várias alterações importantes ocorrem no oócito primário:

20 19 recombinação do material genético materno e paterno; polarização nuclear de organelas, que é essencial para o metabolismo do oócito, dependente da atividade dos microtúbulos. Após essa reorganização, no estádio de diplóteno da prófase I, ocorre a primeira interrupção da divisão meiótica, em que os oócitos permanecem em vesícula germinativa (VG) até a puberdade (PICTON, 2000). O início da meiose nos oócitos coincide com o início da foliculogêse, que compreende a formação, o crescimento e a maturação folicular, tendo início desde a formação do folículo primordial e culminando com o folículo maturado ou pré-ovulatório. Quando o animal atinge a puberdade, com o pico do FSH e do hormônio luteinizante (LH), os oócitos crescidos retomam a meiose e o núcleo sai de VG para diacinese. Em seguida, inicia-se o processo de rompimento da VG, quando ocorrerá a expulsão do primeiro corpúsculo polar, resultando na formação do oócito secundário e ocorrendo a segunda parada da meiose. O oócito retomará a meiose somente se for fecundado (FIGUEIREDO et al., 2008).

21 20 Oogônia Figura 2. Esquema ilustrativo da formação dos oócitos e folículos, destacando a relação dos processos de oogênese e foliculogênese na maioria dos mamíferos. LH, hormônio luteinizante; MCI, massa celular interna. 2.3 Folículos ovarianos O folículo é considerado a unidade morfofuncional do ovário e é constituído por um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e da teca).

22 21 Os folículos podem ser classificados, de acordo com o grau de desenvolvimento, em folículos pré-antrais ou não cavitários e em folículos antrais ou cavitários (FIGUEIREDO et al., 2008) (Fig. 3). Figura 3. Ilustração caracterizando a morfologia de folículos ovarianos pré-antrais (A, B e C) e antrais (D e E). (A) folículo primordial; (B) folículo primário; (C) folículo secundário; (D) folículo terciário; (E) folículo pré-ovulatório. 1. Oócito; 2. Células da granulosa; 3. Zona pelúcida; 4. Células da teca; 5. Células da teca interna; 6. Células da teca externa; 7. Antro; 8. Células do cumulus; 9. Lâmina basal. Fonte: Folículos pré-antrais Os folículos pré-antrais constituem o pool de reserva ovariano não renovável, que será utilizado ao longo da vida reprodutiva da fêmea (SILVA-SANTOS et al., 2011). O desenvolvimento folicular inicia quando um pool de folículos primordiais sai do estádio de quiescência (fase diplóteno da prófase I) e são recrutados a crescerem de forma gradual e contínua. Esta fase de desenvolvimento folicular inicial é independendente das gonadotrofinas hipofisárias. Ainda que folículos nesta fase inicial de desenvolvimento possam expressar o receptor de FSH, no entanto, as gonadotrofinas não parecem ser essenciais para o crescimento folicular inicial (THOMAS et al., 2003). Os folículos ovarianos pré-antrais são representados pelos folículos primordiais, de transição, primários e secundários, que podem ser diferenciados entre si pela forma e pelo número de camadas de células da granulosa que envolve o oócito imaturo. Folículos primordiais: representam 95% da totalidade da população folicular ovariana; são os menores folículos, constituídos por um oócito quiescente, imaturo e circundado por uma camada de células da granulosa de morfologia pavimentosa (SILVA, 2005) (Fig. 3A). O núcleo do oócito é relativamente grande e ocupa uma

