CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS FMU CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA

Transcrição

1 CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS FMU CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA ESTUDO DA COLETA E PROCESSAMENTO DE SÊMEN BOVINO LAILA VICENTE TEIXEIRA São Paulo 2009

2 LAILA VICENTE TEIXEIRA ESTUDO DA COLETA E PROCESSAMENTO DE SÊMEN BOVINO Monografia apresentada como trabalho de conclusão de curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário das Faculdades Metropolitanas Unidas - FMU, sob orientação da Profa. Dra. Carolina Amália de Souza Dantas Muniz. São Paulo 2009

3 Laila Vicente Teixeira Estudo da Coleta e processamento de sêmen bovino Trabalho apresentado para conclusão do curso de Medicina Veterinária da FMU, sob orientação do Profa. Dra. Carolina Amália de Souza Dantas Muniz. Defendido e aprovado em 17 de Dezembro de 2009, pela banca examinadora, constituída pelos professores: Profa. Dra. Carolina Amália de Souza Dantas Muniz FMU- Orientadora Profa. Dra. Maria Carolina Guido Banca Examinadora Profa. Dra. Andréa Roberto Bueno Ribeiro FMU- Banca Examinadora

4 AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus, por estar comigo em todos os lugares onde vou, me ajudando e me mostrando o caminho que devo seguir, e também pelo dom da vida. Agradeço aos meus Pais, Edson Falchi Teixeira e Maria Lúcia Vicente Teixeira, a vocês, que estiveram ao meu lado nas horas que chorei e nas horas que sorri nas horas que me lamentei e nas horas e que de uma forma ou de outras demonstrei total alegria. Agradecer pelo sorriso diário, sem mágoas nem rancores, agradecer de peito aberto, de alma explosiva. Hoje quero parar de agradecer, porque vocês fazem, farão sempre parte da minha história. Agradeço a minha orientadora nesse trabalho, a Profa. Dra. Carolina Amália de Souza Dantas Muniz, pela atenção e dedicação dispensada em todos os momentos. Agradeço também D. Nadir de Achiles, Antônio de Achilles Filho e Dr. Marcos Antônio de Achilles, pois são pessoas importantes para eu, pois me acolheram em sua casa e lá fui recebida com todo carinho e atenção, melhor dizendo como filha durante o meu estágio obrigatório, eles me apoiaram nessa etapa da minha vida e da qual pude criar uma grande amizade e que posso falar com toda certeza que irá me acompanhar sempre. Amo vocês Agradeço também o Eduardo Parisi que foi muito importante nesta jornada acadêmica, onde sempre me ajudou nos momentos de desespero. Jamais esqueceria de agradecer as pessoas que me acompanharam ao longo desses anos e das quais hoje posso falar que são minhas amigas e as considero muito e espero que me acompanhem para sempre em minha vida. Faço um especial agradecimento a Dra. Andréa Roberto Bueno Ribeiro e a Dra. Maria Carolina Guido, por aceitar o convite honrando- nos com sua presença, também pelas suas importantes contribuições para os encaminhamentos finais do trabalho aqui proposto. E finalmente agradeço a todos os animais que por alguns momentos, contribuíram para que meus ensinamentos tenham sido colocados em prática.

5 Dedico este trabalho aos meus pais, por seu apoio contínuo e incondicional durante toda minha vida, aos meus amigos, que estiveram sempre ao meu lado em momentos bons e ruins, aos meus professores, que participaram ativamente da minha formação intelectual, moral e profissional durante estes anos de graduação.

6 "É menor pecado elogiar um mau livro sem o ler, do que depois de o ter lido. Por isso, agradeço imediatamente depois de receber o volume. Não há vida literária plenamente virtuosa. (Carlos Drummond de Andrade)

7 RESUMO Este trabalho tem como objetivo verificar a importância da tecnologia empregada no processamento e congelamento de sêmen bovino, onde a idéia é mostrar a aplicabilidade de cada técnica, com a utilização da coleta e seu processamento que, proporciona a disseminação de genes de animais superiores, assim a possibilidade da aplicação da inseminação artificial, permitindo maximizar genéticas superiores para obtenção de produtos de elevado ganho de peso e boa qualidade de carcaça. Iniciando pelo processo de coleta de sêmen, tendo como vagina artificial um dos métodos mais utilizados nas centrais, pois evita alterações comportamentais e é o que mais se aproxima de uma monta natural, o eletroejaculador já é mais utilizado quando há presença de algum problema de articulação dificultando a monta do touro tendo como desvantagem ser um método estressor para o animal, o método da massagem das ampolas do ducto deferente apesar de ser o método mais simples para coleta do sêmen não é muito utilizada pelo fato de se obter baixa qualidade, baixa concentração espermática e alto índice de contaminação, apenas utilizada para uma avaliação espermática. A análise do sêmen é a parte mais importante na avaliação da fertilidade do macho, verificando o volume, coloração, odor, movimento de massa, ph, densidade, concentração, motilidade, turbilhonamento, vigor e onde se observa se há presença de patologias espermáticas. Os diluidores potencializam a capacidade de fecundação e preservam a capacidade fecundante do espermatozóide. A diluição tem como objetivo aumentar o ejaculado potencializando, permitindo que um grande número de fêmeas sejam inseminadas a partir de uma pequena quantidade. O envasamento sofreu muitas modificações nos últimos anos, desde pellets para ampolas, palhetas grossas e por último a palheta fina sendo a mais utilizada por apresentar maior facilidade no armazenamento e menor perda espermática. O congelamento é um processo lento, onde inicialmente ele passa por um resfriamento para -150 o C por quinze minutos e em seguida para o congelamento em -196 o C. Palavra- chave: anormalidades espermáticas, características morfológicas, diluentes.

