AVALIAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO DE CERVEJA PILSEN PELO USO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

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1 ISSN ISSN on line Alim. Nutr., Araraquara v. 22, n. 3, p , jul./set AVALIAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO DE CERVEJA PILSEN PELO USO DE DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE Daniele Souza de CARVALHO* Rui Carlos ZAMBIAZI** RESUMO: A redução do tempo de processamento da cerveja é um aspecto importante em nível de microcervejarias. Diferentes concentrações de levedura Saccharomyces cerevisiae foram testadas com o objetivo de acelerar o processo fermentativo da cerveja tipo Pilsen. O mosto foi obtido pelo processo de infusão, em escala industrial e os processos de fermentação e maturação foram realizados em nível laboratorial. A cerveja foi elaborada a partir de uma formulação padrão (T1) contendo concentração de levedura: mosto de 10mL.L -1. Foram utilizadas outras duas formulações, alterando a concentração inicial para 12,5mL.L -1 (T2) e 15 ml.l -1 (T3), respectivamente. O mosto cervejeiro foi fermentado a 12ºC±1ºC. O processo fermentativo transcorreu até a amostra atingir 3,5ºP (Graus Plato), quando a cerveja foi engarrafada e maturada por 4 dias a 5ºC e outros 11 dias a 0ºC. Foram realizadas as análises físicas e químicas da cerveja maturada. O aumento da concentração de levedura no mosto ocasionou uma redução considerável no tempo de fermentação, além de um aumento na concentração de ésteres no produto final. PALAVRAS-CHAVES: Chope; maturação; fermentação; Saccharomyces cerevisiae. INTRODUÇÃO A cerveja é o produto obtido a partir da fermentação alcoólica de grãos malteados, principalmente cevada, água, lúpulo e levedura, sendo facultativa a adição de outra fonte amilácea como milho, arroz e trigo. 4,9,19 Dentre os fatores que influenciam nas características da cerveja, pode-se citar composição do mosto, concentração e características da levedura, conteúdo de oxigênio, temperatura e pressão no meio. 8,17 O tempo de fermentação é uma característica importante do processo industrial, pois limita o período necessário para a obtenção da cerveja. O aumento da temperatura de fermentação, da concentração de levedura e a agitação constituem-se nos fatores que podem reduzir o tempo de fermentação, sendo muito desejável para redução do tempo de processamento da cerveja em microcervejarias, desde que mantenha a qualidade do produto. 17 Normalmente utilizam-se concentrações de células viáveis na ordem de 10 6 a 10 8 células/ml para a produção de cerveja. 21 O aumento da concentração de levedura provoca apenas pequenas alterações nas características da cerveja, além de reduzir o volume final de biomassa retirada após a fermentação. 17 Com base no exposto, este estudo objetivou avaliar as características da cerveja obtida pela avaliação do processo fermentativo, utilizando diferentes concentrações de levedura Saccharomyces cerevisiae. MATERIAL E MÉTODOS Materiais Para a elaboração da cerveja utilizou-se malte tipo Pilsen, lúpulo da variedade Galena e levedura Saccharomyces cerevisiae. O lúpulo e a levedura foram armazenados a 5 o C até o momento da sua utilização. A água utilizada foi oriunda da rede de distribuição de Pelotas-RS, sem passar por qualquer tipo de tratamento adicional na indústria. Todos os ingredientes foram cedidos pela Movesa Indústria e Comércio de Bebidas Ltda- Pelotas/RS. Processo de Elaboração da Cerveja Para a elaboração da cerveja foi utilizado, como processo padrão, as especificações seguidas pela Movesa Indústria e Comércio de bebidas Ltda (Pelotas/RS), sendo que até a