23 22 posição central. O pool de folículos primordiais é mantido em quiescência até que ocorra a ativação folicular (KIM, 2012). Folículos de transição: a mudança na morfologia das células da granulosa (CG) de pavimentosa para cúbica, marca a ativação folicular dando início ao desenvolvimento de folículos primordiais (HIRSHFIELD, 1991). Esta fase de transição entre os estádios primordial e primário dá origem a folículos com CG pavimentosas e cúbicas, caracterizando o folículo de transição (FORTUNE et al., 2003). Folículos primários: caracterizam-se por apresentarem uma única camada de células cúbicas da granulosa circundando o oócito imaturo (SILVA, 2005) (Fig. 3B). Folículos secundários: caracterizam-se com o desenvolvimento de uma segunda camada de CG, progride através da proliferação de até seis ou sete camadas e termina com o início do desenvolvimento de uma cavidade antral (FORTUNE et al., 2003) (Fig. 3C). A partir de estádios mais avançados, pode ocorrer a presença de células da teca (CT) e, também, pode ser visualizada a zona pelúcida (FIGUEIREDO et al., 2008) Folículos antrais Os folículos são denominados antrais quando ocorre uma intensa proliferação de células da granulosa formando uma cavidade preenchida por fuido chamada de antro (FIGUEIREDO et al., 2008). O fluido antral é um composto rico em substâncias reguladoras derivadas do sangue ou das secreções das células foliculares, como por exemplo, gonadotrofinas, esteroides e fatores de crescimento. A produção desse fluido é intensificada pelo aumento da vascularização folicular e permeabilidade dos vasos sanguíneos, que ocorrem com o desenvolvimento do folículo (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005). No estádio antral, as células da granulosa são diferenciadas em células do cumulus (mais próximas ao oócito) e células murais (mais afastadas do oócito) (FIGUEIREDO et al., 2008), também as células da teca começam a se diferenciar das células circundantes do estroma (THOMAS et al., 2003). Quando este estádio é alcançado, os folículos se tornam dependentes das gonadotrofinas para um maior crescimento e desenvolvimento folicular (NAYUDU & OSBORN, 1992). Em pequenos folículos antrais, as células da teca expressam enzimas envolvidas na biossíntese de não há expressão de mrna para aromatase nas CG desses pequenos folículos antrais. Isso pode indicar que a progesterona e andrógenos e

24 23 estrógenos não são os principais hormônios esteróides formados pelos primeiros folículos antrais (VAN DEN HURK et al., 2005). Os folículos antrais podem ser subdivididos em duas classes: 1) terciários (Fig. 3D), que ainda possuem o oócito imaturo; 2) pré-ovulatório ou de Graaf (Fig. 3E; Fig. 4), que, na maioria das espécies, contém um oócito maturado (FIGUEIREDO et al., 2008). A B Figura 4. A) Ilustração de um folículo de Graaf. Co, cumulus oophorus; Ge, epitélio germinativo; Lf, líquido folicular; Mg, membrana granulosa; Te, teca externa; Ti, teca interna. (B) Estrutura da parede do folículo de Graaf mostrando como as células granulosas são privadas de um suprimento sanguíneo pela membrana basal. 2.4 População e atresia folicular O número de folículos ovarianos é bastante variável entre as espécies, podendo variar de milhares (1.500 na camundonga: SHAW et al., 2000; na cabra: LUCCI et al., 1999; na ovelha: DRIANCOURT, 2001; na vaca: BETTERIDGE et al., 1989) à milhões ( na mulher: ERICKSON, 1986). O ovário das fêmeas dos mamíferos apresenta, ao nascerem, milhares de folículos primordiais que têm o potencial de serem utilizados para a produção in vitro de embriões em larga escala. No entanto, a maioria desses folículos (99,9%) não chega a ovular, sendo eliminados por um processo natural conhecido como atresia folicular, seja por via degenerativa e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et al., 2008). As células envolvidas no mecanismo de apostose são na maioria GC; no entanto, CT ocasionalmente também sofrem apoptose. Folículos antrais iniciais são mais susceptíveis a sofrer atresia do que folículos pré-antrais (DANILOVISH et al., 2000).

25 24 Diversos fatores e hormônios adicionados ao meio de cultivo in vitro vêm sendo estudados, visando reduzir a atresia folicular em diversos estádios de desenvolvimento. 2.5 MOIFOPA A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) é uma biotécnica da reprodução que vem sendo desenvolvida como alternativa para a recuperação de folículos pré-antrais (FOPAs), visando à obtenção de um grande número de oócitos competentes para a produção de embriões, bem como poderá contribuir com importantes aplicações para a pesquisa fundamental. Esta biotécnica consiste no isolamento, conservação (resfriamento e criopreservação) e cultivo in vitro (CIV) de folículos pré-antrais e, posteriormente, os oócitos poderão ser utilizados na maturação in vitro (MIV) e na fecundação in vitro (FIV) (FIGUEIREDO et al., 2008). Até o presente momento, o resultado mais promissor proveniente dessa biotécnica foi o nascimento de crias vivas na espécie murina (O BRIEN et al., 2003). No entanto, nas espécies domésticas, apenas um número restrito e variável de embriões têm sido relatado (suíno: WU et al., 2007; bubalino: GUPTA et al., 2008; ovino: ARUNAKUMARI et al., 2010, LUZ et al., 2012; caprino: MAGAHÃES et al., 2011). Embora esses resultados sejam promissores, estudos acerca dos fatores e processos que afetam o desenvolvimento dos folículos pré-antrais são imprescindíveis para aumentar as taxas de produção in vitro de embriões. 2.6 Cultivo in vitro de folículos pré-antrais Uma variedade de métodos foi desenvolvida para a manutenção e/ou crescimento de folículos pré-antrais in vitro (FORTUNE et al., 2003). O sistema de cultivo e a composição do meio são fatores fundamentais para promover o desenvolvimento durante o cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais a estágios mais avançados (PENG et al., 2010). Diferentes sistemas de cultivo têm sido desenvolvidos para manter a viabilidade e promover o crescimento de folículos pré-antrais in vitro (VAN DEN HURK et al., 2000). Podemos citar dois sistemas de cultivo utilizados na MOIFOPA: 1) cultivo de fragmentos de córtex ovariano ou do ovário inteiro, que apresenta como vantagens a facilidade para executar este modelo experimental, a manutenção da integridade estrutural do tecido e das interações entre as células do estroma circundante com os folículos; 2) cultivo de folículos isolados, que além de possibilitar o acompanhamento individual durante o cultivo, permite uma maior perfusão do meio para o folículo (ABIR et al., 2006). O sistema de cultivo em fragmento