8 ABSTRACT This study aims to verify the importance of technology used in processing and freezing of bull semen, where the idea is to show the applicability of each technique, using the collection and processing that provides the spread of genes from higher animals, as well the possibility of application of artificial insemination, allowing maximize superior genetic products to obtain high gain and good quality housing. Starting the process of semen collection, with the artificial vagina one of the most widely used in power because it prevents behavioral changes and is the closest to a natural mating, the electroejaculation is already widely used when there is presence of a problem of articulation making it difficult to mount the bull has the disadvantage of being a method stressor for the animal, the method of massage of the ampulla of the vas deferens despite being the simplest method for collecting semen is not used much because of getting low quality, low concentration sperm and high level of contamination was only used for an assessment of sperm. The semen analysis is the most important in the evaluation of male fertility by checking the volume, color, odor, mass movement, ph, density, concentration, motility, turbulence, and where force can be observed if there is presence of sperm pathologies. Extenders potentiate the ability of fertilization and preserve the fertilizing ability of sperm. Dilution aims to increase the ejaculate empowering, allowing a large number of females to be inseminated from a small amount. The potting underwent many changes in recent years, since pellets for light bulbs, thick reeds and finally a thin pick is the most widely used due to its greater ease of storage and decrease sperm. Freezing is a slow process, which once it passes through a cooling-150th C for fifteen minutes and then to the freeze-196th C. Keyword: sperm abnormalities, morphological, thinners.

9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Aparelho genital masculino Coleta do sêmen nos bovinos Vagina artificial Eletroejaculação Método da massagem das ampolas dos ductos deferentes Análise do sêmen Análise macroscópica Volume Coloração Odor Movimento de massa ph Densidade Análise microscópica Concentração Motilidade Turbilhonamento Vigor Análise das patologias espermáticas Diluidores Tipos de diluidores Citrato gema do ovo Meios à base de leite Tris- gema de ovo Diluição Substâncias crioprotetoras Envasamento Congelamento CONCLUSÕES...34 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....35

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1- Trato reprodutor masculino bovino...13 Figura 2-Vagina artificial...15 Figura 3- Pré-aquecimento da vagina artificial...15 Figura 4- Insuflando ar na válvula da vagina artificial...16 Figura 5 - Aplicação da vagina artificial...17 Figura 6- Monta Falsa (frustrada)...17 Figura 7- Eletroejaculador para bovinos...18 Figura 8- Brete de contenção...18 Figura 9-Espectrofotômetro...22 Figura 10- Representação do espermatozóide...25 Figura 11- Equipamento automático de identificação de palhetas...30 Figura 12- Equipamento automático de envase...32 Figura 13- Envase manual do sêmen...32 Figura 14- Câmara de resfriamento do sêmen...33

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Classificação do ejaculado, de acordo com a sua motilidade...23 Tabela 2- Classificação da propulsão e velocidade dos espermatozóides...24 Tabela 3- Composição do diluidor gema citrato...26 Tabela 4- Composição do diluidor meios à base de leite...27 Tabela 5- Composição do diluidor TRIS- gema de ovo...28

12

13

14

15 12 1 INTRODUÇÃO O Brasil possui o maior rebanho comercial do mundo com 19% da população bovina, com grande expressão no cenário mundial da pecuária bovina e mercado de carne, ficando somente atrás da Índia, com rebanho total de mais de 336 milhões de cabeças (BEEF POINT, 2009). A inseminação artificial em bovinos é a biotecnologia reprodutiva de custo mais acessível e que serve como uma ferramenta para o melhoramento genético dos rebanhos. A inseminação artificial é a deposição mecânica do sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea ocorre à deposição do sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea; a fecundação, ou seja, a união do espermatozóide com o óvulo e a formação de um novo ser ocorrem naturalmente (ASBIA, 2009). Para a sua ampla aplicação é indispensável o uso do sêmen congelado. A tecnologia empregada no processamento e congelamento de sêmen bovino encontra-se atualmente muito bem desenvolvida, representando o fator que promoveu de maneira mais intensa o processo de melhoramento genético do gado de corte e leite em todo mundo (MEDEIROS et al., 2002). O processo tecnológico de criopreservação do sêmen de animais de alta qualidade permite a maximização de seu material genético, pelo aumento do número de fêmeas que podem ser inseminadas com um único ejaculado permitindo o armazenamento deste material por tempo indeterminado (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). O principal objetivo da preservação do sêmen é obter gestações por inseminação artificial tão eficazmente quanto por monta natural, sendo que depende de vários fatores além da qualidade do sêmen. O sêmen de animais domésticos foi criopreservado com sucesso há mais de 30 anos, onde se utilizava dióxido de carbono sólido (gelo seco a -70 o C), que foi substituída pelo nitrogênio líquido (-196 o C) com a vantagem de apresentar um condição mais estável do sêmen criopreservado (HAFEZ; HAFEZ, 2004). No entanto a criopreservação do sêmen tomou um impulso muito grande no final da década de 40, após a descoberta da função crioprotetora do glicerol pelo cientista Polge, que permitiu o congelamento, com sucesso do sêmen bovino. Entretanto, mesmo as melhores técnicas atuais de preservação, alcançam em média, cerca de 50% de viabilidade da população espermática (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).