etapa de aeração do mosto o experimento foi conduzido nas instalações desta indústria. O fluxograma do processo de elaboração da cerveja pode ser observado na Figura 1. Moagem e Mostura Inicialmente, 100kg de malte foram triturados em moinho de dois rolos (marca Egisa), sendo após enviados para a sala de brassagem, onde foram colocados na tina de * Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Agroindustrial Curso de Mestrado Faculdade de Agronomia Universidade Federal de Pelotas Pelotas RS Brasil. ** Centro de Ciências Químicas, Farmacêutica e de Alimentos Faculdade de Agronomia Universidade Federal de Pelotas Pelotas RS Brasil. 351

2 mostura, construída de aço inoxidável(aisi 304), e provida de camisa de vapor, sendo então adicionados 260L de água potável. O processo de infusão com malte: água, ocorreu na proporção de 1:3 (m/v) sob aquecimento. A curva de aquecimento da mistura malte: água durante a produção do mosto variou de 20 a 76ºC, por um período de 120 minutos (Figura 2) para a atuação dos diferentes grupos enzimáticos presentes no malte. Clarifi cação do mosto Após o período de infusão, foi realizada a trasfega do mosto juntamente com o bagaço (partículas insolúveis do malte) para a tina de clarificação, construída de aço inoxidável (AISI 304), para propiciar a separação do mosto em relação ao bagaço. Após a separação do mosto (primário), que retornou para a tina de mostura, o bagaço foi lavado com 350L de água a 76 o C, obtendo-se dessa maneira o mosto secundário. Este também foi enviado para a tina de mostura, para homogeneização e fervura. Fervura, separação do trub quente, resfriamento e aeração Após a homogeneização, o mosto foi aquecido a 100 o C, permanecendo nesta temperatura durante 80 minutos. O lúpulo foi adicionado ao mosto em dois estágios, 100g quando a temperatura atingiu 100ºC e 120g aos 65 minutos de fervura. Após a etapa de fervura, o mosto ficou em repouso por 20 minutos para ocorrer a sedimentação do trub quente (proteína coagulada e resinas de lúpulo), sendo em seguida resfriado a 12 o C em trocador de placas (sistema de 24 placas, marca Dantherm), aerado com ar estéril numa vazão de 8m 3 /h e colocado em três fermentadores distintos, todos com capacidade de 10L. Fermentação e Maturação A partir desta etapa o processo foi realizado nas dependências da Universidade Federal de Pelotas, na planta Malte Moagem água Mosturação Clarificação do mosto bagaço lúpulo Fervura do mosto Resfriamento do mosto Ar estéril Aeração do mosto levedura Fermentação análises Engarrafamento Maturação Cerveja pronta para análises FIGURA 1 Processo de elaboração de cerveja. 352

3 de Processamento de Alimentos do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial. A levedura foi inoculada em 8L de mosto (8L em cada fermentador) na forma pastosa. Foram realizados três tratamentos; no primeiro fermentador foi adicionado 10mL de levedura por L de mosto ( células viáveis/ml), denominado de cerveja padrão (T1); 12,5mL de levedura por L de mosto (1, células viáveis.ml) no segundo fermentador (T2); e de 15mL de levedura por L de mosto (1, células viáveis/ml) no terceiro fermentador (T3). Os três fermentadores foram colocados em câmara fria a 12 o C±1 o C. O período de fermentação variou entre 39 e 64 horas, sendo encerrado quando as amostras atingiram no mínimo 3,5 o P. Ao final do período de fermentação a cerveja foi transferida para garrafas de vidro de cor âmbar de capacidade de 600mL, previamente esterilizadas. Adicionou-se a cada recipiente 0,5g de sacarose, vedou-se, e colocou-se em câmera fria a 5 o C. Manteve-se a temperatura da câmara a 5ºC por um período de 4 dias, e, após, ajustou-se a temperatura para 