26 25 ovariano ou do órgão inteiro é importante para o estudo de fatores que podem afetar a ativação e o desenvolvimento folicular, sendo que ovários murinos são suficientemente pequenos e, por esse motivo, cultivados inteiros; em contraste, ovários dos mamíferos domésticos são grandes e, portanto, cultivados em fragmentos do córtex ovariano (FORTUNE et al., 2003). Em relação ao sistema de cultivo do tipo isolado, este pode ser realizado de duas formas: 1) bidimensional (2D), quando o folículo se desenvolve sobre a própria placa de cultivo ou sobre uma matriz extracelular, como por exemplo, de colágeno (DEMEESTERE et al., 2005); 2) tridimensional (3D), quando o folículo se desenvolve encapsulado em gota de alginato (XU et al., 2010). Avanços no sistema de cultivo 3D também fornecem um modelo para estudar os índices de desenvolvimento folicular individualmente, caracterizando a função endócrina e a parácrina sobre o crescimento folicular e a maturação oocitária (XU et al., 2010). Outra estratégia de cultivo pode ser realizada em dois passos: inicialmente ocorre a ativação e o desenvolvimento folicular no sistema de cultivo em fragmento do córtex ovariano; em seguida, os folículos são isolados a partir desses fragmentos e cultivados isoladamente (O BRIEN et al., 2003). Ainda, em alguns estudos de cultivo in vitro de folículos pré-antrais, tem sido utilizado o sistema de cultivo com co-cultivo em animais domésticos como suínos (WU et al., 2001), bubalinos (GUPTA et al., 2008) e caprinos (DUARTE et al., 2011). O cultivo de FOPA em grupo ou co-cultivados com células do cumulus, da granulosa e mesenquimais ovarianas demonstrou efeito benéfico sobre o desenvolvimento folicular (GUPTA et al., 2008; DUARTE et al., 2011). Podem ocorrer interações através das vias endócrina, da parácrina e da autócrina entre os grupos de folículos na mesma fase de desenvolvimento, estabelecendo diferenças que estimulem ou que inibam o crescimento uns dos outros (BAKER, 1999). A composição do meio é um importante fator para a obtenção de sucesso durante o cultivo de folículos pré-antrais in vitro. Sabe-se que os folículos podem ser potencialmente influenciados por fatores de crescimento produzidos pelas células do estroma e por outros folículos, ou por fatores produzidos dentro dos próprios folículos (hormônios e fatores de crescimento) (FORTUNE, 2003). Assim, diversos autores têm investigado o efeito de vários componentes no cultivo in vitro de folículos pré-antrais, tanto de animais de laboratório como de animais domésticos. Desta forma, a avaliação do efeito de hormônios como, por exemplo, a insulina, o FSH e o GH, sobre o crescimento e a maturação oocitária poderá contribuir para uma melhor compreensão da foliculogênese.