16 13 Este trabalho teve como objetivo abordar, por meio da revisão de literatura, os vários fatores relacionados à coleta, armazenamento e congelamento do sêmen bovino. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 APARELHO GENITAL MASCULINO O sistema reprodutivo masculino é constituído de diversos órgãos peculiares que atuam em conjunto para produzir espermatozóides e liberá- los no sistema reprodutor da fêmea (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Na Figura1 está representado o trato reprodutor masculino. r- reto; a- ampola; gv- glândula vesicular; p- próstata; bu- glândula bulbouretral; cp- crus esquerda do pênis; rp- músculo retrator do pênis; fs- flexura sigmóide; dd- Ducto deferente; cab. e- Cabeça do epidídimo; t- Testículo; e- Escroto; caud. e- Cauda do epidídimo; pl- Pênis. Figura 1- Trato reprodutor masculino bovino. Fonte- Hafez e Hafez (2004)

17 Coleta do sêmen nos bovinos Para a coleta de sêmen são adotados métodos diferentes para cada objetivo, mas todos os métodos devem considerar o bem estar dos animais, um bom manejo e pessoas bem preparadas, pois é a partir de uma coleta de sêmen adequada que se dá início a um bom programa de melhoramento genético, garantindo espermatozóides viáveis para a disseminação do material genético superior (BERBER, 2009). Para iniciar a coleta de sêmen alguns cuidados devem ser tomados relativos ao touro doador, para que se obtenham bons ejaculados que permitam seu congelamento. Deve-se dar um banho completo no touro antes da coleta; fazer a tricotomia prepucial; lavagem da região abdominal; lavagem do prepúcio e pênis com solução anti-séptica através de sonda, seguido por enxágüe com solução salina morna para retirada dos resíduos do anti-séptico. Todas essas medidas são vitais para assegurar a qualidade do material coletado. Além dos cuidados com o touro doador, deve-se atentar para os cuidados com instalações onde se realiza a coleta e também com a limpeza do material utilizado na coleta (BERBER, 2009). Para realizar a coleta de sêmen podem ser utilizados diferentes métodos, entre eles, a eletroejaculação, a vagina artificial e a massagem transretal das ampolas dos ductos deferentes (VASCONCELLOS, 1983; HAFEZ; HAFEZ, 2004). Em função das vantagens e desvantagens das diversas metodologias, os dois primeiros são os mais aplicáveis, respectivamente, à realidade diária do manejo em campo e nas centrais de inseminação (MARQUES FILHO et al., 2009) Vagina artificial A vagina artificial é o método mais usado em central de inseminação artificial (MIES FILHO, 1987; CARDOSO et al., 2004), consistindo essencialmente em se fazer com que o animal realize a cópula em um aparelho adaptado para este fim, simulando as condições da vagina natural, e assemelhando-se à monta natural permitindo que o animal ejacule naturalmente (HAFEZ; HAFEZ, 2004). É o método mais indicado para evitar alterações comportamentais (BARTH, 1997).

18 15 O sêmen é colhido em condições próximas da ideal para posterior análise com finalidade de exame espermático e emprego para processamento. Esta técnica pode ser realizada com a utilização de manequins ou fêmea (FEITOSA, 2004). A vagina artificial (Figura 2), consiste em um tubo de borracha, com o diâmetro de mais ou menos 10 cm e comprimento de 40 cm, possuindo um pequeno orifício lateral que possui uma válvula de metal para vedá-la. Este tubo é revestido por uma borracha de látex do mesmo diâmetro para formar pregas sendo mais comprido 20 cm, para serem viradas as pontas vedando as extremidades do tubo externo, em uma das extremidades, na parte interna, passa-se vaselina ou glicerina líquida, usando-se um bastão maciço de vidro e na outra extremidade é colocado um cone de plástico ou borracha contendo um tubo de ensaio onde será envolto em pano escuro, para proteção dos espermatozóides, da temperatura e da luz. Esta operação é precedida pela colocação de água quente à temperatura de 40 C a 43 C (Figura 3), pelo orifício externo do tubo, devendo a água ficar entre os tubos (VASCONCELLOS, 1983). Após colocar a água pode-se, também, insuflar ar pela válvula existente na parte externa (Figura 4), fazendo com que a parede interna da vagina artificial comprima ainda mais a base do pênis, estimulando os músculos deste (FEITOSA, 2004). Figura 2- Vagina artificial. Figura 3- Pré-aquecimento da vagina artificial Fonte: MUCCIOLO (2003) Fonte: MUCCIOLO (2003)

19 16 Figura 4- Insuflando ar na válvula da vagina artificial. Fonte: MUCCIOLO (2003) A temperatura da vagina artificial deve ser mantida em temperatura adequada, pois se estiver abaixo de 40 o C pode prejudicar a ejaculação do touro e também não pode estar acima de 43 o C, pois pode afetar o pênis e provocar estresse ao animal (SILVA et al., 1993). Para fazer a coleta o operador deve posicionar-se ao lado direito do macho. Quando o animal saltar sobre o manequim, o pênis deve ser desviado lateralmente, deixando com que o animal faça a introdução do membro (pênis) na vagina artificial. A vagina artificial deve ser mantida em um ângulo de aproximadamente 45 o, facilitando assim a introdução do pênis (Figura 5). Logo após o animal ejacular, a vagina deve ser posicionada na vertical para se evitar a perda de sêmen (FEITOSA, 2004). Em touros é aconselhável executar duas ou três montas falsas (frustradas), onde o animal salta sobre o manequim ou fêmea (Figura 6) e tem seu pênis desviado lateralmente, mas não faz a introdução da vagina artificial, esta conduta excita o animal e faz com que a amostra seminal fique mais concentrada, pois o touro eliminará considerável volume de líquido seminal. O intervalo entre uma coleta e outra varia de 20 a 30 minutos (FEITOSA, 2004).