0ºC, deixando a cerveja nesta temperatura por mais 11 dias, para ocorrer a maturação do produto. Para cada tratamento foram realizadas três repetições. Análises Físicas e Químicas Durante a Fermentação e Após a Maturação da Cerveja Análises físicas e químicas foram realizadas em triplicata com alíquotas de 600mL, retiradas, no tempo 0 horas (logo após a obtenção do mosto) as 15, 39 e 64 horas de fermentação, e após o período de maturação (424 horas). Determinou-se o ph, acidez fixa, acidez total, açúcares redutores, açúcares não redutores, teor alcoólico, ésteres e densidade, de acordo com as Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz 13 e das Normas Analíticas do Ministério da Agricultura, 6,7 e os Graus Plato ( P) de acordo com EBC. 2 Realizou-se ainda a contagem de células viáveis com amostras removidas nos períodos de 15, 23, 39, 47 e 64 horas de fermentação, através do método de contagem de células, utilizando a câmara de contagem Neubauer, com auxílio do corante azul de metileno, segundo a American Public Healthy Association. 1 Análise Estatística O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 3 tratamentos e 3 repetições. Os resultados obtidos foram analisados através da análise de variância e para os resultados que apresentaram significância foi realizada a comparação de médias através do teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, utilizando o programa Statistica 5.0. RESULTADOS E DISCUSSÃO Contagem de Células Viáveis Na Figura 3 estão expostos os dados referentes à contagem de células viáveis durante o processo fermentativo a 12ºC ± 1ºC. Utilizou-se como concentração mínima células viáveis/ml de mosto, visto que essa concentração foi obtida a partir da forma de preparo da levedura liofilizada Saccharomyces cerevisiae S-189 e estar de acordo com a concentração mínima adequada para a produção de cerveja. 21 Observou-se um aumento gradativo de células viáveis durante a fermentação para os tratamentos onde se utilizou 10mL (T1) e 12,5mL (T2) de levedura por L de mosto. A concentração de células viáveis na amostra com 10mL.L -1 (T1) somente diferiu estatisticamente (ao nível de 5% de probabilidade) no decorrer da fermentação, no FIGURA 2 Tempo e temperatura utilizados na mosturação. 353

4 tempo de 39 horas e 64 horas; enquanto que para a amostra com 12,5mL.L -1 (T2) ocorreu diferença significativa somente no tempo de 23 horas de fermentação. Observa-se, dessa forma, que o uso de menor número de células viáveis retarda a curva de crescimento da levedura, como pode ser observado na Figura 3. O tratamento contendo a maior concentração de leveduras, 15mL por L de mosto (T3), apresentou um declínio no número de células viáveis após 47 horas de fermentação. A redução no número de células viáveis nesta amostra (T3) pode ter ocorrido por redução de substrato disponível. As curvas de fermentação obtidas nos tratamentos com 10mL.L -1 (T1) e 12,5mL. -1 de levedura (T2) são semelhantes às apresentadas por Hough et al., 12 os quais relatam que durante o período de fermentação ocorre apenas a fase de crescimento celular. Avaliação Física e Química Durante o Processo Fermentativo e no Produto Maturado Observou-se que a maior concentração de leveduras no mosto inferiu no aumento da formação de ésteres na cerveja maturada (Tabela 1), estando também relacionado em parte com a redução na acidez total do produto final. A produção de ésteres está relacionada com as frações de álcoois e acetil CoA, o qual é formado pela descarboxilação oxidativa do piruvato, e possui importância vital no metabolismo das leveduras. Como o etanol é o principal álcool produzido pelas leveduras, o éster mais comum é o acetato de etila. 