27 Insulina A insulina é produzida na porção endócrina do pâncreas, organizada como discretas ilhotas (ilhotas de Langerhans), que contêm quatro tipos de células para a síntese de diferentes hormônios. As células Beta (β) são as mais numerosas e as responsáveis pela produção de insulina. Este hormônio é uma proteína que consiste em duas cadeias de aminoácidos, designadas A e B, contendo 21 e 30 aminoácidos, respectivamente, sendo ligadas por duas pontes dissulfeto. Embora haja algumas diferenças na composição de aminoácidos ente as espécies de mamíferos, essas diferenças são pequenas; como resultado, as atividades biológicas da insulina não são altamente espécie-específica (CUNNINGHAM, 2008). Receptores de insulina estão expressos em quase todos os tecidos dos mamíferos, inclusive no estroma e nas células foliculares ovarianas (EL-ROEIY et al., 1993). A expressão de receptores de insulina (INSR) é regulada por ação hormonal e pode agir como uma resposta de sinalização intracelular em GC durante o desenvolvimento folicular bovino, bem como o sistema insulina-receptor pode suportar o desenvolvimento de folículos préovulatórios (SHIMIZU et al., 2008). Além disso, a interação do FSH com a insulina influencia positivamente a expressão do mrna para INSR no cultivo in vitro de folículos préantrais caprinos (CHAVES et al., 2012). A insulina além de participar da regulação da glicose também participa de outros mecanismos celulares, como o transporte de aminoácidos, o metabolismo lipídico e a síntese proteica (CHEATHAM & KHAN, 1995). A insulina promove o desenvolvimento folicular e proporciona benefícios à maturação oocitária durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos (CHAVES et al., 2011). A ação desse hormônio foi capaz de manter a viabilidade e a morfologia de folículos humanos cultivados in vitro (LOUHIO et al., 2000), além de promover o desenvolvimento folicular em caprinos (CHAVES et al., 2012) e em bovinos (ITOH et al., 2008). Além disso, a associação de insulina às gonadotropinas (FSH e LH) exerce uma ação sinérgica, promovendo a formação do antro e o crescimento folicular em macacos rhesus (XU et al., 2010), em cabras (SARAIVA et al., 2011) e em vacas (ITOH, et al., 2008); bem como o crescimento oocitário e a proliferação de células da granulosa e da teca em vacas (ITOH, et al., 2008). 2.8 Hormônio folículo estimulante O hormônio folículo estimulante (FSH), assim como o hormônio luteinizante (LH), são gonadotrofinas produzidas na hipófise (adenohipófise). Esses hormônios exercem

28 27 uma ação sinérgica no desenvolvimento folicular e na ovulação. Enquanto o papel do FSH é mais dominante durante o crescimento folicular, o LH passa a ter maior desempenho durante os estádios finais da maturação folicular (CUNNINGHAM, 2008). Os receptores para FSH (FSHR) são do tipo acoplado à proteína G, sendo divididos em três domínios (extracelular, transmembranário e intramembranário) (GUDERMANN et al., 1995). A expressão de mrna para FSHR foi observada em células da granulosa de folículos pré-antrais em crescimento logo após a ativação quanto em folículos antrais na espécie bovina (XU et al., 1995) e em complexos cumulus-oócito (CCOs) e em células da granulosa e da teca de pequenos folículos antrais em caprinos (SARAIVA et al., 2011). Folículos em estádio de desenvolvimento mais precoce são relativamente independentes das gonadotrofinas (VAN DEN HURK et al., 2005). Em sistemas de cultivo in vitro, o FSH exerce efeito sobre o desenvolvimento folicular, provando a responsividade in vitro de folículos em fases iniciais a esta gonadotrofina (ADRIAENS et al., 2004). O FSH promoveu a manutenção da sobrevivência e a proliferação de células da granulosa de folículos pré-antrais de ratas (ADRIAENS et al., 2004) e de mulheres (WRIGHT et al., 1999). Além disso, o FSH parece desempenhar um papel importante na atresia folicular, prevenindo a apoptose em folículos pré-antrais e antrais (WRIGHT et al., 1999). A combinação do FSH com outros hormônios ou fatores de crescimento pode exercer uma ação sinérgica ou inibitória no desenvolvimento de folículos cultivados in vitro. Quando associado à tiroxina 4 (T4), ao GH e ao fator de crescimento epidermal (EGF) no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais de fetos caprinos promove o crescimento, a formação do antro e a extrusão de oócitos (Amin et al., 2013). Em outros estudos, meios que foram suplementados com FSH em combinação com o fator de diferenciação do crescimento- 9 (GDF-9) ou com fator de crescimento de fibroblastos (FGF) mantiveram a sobrevivência e o crescimento folicular, além de induzir a ativação de folículos primordiais após o cultivo de fragmentos do córtex ovariano bovino (TANG et al., 2012). A associação das gonadotropinas (FSH e LH) com a insulina induz a formação inicial do antro, e aumenta o diâmetro folicular e oocitário e promove a proliferação de células da granulosa e da teca em bovinos (ITOH et al., 2008).