20 17 Figura 5- Aplicação da vagina artificial. Fonte: MUCCIOLO (2003) Figura 6- Monta falsa (frustrada). Fonte: arquivo pessoal (2009) Eletroejaculação A técnica da eletroejaculação pode ser usada em touros que apresentem lesões articulares, idade avançada ou que recusam a vagina artificial (VALE FILHO, 2001). O eletroejaculador (figura 7), foi descrito pela em 1945 este método além de dispensar a fêmea ou o manequim, conserva o sêmen em estado de pureza, sendo o método eletivo para a realização de exames andrológicos (MIES FILHO, 1987). Segundo Marques Filho et. al., (2008), para a realização da coleta o touro deve ser colocado em um brete de contenção adequado (Figura 8), para evitar lesões ao animal e ao operador. A coleta de sêmen com finalidade de exame andrológico não necessita de rigorosa

21 18 higienização, o mesmo não ocorrendo quando se deseja colher a amostra para processamento, ou seja, utilização de sêmen fresco diluído ou não, sêmen refrigerado ou congelado. Da mesma maneira, como descrito anteriormente por Berber (2009), para a coleta de sêmen a higiene do animal deve ser realizada. A coleta é feita com o auxílio de um aparelho que consiste em um eletrodo com mais ou menos 6 cm de diâmetro e 35 a 40 cm de comprimento, possuindo uma extremidade polida, onde se passa vaselina, para introduzir no reto do touro; na outra extremidade possui um fio que está ligado ao eletroestimulador e um botão regulador de intensidade de corrente. Logo após a contensão do touro coloca-se o eletrodo no ânus do animal, e em seguida, liga-se a corrente, que produz estímulos a cada 3 segundos que atuam nas glândulas seminais (VASCONCELLOS, 1983). Figura 7- Eletroejaculador para bovinos. Fonte: RURAL BAN (2009). Figura 8- Brete de contenção. Fonte: MUCCIOLO(2003). Este método baseia-se na estimulação elétrica (bifásica, entre 16 e 25 volts) dos centros eretores e ejaculador, promovendo a contração dos músculos uretrais e provocando a liberação do sêmen e do plasma seminal (GROVE, 1975; DERIVAUX, 1980; SILVA; DODE, 1993).

22 Método da massagem das ampolas dos ductos deferentes A massagem das ampolas dos ductos deferentes é um dos métodos mais simples de coleta de sêmen em bovinos, mas a obtenção de sêmen por este método requer prática e muitos animais não respondem aos estímulos. Este método de coleta tem baixa qualidade, baixa concentração espermática e alta contaminação, servindo apenas para avaliação rápida, quando não se tem outra opção e se quer ter uma idéia da qualidade espermática do reprodutor, não devendo ser aproveitado para o processo de congelamento quando o uso é destinado para programas de inseminação artificial (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). 2.3 Análises do sêmen A análise do sêmen é a parte mais importante na avaliação da fertilidade do macho, e compreende a avaliação macroscópica e microscópica e análise das patologias espermáticas (CARDOSO et al., 2004) Análise Macroscópica O exame macroscópico inclue a valoração do ejaculado com relação ao seu volume, coloração, odor, movimento de massa, densidade e ph (CARDOSO et al., 2004) volume O volume não é avaliado pela quantidade de sêmen, mas pela sua qualidade espermática. Esta característica indica o número de doses seminais que devem ser preparadas (RODRIGUEZ, 2002). O volume é representado em mililitros (ml) e lido na graduação do copo coletor ou constatado com uma pipeta graduada. O parâmetro mínimo para touros com idade superior a dois anos é de 4 ml, enquanto para touros jovens é de 2 ml. O volume de sêmen obtido na

23 20 espécie bovina vária de 0,5 20 ml, sendo que a média do ejaculado bovino é 5 ml (FEITOSA, 2004) coloração Naturalmente, o sêmen do touro é de coloração branca ou branco- pérola, podendo variar a coloração quando ocorrer presença de alterações no ejaculado. Quando o ejaculado apresentar a coloração avermelhada é devido à presença de sangue, neste caso o touro apresenta algum ferimento na uretra, glande ou nas glândulas anexas. Se o ejaculado apresentar coloração amarela, podendo ser mais forte, quando o ejaculado estiver menos concentrado, devido à presença da riboflavina e também pode ser pela presença de urina. A coloração esverdeada no ejaculado é devido à presença de secreção purulenta, neste caso o animal apresenta alguma infecção. Se o ejaculado apresentar um coloração amarronzada é devido a lesões antigas onde já possui degradação celular (CARDOSO et al., 2004) odor O odor na maioria das vezes é imperceptível (sui generis) que provém do fosfato de espermina. Quando apresentar um odor urinoso ou cítrico ocorreu à presença de urina no ejaculado e odor pútrido quando houver presença de bactérias (CARDOSO et al., 2004) movimento de massa O movimento de massa consiste em uma análise macroscópica, onde pode-se visualizar a movimentação do ejaculado. Em touros este movimento é difícil observação, sendo mais fácil sua visualização em ovinos pois a concentração de espermatozóide é maior quando comparada com o bovino, e pode ser classificado em movimento ativo, médio ou lento (MARQUES FILHO, 2008).