3,20 Ocorreu um aumento gradativo da acidez total durante o período da fermentação e um declínio durante o período de maturação, coincidindo com o aumento da concentração de ésteres. Existem dados experimentais que indicam uma correlação entre a produção de acetato de etila e acetato de isoamila e de etanol e álcool isoamilico, respectivamente. 14 Entretanto, correlações são afetadas por fatores ambientais como oxigênio, ácidos graxos insaturados, açúcares fermentáveis e nitrogênio. 15 Os dados da Tabela 1 evidenciam que as diferentes concentrações de levedura utilizadas neste estudo não afetaram significativamente a produção de álcool durante a fermentação. A concentração final de álcool para os três tratamentos ficou em 3,94 o GL, a qual é considerada adequada dentro dos padrões da legislação brasileira, em que o teor alcoólico varia de 3 a 8 o GL e semelhante ao encontrado por Silva et. al. 18 No entanto, pode ter ocorrido pequenas alterações no teor alcoólico, a qual não foi suficiente para ser detectada pela metodologia utilizada neste estudo, que foi de destilação seguida de densitometria com auxílio do alcoômetro de Gay Lussac. 5,11 O teor de ésteres apresentou um acréscimo significativo a partir das 15 horas de fermentação em todas as amostras. Estes resultados evidenciam que a maior concentração de levedura infere no aumento da formação de ésteres, concordando com dados descritos por Reinold. 17 A maior concentração de ésteres para todos os tratamentos ocorreu durante o período de maturação das amostras, entre 64 e 424 horas. Os valores encontrados apresentam-se dentro da faixa de concentração de acetato de etila encontrado em cervejas (10-70mg.L -1 ). 10,21 Os ésteres constituem um grupo de compostos que tem uma grande importância no aroma e sabor de cerveja, conferindo um aroma e sabor frutado, além de contribuírem para o corpo do produto. 4,10,16 Quantitativa e qualitativamente, os ésteres formados que desempenham maior importância na cerveja são o acetato de etila e o acetato de isoamila, por atribuírem maior FIGURA 3 Contagem de células viáveis durante a fermentação da cerveja. 354

5 Tabela 1 Análises físico-químicas realizadas durante o processo de fermentação e maturação da cerveja. Determinações Teor alcoólico o GL (20 o C) Ésteres (mg.l -1 acetato de etila) Teor de extrato ( o P) a 20 o C Densidade (20 o C) Acidez Total % (v/v solução normal) Acidez Fixa % (v/v solução normal) Açúcares redutores % (maltose p/v) Açúcares não redutores % (dextrina, p/v) ph Tratamentos Tempo (horas) 0* 15* 39* 64* 424** T1T1 0,00aA 0,97bA 1,94cA 2,94dA 3,94eA T2 0,00aA 0,97bA 1,94cA 2,94dA 3,94eA T3 0,00aA 0,97bA 1,94cA 2,94dA 3,94eA T1 0,03aA 0,51bA 0,55bA 0,80cA 9,67dA T2 0,03aA 0,30bB 0,59cB 8,50dB 10,88eB T3 0,03aA 0,42bC 0,64cC 8,50dB 11,61eC T1 9,1aA 8,0bA 5,8cA 3,4dA 2,1eA T2 9,1aA 7,9bA 5,5cB 3,5 da 1,9eA T3 9,1aA 8,0bA 5,5cB 2,6dB 1,8eB T1 1,0359aA 1,0307bA 1,0186cA 1,0156dA 1,0089eA T2 1,0359aA 1,0305bA 1,0174cB 1,0171cB 1,0095dB T3 1,0359aA 1,0313bA 1,0241cC 1,0162dC 1,0124dC T1 1,500Aa 1,737bA 1,785cA 1,930dA 1,335eA T2 1,500Aa 1,689bB 1,737cB 1,979dB 1,830eB T3 1,500Aa 1,641bC 1,930cC 1,930cA 1,781eC T1 0,380Aa 1,448bA 1,528aA 1,544cA 1,280dA T2 0,380Aa 1,302bB 1,480aA 1,415bcB 1,4346dB T3 0,380 Aa 1,351AB 1,512aA 1,351bB 1,434eC T1 0,38aA 0,26bA 0,22cA 0,12dA 0,08eA T2 0,38aA 0,25bA 0,21cA 0,11dA 0,08eA T3 0,38aA 0,29bB 022cA 0,13dA 0,07eA T1 3,24aA 3,51bA 3,48bA 2,06cA 1,69dA T2 3,24aA 2,52bA 2,74cB 1,74dB 2,12eB T3 3,24aA 3,86bA 2,08cC 2,02dC 2,08eC T1 5,53aA 4,63bA 4,34cA 4,38cA 4,32cA T2 5,56aA 4,72bB 4,46cB 4,44cB 4,34dA T3 5,56aA 4,65bA 4,38cA 4,37cA 4,28dA Letras minúsculas na mesma