29 Hormônio do crescimento O hormônio do crescimento (GH) é produzido pelos somatótrofos acidófilos da hipófise anterior. Este hormônio é espécie-específica, liga-se a receptores nos tecidos-alvo com a finalidade de promover o crescimento (CUNNINGHAM, 2008). A presença de receptores de GH (GHR) e da proteína em COCs de pequenos e grandes folículos antrais e em células da granulosa/teca de grandes folículos antrais caprinos sugere o controle do GH nos estádios finais da foliculogênese. Entretanto, apesar de não ter sido observado a presença de GHR em folículos pré-antrais (primordial, primário e secundário), esses receptores estavam presentes nas células do estroma ao redor desses folículos, sugerindo o controle indireto nas fases iniciais da foliculogênese através da regulação da expressão de fatores intraovarianos de células do estroma (MARTINS et al., 2014). Estudos in vitro e in vivo têm revelado a importância deste hormônio durante o desenvolvimento folicular (SIROTKIN; MAKAREVICH, 2002), induzindo o crescimento de folículos pré-antrais murinos (LIU et al., 1998; NAKAMURA et al., 2012) e caprinos (MARTINS et al., 2014), além de promover a maturação dos oócitos murinos (NAKAMURA et al., 2012) e reduzir a apoptose em folículos pré-antrais em camundongos (DANILOVICH et al., 2000). Ainda, desempenha um papel importante na proliferação de células da teca em folículos pré-antrais isolados murinos (KOBAYASHI et al., 2000) e em células da granulosa bovinas (LANGHOUT et al., 1991). Outra função desse hormônio é a sua ação antioxidante, reduzindo os danos de isquemia/reperfusão em tecidos ovarianos, com base em achados clínicos e bioquímicos (YIGITER et al., 2011). O efeito do GH combinado ao FSH no cultivo de fragmentos ovarianos caprinos promoveu a manutenção da sobrevivência folicular e da integridade ultra-estrutural e a ativação de folículos primordiais (MAGALHÃES-PADILHA et al., 2012), além de modular a produção de estradiol e progesterona em células da granulosa de ratas (NAKAMURA et al., 2012). Quando combinado à insulina estimulou a proliferação de células da granulosa bovinas (LANGHOUT et al., 1991). Recentemente, foi descrito que a utilização do GH no meio de maturação contendo IGF-I promoveu o desenvolvimento de oócitos equinos cultivados in vitro (PEREIRA et al., 2012), bem como foi observada a presença de GHR em estruturas foliculares ovarianas, mediando um efeito positivo durante a maturação oocitária equina (PEREIRA et al., 2013).

30 29 3 JUSTIFICATIVA A execução de um projeto de pesquisa se justifica pela contribuição original dos resultados à ciência. Dessa forma, serão abordados a seguir três aspectos que justificaram a execução deste trabalho: importânca do modelo animal, relevância e originalidade do protocolo utilizado. a. Escolha da espécie: A criação de pequenos ruminantes na região Nordeste do Brasil, sobretudo da espécie caprina, onde representam mais de 90,0% do rebanho nacional, desempenha extrema importância socioeconômica, em função do seu importante papel na produção de carne, de leite e de pele. A espécie caprina pode ser utilizada como modelo experimental por apresentar semelhanças morfofisiológicas com o ovário humano, além de contribuir para o aperfeiçoamento de biotécnicas reprodutivas, visando maximizar o potencial reprodutivo de animais domésticos de alto valor zootécnico ou em processo de extinção, bem como auxiliar no tratamento de mulheres com problemas de infertilidade. b. Relevância do protocolo: A maturação de oócitos e a produção de embriões a partir do cultivo in vitro de folículos pré-antrais já foram relatadas em caprinos (MAGALHÃES et al., 2011). Entretanto, apesar de ter representado um avanço na técnica, as taxas de maturação de oócitos a partir de folículos pré-antrais caprinos, bem como de outras espécies domésticas, são ainda muito baixas quando comparadas a oócitos crescidos in vivo recuperadosdos a partir de folículos antrais. Este fato pode ser devido a falhas no desenvolvimento folicular ocorridas in vitro, bem como às condições inadequadas de maturação e de fertilização in vitro. Na tentativa de melhorar os meios de desenvolvimento de folículos pré-antrais in vitro, o Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA) vem testando dezenas de hormônios e fatores de crescimento. Dentre os vários hormônios estudados, destacam-se a insulina (INS), o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio do crescimento (GH), que desempenham um papel importante na regulação do desenvolvimento folicular. Baseado em estudos in vitro no cultivo de folículos pré-antrais caprinos isolados, a utilização de FSH, adicionado em momentos específicos do cultivo e de forma progressiva (FSH-SEQ: 100 ng/ml, do dia 0 ao 6; 500 ng/ml, do dia 6 ao