24 ph O ph do sêmen no touro pode variar de (6,5 a 6,9) tornando-se mais ou menos alcalino com a quantidade da secreção das glândulas acessórias; o segundo ejaculado numa seqüência de coletas é mais ácido (ph mais baixo) e associado a uma melhor concentração e motilidade (CARDOSO et al., 2004) Densidade A densidade do sêmen é dependente da quantidade de células espermáticas, podendo variar de um animal para outro e entre os ejaculados sucessivos do mesmo animal. A densidade é uma característica macroscópica, quando se coloca na câmara para realizar a contagem de espermatozóide é considerada concentração que é uma característica microscópica (CARDOSO et al., 2004). A densidade é classificada em muito densa; densa; pouco densa; aquosa (MC GUIDO, 2009) Análise Microscópica O exame microscópico inclue a valoração do ejaculado com relação ao sua concentração, motilidade, turbilhonamento e vigor (CARDOSO et al., 2004) Concentração A concentração refere-se ao número de espermatozóides por centímetro cúbico e oscila entre 700 e milhões (CARDOSO et al., 2004). Nos zebuínos a concentração normal é de 200 mil a 1,2 milhões de espermatozóide /ml através do eletroejaculador e 800 mil a 1,2 milhões de espermatozóide/ml na vagina artificial (CARDOSO et al., 2004).

25 22 É utilizado dois tipos de aparelhos para se obter a concentração câmara de Newbawer e o espectrofotômetro (SILVA et al., 1993). Na Figura 9, pode se verificar o aparelho de espectrofotômetro responsável pela avaliação da concentração espermática. Figura 9- Espectrofotômetro. Fonte: Arquivo pessoal (2009) Motilidade A motilidade é porcentagem de espermatozóides vivos e móveis, deve ser avaliada imediatamente após a coleta de sêmen (FEITOSA, 2004). A porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva é melhor apreciada em sêmen diluído, pois, a alta concentração pode prejudicar a avaliação. Nesses casos, a diluição pode ser realizada, imediatamente, colocando-se em um tubo de ensaio um ml de diluidor ou solução fisiológica aquecida a 37 o C, adiciona 2 gotas de sêmen no tubo, homogenizar e colocar na lâmina aquecida com lamínula deve ser visualizada em aumento de 200 vezes. Assim se observa a porcentagem de espermatozóides que apresentam movimento (SILVA et al., 1993). A motilidade do espermatozóide é dada em graus que correspondem a porcentagem de espermatozóides em movimento, indicando a intensidade de deslocamento da célula no campo do microscópio, que pode ser verificado na Tabela 1.

26 23 Tabela 1- Classificação do ejaculado, de acordo com a sua motilidade. Grau Porcentagem de espermatozóides em movimento % % % % % Fonte: Adaptado BERBER (2009) Como este tipo de análise é considerado impreciso, mesmo quando executado por técnicos experientes. Uma vez que depende, da variabilidade entre técnicos e das diferenças na implementação de padrões para a avaliação (PERES et AL., 2008). Para diminuir esta imprecisão, estão sendo utilizados para avaliação espermática, sistema de avaliação computadorizada CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) sendo um sistema automático utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas, fornecendo informações precisas e significativas do movimento e morfologia espermática. O sistema é adequado para quantificar um grande número de células com padrão de motilidade heterogêneo em um curto período de tempo (TONIOLLI; ARAUJO; MATOS, 2008), fornecendo dados de concentração de espermatozóides/ml, morfologia, motilidade e velocidade Turbilhonamento O turbilhonamento é o movimento dos espermatozóides, percebido através de ondas quando da observação de uma pequena gota de sêmen no microscópio, ou quando se observa o ejaculado contra a luz. É semelhante ao movimento de massa, porém é observado ao microscópio. Pega-se uma lâmina aquecida a 37 o C, pinga-se uma gota do ejaculado, observase em aumento de 100 vezes, então se observa a borda da gota e verifica de há movimentação do sêmen. O movimento de onda é classificado em escala de 0 a 5 (SILVA et al., 1993).

27 Vigor Deve ser avaliado na mesma lâmina da motilidade. Onde se observa a propulsão e a velocidade dos espermatozóides (Tabela 2) na lâmina. Ele deve ser observado em aumento de 200 vezes e classificado em graus de 0-5 (SILVA et al., 1993). Tabela 2- Classificação da propulsão e velocidade dos espermatozóides. Grau Propulsão e velocidade dos espermatozóides 0 Estático- morto 1 Moribundos- péssimos 2 Lento ruim 3,4 e 5 Bons Fonte: Adaptado BERBER (2009) Análise das patologias espermáticas A patologia espermática verifica alteração na cabeça, peça intermediária e cauda do espermatozóide (Figura 10) (CHACUR et al.,2004). Se ocorrer alteração na cabeça a técnica mais utilizada a campo é método de Willians modificado, onde se avalia alterações da cabeça. O exame é realizado em esfregaço de sêmen fresco corado por diferentes técnicas de coloração, conforme a disponibilidade de corante. Essa técnica é especialmente importante na determinação de sua motilidade e na determinação da quantidade de espermatozóides vivos e mortos no ejaculado. O corante utilizado difunde-se na célula morta enquanto a viva permanece incolor. A lâmina é examinada sob imersão, onde são contadas, no mínimo, 200 células (SILVA et al., 1993). Outro tipo de corante é o Panótico Rápido, demonstrou ser eficiente para a coloração de esfregaços de sêmen, possibilitando a identificação de alterações morfológicas nos