linha evidenciam diferença em nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey durante o período de fermentação e do chope maturado; letras maiúsculas na mesma coluna evidenciam diferença significativa entre os tratamentos; T1-10mL de levedura por litro de mosto; T2-12,5mL de levedura por litro de mosto; T3-15mL de levedura por litro de mosto; * tempo correspondente ao período de fermentação; **tempo correspondente ao chope com 15 dias de maturação. impacto no aroma e sabor da cerveja; portanto, uma concentração muito elevada destes compostos no produto final pode distorcer o seu aroma, conferindo um aroma forte de fruta ou uma característica forte de cerveja tipo ale. 4,10,15 Os ésteres são desejáveis no produto apenas em concentrações apropriadas (10-70mg.L -1 ); 10 assim, uma falha no processo de fermentação pode resultar em níveis inaceitáveis de ésteres no produto, os quais descaracterizam o aroma do produto, tornando-o desagradável. 3,10,17 O valor de Graus Plato (ºP) decresceu para todos os tratamentos durante o período de fermentação. A amostra contendo 15mL de levedura por litro de mosto (T3), a maior concentração de levedura, após 39 horas de fermentação apresentou um decréscimo de Graus Plato (ºP) superior aos demais tratamentos em função de ter maior concentração de células viáveis. O decréscimo do valor de acidez total na cerveja maturada e o aumento da concentração de ésteres evidenciam a reação dos ácidos orgânicos com álcoois superiores, originando ésteres como produto final. 3,11,17 O aumento da concentração de levedura no mosto acelerou consideravelmente o tempo de fermentação, pois a amostra contendo 15mL de levedura por litro de mosto (T3), em menos de 64 horas já havia alcançado os Graus Plato (ºP) mínimos necessários para encerrar a fermentação sem comprometer o corpo e sabor da cerveja. O aumento da concentração de ésteres no produto final apresentou-se como uma consequência deste processo. CONCLUSÃO O aumento na concentração de levedura de 10,0mL para 15,0mL de levedura por litro de mosto reduziu o tempo de fermentação da cerveja quando comparado com o período de fermentação de 64 horas do tratamento padrão. O aumento da concentração de levedura induziu a uma maior concentração de ésteres durante o período de maturação do chope. Pelo aumento da concentração da levedura ocorreu uma redução no tempo do processo sem 355

6 que tenha ocorrido alteração das características do produto quando comparado com o tratamento padrão. AGRADECIMENTOS À Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel da Universidade Federal de Pelotas pela oportunidade de realizar o curso de Pós-graduação. À Movesa Indústria e Comércio de Bebidas Ltda pela concessão das matérias-prima e pela oportunidade de realizar parte do projeto em suas instalações. CARVALHO, D. S.; ZAMBIAZI, R. C. Evaluation of the pilsen s beer fermentative process by using different concentrations of Saccharomyces cerevisiae. Alim. Nutr., Araraquara, v. 22, n. 3, p , jul./set ABSTRACT: The time reduction during the beer processing is an important aspect in the microbreweries. Different Saccharomyces cerevisiae yeast (S-189) concentration were tested with the objective of accelerating the fermentation process of the Pilsen s beer. The wort was obtained in industrial scale and the fermentation and maturation processes were accomplished at the laboratorial level. The beer was elaborated starting from a standard formulation with concentration of yeast: wort of 10mL.L -1 (T1). It was also used formulations with 12.5mL.L -1 (T2) and 15mL.L -1 (T3) concentrations. The infusion method was used to obtain the wort, following by the yeast inoculation