31 30 12; 1000 ng/ml, do dia 12 ao 18) combinada à insulina na concentração 10 µg/ml promoveu melhores taxas de sobrevivência, de formação de antro, de crescimento e de retomada da meiose, quando comparado à utilização do FSH em concentração fixa (100 ng/ml) (SARAIVA et al., 2011). Com a mesma concentração de insulina (10 µg/ml) combinada com FSH-SEQ e GH (50 ng/ml), observou-se um papel importante no crescimento in vitro e na maturação de oócitos, culminando com a obtenção do primeiro embrião caprino (MAGALHÃES et al., 2011). No entanto, o FSH-SEQ associado à insulina na concentração de 10 ng/ml foi mais eficiente na manutenção da sobrevivência, no desenvolvimento folicular e na promoção da retomada da meiose (CHAVES et al., 2012). Embora a importância da INS, do FSH e do GH no controle da foliculogênese tenha sido bem estabelecida, os efeitos desses hormônios quando utilizados em diferentes concentrações e combinações têm evidenciado resultados divergentes. c. Originalidade do protocolo: O presente estudo demonstra, pela primeira vez, a influência da insulina e do FSH, em diferentes concentrações e combinações, em meio contendo GH no cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos e os seus efeitos sobre a expressão relativa de mrna para FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17 e 3ßHSD e sobre a produção de estradiol.

32 31 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS Diante do exposto, foram formuladas as seguintes hipóteses científicas: A insulina e o FSH, de forma concentração-dependente, influenciam positivamente na manutenção da sobrevivência e no crescimento de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro na presença de GH, permitindo que seus oócitos se tornem meioticamente competentes. A insulina e o FSH, de forma concentração-dependente, induzem a secreção de estradiol e a expressão do mrna para FSHR, INSR, GHR, 3βHSD, CYP17 e CYP19A1, a partir folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro em meio contendo GH.

33 32 5 OBJETIVOS 5.1 Geral: Avaliar o efeito de diferentes concentrações e combinações da insulina e do FSH em meios de cultivo contendo GH sobre o desenvolvimento folicular e a maturação oocitária a partir de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro. 5.2 Específicos: Estudar o efeito de diferentes concentrações da insulina na ausência ou presença do FSH em concentração fixa ou em concentrações crescentes em meios de cultivo contendo GH sobre: o a sobrevivência, formação de antro e crescimento folicular e a maturação de oócitos de folículos pré-antrais caprinos isolados A produção de estradiol, bem como sobre a expressão gêncica para FSHR, INSR, GHR e para as enzimas esteroidogênicas a partir de folículos pré-antrais caprinos isolados.

34 33 6 CAPÍTULO 1 Balanço nas concentrações da insulina e do FSH melhora o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos isolados em meio contendo GH Balance of insulin and FSH concentrations improves the in vitro development of isolated goat preantral follicles in medium containing GH Artigo submetido ao periódico: Animal Reproduction Science Em: junho de 2015

35 34 Balance of insulin and FSH concentrations improves the in vitro development of isolated goat preantral follicles in medium containing GH A.C.A. Ferreira *, a, N.A.R. Sá a, D.D. Guerreiro a, H.H.V. Correia a, J. Leiva-Revilla a, C.H. Lobo b, C. Maside a, V.R. Araújo a,c, G.A. Apgar d, F.Z. Brandão e, J.R. Figueiredo a, and C.C. Campello a a Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Faculty of Veterinary, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. b Laboratory of Animal Physiology, Department of Animal Science, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. c Professor of the Health Sciences Center, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil. d Professor of Department of Animal Science, Food and Nutrition, Southern Illinois University-Carbondale, USA. e Associate Professor of Department of Animal Reproduction, Faculty of Veterinary, Federal University Fluminense, Rio de Janeiro-RJ, Brazil. *Corresponding address: A.C.A. Ferreira, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré- Antrais (LAMOFOPA), Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi, Fortaleza, CE Brasil, CEP: Tel.: ; Fax: annaclaraaccioly@yahoo.com.br