28 25 espermatozóides, sendo uma técnica rápida e prática. Nele se utiliza três tipos de corantes, e à lâmina ficará por 10 segundos em cada tipo de corante (CHACUR et al., 2004). Se a alteração for à peça intermediária e cauda, usa-se o método de câmara úmida, onde irá avalia as alterações da peça intermediária e cauda. Em uma lâmina coloca-se uma gota de sêmen em formol/salina, coloca-se lamínula e realiza a vedação com esmalte, sendo contados 200 espermatozóides com um aumento de a vezes (SILVA et al., 1993) Figura 10- Representação do espermatozóide Fonte: Diluidores Os diluidores tem como função de fornecer nutrientes às células espermáticas (BERBER, 2009). Este devem ser isentos de toxidez para os espermatozóides, a pressão osmótica deverá ser igual à do sêmen, apresentar ph (6,5 a 6,9) favorável à sobrevivência dos espermatozóides, ser de baixo custo e de fácil preparo e não produzir metabólitos nocivos aos espermatozóides (MIES FILHO, 1987). Os diluidores devem ser preparados assepticamente e estocados por menos de uma semana, a menos que sejam congelados (HAFEZ; HAFEZ, 2004).

29 Tipos de diluidores Gema Citrato. No preparo desse diluidor utiliza-se basicamente citrato de sódio, glicerol e gema de ovo. A gema deve ser oriunda preferencialmente de ovos livres de patógenos específicos; no entanto, devido ao custo e baixa disponibilidade no mercado, utilizam-se ovos de galinha postos no dia. Para a extração da gema, os ovos devem ser lavados com água e detergente, enxaguados com água destilada e secos com álcool 70% medidas que previnem a contaminação bacteriana no meio diluidor (BERBER, 2009). Para o preparo de duas frações de 500ml cada, de diluidor Gema citrato, pode-se utilizar o protocolo abaixo: Tabela 3- Composição do diluidor Gema Citrato. Componente Fração A Fração B % Final da mistura (sem glicerol) (com glicerol) Citrato de sódio 2,5% 400 ml 330 ml 73 Gema de Ovo 100 ml 100 ml 20 Glicerol _ 70 ml 7 Total 500 ml 500 ml 100% Fonte: adaptado Berber (2009) Nesse protocolo o glicerol só será utilizado na fração B, o que garante menor tempo de exposição dos espermatozóides ao efeito tóxico desse crioprotetor. A solução final do meio diluidor citrato gema apresenta ph = 6,8 a 6,9 e osmolaridade = 285 a 300 mosm, e portanto, é isotônico e isosmol em relação ao líquido seminal (quando feita a diluição não ocorrem mudanças físicas e químicas importantes que possam alterar bruscamente as condições do meio que contêm os espermatozóides).

30 Meios à base de leite Meios à base de leite são particularmente populares nos EUA devido principalmente a sua facilidade de preparo e baixo custo. A principal desvantagem desse tipo de diluidor é a opacificação do meio, que dificulta a observação microscópica individual dos espermatozóides os glóbulos de gordura presente no leite deixam o meio opticamente opaco (BERBER, 2009). Para o prepara desse diluidor deve-se utilizar leite resfriado, pasteurizado e homogeinizado, com até 3,5% de gordura (quantidade média contida nos leites desnatados de caixinha); o leite deve ser aquecido por 10 minutos a temperatura de C (temperatura que garante desnaturação das proteínas do leite, que podem ser nocivas aos espermatozóides) e deixado esfriar a temperatura ambiente. A seguir, procede-se a remoção da nata sobrenadante por meio de filtração (BERBER, 2009). Para o preparo de meio diluidor leite, em duas frações de 500 ml cada, pode-se adotar o seguinte protocolo: Tabela 4- Composição do diluidor meios à base de leite. Componente Fração A (sem gordura) Fração B (com gordura) % Final da Mistura Leite 500 ml 430 ml 93 Glicerol _ 70 ml 7 Total 500 ml 500 ml 100% Fonte: adaptado BERBER (2009) O ph (6,5 a 6,6) e a osmolaridade desse diluidor (260 a 290 moms) encontram-se em equilíbrio com os valores encontrados no plasma seminal (BERBER,2009).

31 TRIS Gema de Ovo É o meio mais utilizado comercialmente devido aos ótimos resultados obtidos quanto a congelabilidade do sêmen e posterior motilidade ao descongelamento, frente aos outros meios diluidores (BERBER,2009). A solução TRIS é composta por Tris, ácido cítrico e água destilada e para o preparo desse diluidor em duas frações, pode-se seguir o seguinte protocolo: Tabela 5- Composição do diluidor Tris- gema de ovo. Componente Fração A Fração B % Final da Mistura (sem glicerol) (com glicerol) TRIS (0,2 M) 400 ml 330 ml 73 Gema de ovo 100 ml 100 ml 20 Glicerol _ 70 ml 7 Total 500 ml 500 ml 100% Fonte: adaptado BERBER (2009) A quantidade de gema de ovo utilizada no preparo desse diluidor pode chegar até 28% do total da mistura, apresentando bons resultados. Além disso, o meio pode ser acrescido por frutose ou glicose em qualquer uma das frações, garantindo um maior aporte de energia aos espermatozóides. Assim como outros meios diluidores citados anteriormente, o TRIS gema de ovo é isotônico e isosmol em relação ao plasma seminal (BERBER, 2009).