and fermentation at 12ºC±1ºC. The fermentation process followed until the sample reached 3.5 P (Plato degree), when the beer was bottled and left to maturate for 4 days at 5ºC, following by other 11days at 0ºC. The physical and chemical analyses of the maturated beer were done. The increase of the yeast concentration in the wort considerably reduced the fermentation time, and also it increased the ester concentration in the final product. KEYWORDS: Beer; maturation; fermentation; Saccharomyces. REFERÊNCIAS 1. AMERICAN PUBLIC HEALTHY ASSOCIATION. Compendium of methods for the microbiological examination of foods: method viable yeast count. Washington, DC: Frances Pouch Downes Keith Ito, p. 2. ANALYTICA EUROPEAN BREWERY CONVENTION. Method 8.3 extract of wort. 5 th ed. Nürnberg: Hans Carl Getränke-Fachverlag, cap ARAÚJO, F. B. Perfil sensorial, cromatográfico e características físico - químicas de cervejas provenientes de dois segmentos de mercado f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, ARAUJO, F. B.; SILVA, P. H. A.; MINIM, V. P. R. Perfil sensorial e composição físico-química de cervejas provenientes de dois segmentos do mercado brasileiro. Ciênc. Tecnol. Alim., v. 23, n. 2, p , BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Decreto-lei n de 4 de setembro de Regulamenta a lei n de 14 julho de 1994, que dispõe sobre a padronização, a classificação, o registro, a inspeção, a produção e a fiscalização de bebidas. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, n.171, 5 set Seção 1, p BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Laboratório Nacional de Referência Vegetal (LANARV). Metodologia de análises de bebidas e vinagres. Brasília, DF, pag. irreg. 7. BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Portaria n. 76 de 26 de novembro de Dispõe sobre métodos analíticos de bebidas e vinagre. Diário Oficial [da] República Federativa do Brasil, Brasília, 28 nov Seção 1, pt DEFERNEZ, M. et al. Modeling beer fermentation variability. J. Food Eng., v. 83, p , FREITAS, G. L. et al. Avaliação da atividade antioxidante de diferentes cervejas aplicando os métodos ABTSe DPPH. Alim. Nutr., v. 17, n.3, p , jul/set HORNSEY, I. S. Elaboración de cerveza: microbiologia, bioquímia y tecnología. Zaragoza: Acribia, p HOUGH, J. S. Biotecnologia de la cerveza. Zaragoza: Acribia, p HOUGH, J. S. et al. Malting and brewing science. London: Chapman & Hall, p INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas: métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 1.ed. digital. São Paulo, p KOBAYASHI, M. et al. Simultaneous control of apparent extract and volatile compoundsconcentrations in low-malt beer fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 73, p , KOBAYASHI, M.; SHIMIZU, H.; SHIOYA, S. Beer volatile compounds and their application to low-malt beer fermentation. J. Biosci. Bioeng., v. 106, n. 4, p , REINOLD, M. R. A tecnologia de microcervejarias. Engarrafador Moderno, n.66, p ,

7 17. REINOLD, M. R. Manual prático de cervejaria. São Paulo: Aden, p SILVA A. E. et al. Elaboração de cerveja com diferentes teores alcoólicos através de processo artesanal. Alim. Nutr., v. 20, n.3, p , jul./set SIQUEIRA, P. B.; BOLINI, H. M. A.; MACEDO, G. A. O Processo de fabricação de cerveja e seus efeitos na presença de polifenóis. Alim. Nutr., v. 19, n. 4, p , out/dez VERSTREPEN, K. J. et al. Flavor-active esters: adding fruitiness to beer. J. Biosci. Bioeng., v. 96, n. 2, p , ZUPPARDO, B. Uso da goma oenogum para a estabilização coloidal e de espuma em cerveja f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) Universidade de São Paulo, Piracicaba, Recebido em: 20/08/2010 Aprovado em: 05/05/