32 Diluição A diluição tem por objetivo aumentar o volume do ejaculado, permitindo que um grande número de fêmeas seja inseminado a partir de uma pequena quantidade, tornando o processo mais lucrativo (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Antes de se realizar a diluição deve-se observar se o ejaculado e o diluidor estão na mesma temperatura, utiliza um banho-maria com temperatura a 37 o C, onde o sêmen e o diluidor são colocados para que alcancem a mesma temperatura (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Para a determinação da taxa de diluição, é necessário que se tenham alguns dados fundamentais, como: concentração espermática relativa, volume do ejaculado, tipo de envasamento e concentração espermática por dose sendo normalmente 40 milhões/sptz/dose. Onde o primeiro passo é determinar a concentração total (CT) do ejaculado, o que se faz a partir da concentração relativa (CR), a qual deve ser multiplicada pelo volume do ejaculado (CT= CR x volume do ejaculado). Em seguida, determina-se o número total de espermatozóides com motilidade progressiva, a qual se obtém a partir da motilidade do sêmen (CT x motilidade espermática/100), a partir do número de espermatozóides com motilidade progressiva, determina-se o número de doses que se pode obter do sêmen, o que se consegue dividindo-se a concentração total do ejaculado pelo número de espermatozóide por dose (número de espermatozóide com motilidade progressiva / número de espermatozóide por dose. Onde será possível ter o volume de diluidor a ser acrescentado ao ejaculado é determinado pela multiplicação do número de doses pelo volume do envasamento, subtraído do volume do ejaculado (n o doses x volume do envasamento) volume do ejaculado (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Após determinar o número de doses e o volume de diluidor a ser acrescentado ao ejaculado, procede-se à diluição, que deve ser seguida de movimentação circular e lenta do frasco contendo o sêmen para que ocorra a homogeneização adequada, evitando a formação de bolhas de ar (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Na criopreservação a diluição do sêmen é essencial para o sucesso da técnica, pois os componentes dos meios diluidores fornecem condições para a sobrevivência do

33 30 espermatozóide, auxiliando na preservação da integridade da membrana plasmática, que pode sofrer alterações devido a mudanças de temperatura (BUENO, 2001). 2.6 Substâncias crioprotetoras As substâncias crioprotetoras são divididas em permeáveis ou impermeáveis de acordo com o peso molecular e a conseqüente propriedade de atravessar ou não a membrana celular (RODRIGUES, 1992). Os crioprotetores permeáveis mais utilizados são o glicerol, etilenoglicol e dimetilsulfóxido (DMSO), essenciais para minimizar ou prevenir a formação de cristais de gelo intracelular. Os crioprotetores impermeáveis, como a sacarose, lipoproteínas da gema do ovo e proteínas do leite, por outro lado, auxiliam na estabilização da membrana plasmática (RODRIGUES, 1992). Os crioprotetores serão adicionados ápos ocorrer o resfriamento. 2.7 Envasamento As palhetas precisam, antes do envase, ser identificadas manualmente utilizando canetas com tinta que não saem na água, ao contrário das grandes centrais onde as palhetas são identificadas por maquinário especifico (Figura 11) onde a máquina carimba as palhetas automaticamente (BERBER, 2009). Figura 11- Equipamento automático de identificação de palhetas Fonte: Arquivo pessoal (2009)

34 31 Após a diluição, faz-se o envasamento do sêmen, dividindo-o em doses para que sejam armazenadas no botijão de nitrogênio líquido. O modo de envasamento do sêmen sofreu modificações e aperfeiçoamentos. Em bovinos, no início do emprego da técnica da IA com sêmen congelado, as doses eram congeladas na forma de pellets, moldados em pequenos buracos feitos no bloco de gelo seco (-79 o C). No entanto por questões sanitárias, dificuldades no manuseio, no armazenamento, descongelação, entre outras, essa técnica foi substituída pelo método de ampola de vidro, com capacidade para cerca de 1mL. Esse método, também por apresentar dificuldades de manuseio, armazenamento e descongelação em água com gelo, foi substituído pela palheta francesa (média) com capacidade para 0,5 ml, sem os problemas dos métodos de envasamento anteriores. A vantagem do congelamento em palhetas é que há uma perda menor de espermatozóides durante o processo de congelamento e descongelamento cerca de 15 a 20%, em razão do processo de congelamento ser mais uniforme por toda a superfície da palheta, ao passo que com a ampola a perda espermática era de cerca de 50%. Atualmente, o melhor método de envasamento é o que utiliza a palheta francesa fina de 0,25mL, cuja perda espermática durante o processo de congelamento e descongelamento do sêmen é de somente cerca de 10 a 15%. Além disso, a referida palheta apresenta maior facilidade de armazenamento do que a palheta média em virtude do menor diâmetro (GONCALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Para envase das palhetas existem vários métodos automáticos (Figura 12) que compreendem o envasador próprio para palheta, de origem francesa e por meio de bomba a vácuo. Também se utiliza o método manual como mostra (Figura 13) por meio de pipetas e seringas, envasando um palheta por vez, mais utilizado a campo, onde a quantidade de sêmen a ser envasado é pequena (BERBER, 2009).

35 32 Figura 12- Equipamento automático de envase. Figura13 - envase manual do sêmen. Fonte: Arquivo pessoal (2009) Fonte: Arquivo pessoal (2009) 2.8 Congelamento A mistura sêmen- diluidor é mantida durante várias horas antes do congelamento para permitir que as células espermáticas se equilibrem com o diluidor (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Após a mistura e envasamento as palhetas serão acondicionadas dentro de uma câmara de resfriamento regulada para 5 o C (Figura 14) para que a sua temperatura baixe gradualmente, permanecendo cerca de 3 a 4 horas (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008)..

36 33 Figura 14- Câmara de resfriamento do sêmen Fonte: Arquivo pessoal (2009). Decorrido o tempo de resfriamento, prossegue-se no processo de congelamento, colocando-se as palhetas no vapor de nitrogênio líquido, se utiliza uma plataforma, que esta localizada aproximadamente 4 a 5 cm do nível do nitrogênio líquido, com temperatura em torno de -150 o C. O sêmen deve ser mantido no referido vapor por 15 minutos e, depois disso, deve ser mergulhado no nitrogênio líquido, completando o processo de congelamento (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Posteriormente, o sêmen é transferido para o vapor do nitrogênio líquido à uma temperatura aproximada de 150 C negativos por 15 minutos e logo após mergulhado em nitrogênio líquido, onde a temperatura é de 196 C negativos, concluindo-se o processo de congelamento (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008). Após o congelamento as palhetas são raqueadas, o sêmen congelado em palhetas é acondicionado em hastes metálicas chamadas raques (capacidade de 10 palhetas por raque) que facilitam a organização nos botijões e posterior facilidade de manejo do sêmen. Após o raqueamento o sêmen é armazenado nos botijões de nitrogênio líquido (OHASHI, 2001).

37 34 3 CONCLUSÕES Pode-se concluir de acordo com o presente estudo que: É fundamental métodos adequados de coleta, armazenamento, congelamento do sêmen, para obter maior índice de produtividade. O método mais utilizado é a vagina artificial, quando comparada a eletroejaculação e massagem dos ductos deferentes ela é superior, tanto em quantidade como qualidade, pelo fato da vagina ser o que mais se aproxima com a monta natural. Com a análise do sêmen podemos verificar a fertilidade do macho e compreender a avaliação e a análise das patologias espermáticas, sendo uma das etapas mais importantes da coleta. A diluição permite aumentar o volume do ejaculado, permitindo assim que um maior número de fêmeas sejam inseminadas a partir de uma pequena quantidade do ejaculado, tornando o processo mais lucrativo e facilitado o melhoramento genético.

38 35 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBERTI, K. Congelação de sêmen Bovino: Novos enfoques em meios diluentes. (Monografia de Pós-Graduação): Botucatu, ASBIA - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL. Manual do inseminador. São Paulo: Imagem Rural, BALL, P. J. H. Reproduction in cattle. New York: Wiley-Blackwell, BERBER, R. C. A. Coleta e processamento de sêmen bovino BUENO, L. G. de F. Considerações sobre o exame andrológico em touros. Espírito Santo do Pinhal: Relatório, BUENO, R. et al. Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães: I - efeito do meio diluidor. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v. 53, n. 3, jun CARDOSO, J. A. et al. Evaluation Reproductiva Del Macho Bovino en Condiciones Tropicales. Bogotá: Corpoica, CORREA, J. R., PACE, M, M.; ZAVOS, P. M. Relationship among frozen-thawed sperm characteristics accessed via the routine semen analysis, sperm functional tests and fertility of bulls in an artificial insemination program. Theriogenology, v. 48, p , FEITOSA, F. Semiologia Veterinária a arte do diagnóstico. 7.ed. São Paulo, FLOWERS, W. L. Biotechnology: Artificial Insemination. In: POND, W. G.; BELL, A. W. Encyclopedia of animal science. New York: CRC Press, FURST, R.; CARVALHO, G.R.; FURST, M.C.O; RUAS, J.R.M; BORGES, A.M.; MAFILLI, V., Efeito do resfriamento do sêmen eqüino sobre sua congelabilidade, Arquivo Brasileiro de Medicina Vetetrinária e Zootecnia Vol. 57 n.5 Outubro, HAFEZ, B. Reproduction in farm animals. New York: Wiley-Blackwell, HAFEZ, E.S.E.; HAFEZ, B. Reprodução animal. 7.ed. São Paulo, p. HORN, M. M. et al. Qualidade do sêmen bovino congelado submetido a repetidas exposições ao ambiente. Arch. Latinoam. Prod. Anim. v. 5, p , 1997.

39 36 MARQUES FILHO, W. C. et al. Avaliação do estresse em touros Nelore (Bos tauriis indicus) submetidos à eletroejaculação. Vet. Zootec., v.15, n.3, p , MARQUES FILHO, W. C. et al. Indicadores de bem-estar em touros submetidos à colheita de sêmen por eletroejaculação. Vet. e Zootec., v.16, mar. 2009, p MCGUIDO. Colheita de sêmen. Disponível em: < Acesso em: 14 nov MELO, C. M. Ação dos crioprotetores na biotecnologia de sêmen congelado. Unesp: Botucatu, MUCCIOLO. Fotos de coleta. Disponível em: < Acesso em: 14 nov Rev.Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.32, n.4, p , out./dez Disponível em Acesso em 30 nov RODRIGUES, J. L. Aspectos da congelação de embriões bovinos. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES, Jaboticabal. Anais [S.l.: s.n.], p , RODRÍGUEZ, F. P. C. Bases de la producción animal. Sevilla: Universidad de Sevilla, SILVA, A. E. D. F. et al. Capacidade reprodutiva do touro de corte: funções, anormalidades e outros fatores que a influenciam. Campo Grande: Embrapa Gado de Corte, Documento 51, VASCONCELLOS, P. M. B. Guia prático para o fazendeiro. São Paulo: Nobel, YOSHIDA, M. Conservation of sperms: current status and new trends. Animal Reproduction Science, v.60-61, p , < Acesso em 30 nov <

40 37