PLATELIA TOXO IgG 1 placa DETECÇÃO QUANTITATIVA DE ANTICORPOS IgG PARA TOXOPLASMA GONDII EM SORO OU PLASMA HUMANO POR ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO

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1 PLATELIA TOXO IgG 1 placa DETECÇÃO QUANTITATIVA DE ANTICORPOS IgG PARA TOXOPLASMA GONDII EM SORO OU PLASMA HUMANO POR ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO /11 1. APLICAÇÃO O ensaio Platelia Toxo IgG é um ensaio imunoenzimático ELISA indirecto para a detecção quantitativa de anticorpos IgG para Toxoplasma gondii em soro ou plasma humano. 2. VALOR CLÍNICO T. gondii é um protozoário capaz de infectar inúmeras espécies de mamíferos e aves. Estas infecções são muito comuns no homem e nos animais, manifestando-se, na maior parte dos casos, de forma não aparente do ponto de vista clínico. A prevalência desta infecção na população, detectada através da presença de anticorpos específicos no soro, é variável em função da região atingida e da idade. No caso de uma primo-infecção da mãe durante a gravidez, esta infecção pode desencadear graves sequelas para o feto (em particular uma alteração das funções cerebrais) ou mesmo um aborto. Uma imunidade, mesmo que antiga, por parte da mãe, demonstrada pela presença de anticorpos IgG desde o início da gravidez, protege o feto da infecção por este parasita. A segunda população sensível a esta infecção é representada pelos doentes imunodeprimidos, ou seja, os doentes atingidos pela SIDA. Estas infecções são devidas, quase exclusivamente, a uma infecção a partir de um foco parasitário (quisto) quiescente do doente, pré-existente à infecção pelo vírus HIV. O diagnóstico de confirmação da infecção toxoplasmática é fornecido pela demonstração do parasita, mas a sua detecção por observação directa torna-se difícil, para não dizer até, aleatória. A serologia representa a base do diagnóstico e do acompanhamento da toxoplasmose. A evidenciação de anticorpos específicos permite afirmar uma contaminação por T. gondii; o estudo combinado dos anticorpos pertencentes a diferentes isotipos permite, geralmente, datar a infecção e orientar a terapêutica em caso de infecção recente ou propor medidas profilácticas adaptadas ao risco de instalação de uma toxoplasmose: medidas higienodietéticas nas mulheres grávidas não possuidoras de anticorpos, quimioprofilaxia nos indivíduos imunodeprimidos, seropositivos para T. gondii. 3. PRINCÍPIO O ensaio Platelia Toxo IgG é um teste quantitativo para a detecção de anticorpos IgG para a T. gondii em soro ou plasma humano utilizando um método imunoenzimático ELISA indirecto. Os antigénios inactivos da T. gondii são utilizados para revestir a microplaca. Um anticorpo monoclonal etiquetado com peroxidase, o qual é específico para cadeias gama humanas (anti-igg), é utilizado como conjugado. O teste utiliza as seguintes etapas: Etapa 1 As amostras dos pacientes e calibradores são diluídos 1/21 e depois distribuídos pelos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37 C, os anticorpos IgG para a T. gondii presentes na amostra unem-se ao antigénio T. gondii revestido nos poços da microplaca. Após a incubação, os anticorpos não específicos e outras proteínas séricas não ligadas são removidos por lavagem. Etapa 2 O conjugado (anticorpo monoclonal etiquetado com peroxidase específico para cadeias gama humanas) é adicionado aos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37 C, o anticorpo monoclonal etiquetado une-se ao soro IgG capturado pelo antigénio T. gondii. O conjugado não ligado é removido por lavagens no fim da incubação. 1

2 Etapa 3 A presença de imunocomplexos (antigénio T. gondii, anticorpos IgG para T. gondii, conjugado anti- IgG) é demonstrada pela adição em cada poço de uma solução de desenvolvimento enzimática. Etapa 4 Após a incubação a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C), a reacção enzimática é parada pela adição de uma solução 1N de ácido sulfúrico. A leitura da densidade óptica obtida com um espectrofotómetro a 450/620 nm é proporcional à quantidade de anticorpos IgG para a T. gondii presente na amostra. A densidade optico foi convertida em IU/ml usando a curva calibrada de encontro WHO Standart Internacional TOX-M. 4. INFORMAÇÃO DO PRODUTO As quantidades fornecidas de reagentes foram calculadas para permitir 96 testes. Todos os reagentes são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro. Etiquetagem Natureza dos reagentes Apresentação R1 R2 Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 6 R4b Calibrator 60 R4c Calibrator 240 R6 R7 R9 Conjugate (51x) Diluent Chromogen TMB Microplaca (pronta para utilização) 12 tiras com 8 poços quebráveis, revestidos com antigénio T. gondii inactivo Solução de lavagem concentrada (20x) Tampão TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Conservante: 0,04% ProClin 300 Calibrador 0 Soro humano negativo para anticorpos IgG para T. gondii e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,098% ProClin 300 Calibrador 6 UI/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para T. gondii e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,098% ProClin 300 Calibrador 60 UI/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para T. gondii e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,098% ProClin 300 Calibrador 240 UI/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para T. gondii e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,098% ProClin 300 Conjugado (51x) Anticorpo monoclonal murino para cadeias gama humanas conjugado com peroxidase de rábano Conservante: 0,159% ProClin 300 Diluente para amostras e conjugados (prontos para utilização) Tris-NaCl (ph 7,7), glicerol, 0,1% Tween 20 e fenol vermelho Conservante: 0,148% ProClin 300 Cromogénio (pronto para utilização) 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 1 x 100 ml 1 x 28 ml 2

3 Etiquetagem Natureza dos reagentes Apresentação R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta para utilização) Solução de ácido sulfúrico 1N 1 x 28 ml Consulte as indicações da caixa para obter informações sobre as condições de armazenamento e data de validade. 5. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES A fiabilidade dos resultados depende da implementação correcta das boas práticas de laboratório indicadas a seguir: Não utilize reagentes cujo prazo de validade tenha expirado. Não misture nem associe dentro de uma dada ocorrência reagentes provenientes de diferentes lotes. OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20x cor verde), Cromogénio (R9, identificação da etiqueta: TMB cor turquesa) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N cor vermelha), é possível utilizar outros lotes para além dos incluídos no kit, desde que estes reagentes sejam estritamente equivalentes e o mesmo lote seja utilizado dentro da mesma ocorrência de teste. OBSERVAÇÃO: Não é possível usar o diluente (R7) provenientes de outros lotes, Também não é possível usar o diluente (R7) do Platelia Toxo IgM kits (Ref ). OBSERVAÇÃO: Para além disso, a solução de lavagem (R2, identificação do rótulo : cor verde 20x) pode ser misturada com as outras 2 soluções de lavagem incluídas nos kits de reagentes Bio-Rad (R2, identificações dos rótulo: cor azul 10x ou cor laranja 10x) quando adequadamente reconstituídas, desde que apenas uma mistura seja utilizada num determinado ensaio. Antes da utilização, espere 30 minutos para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18 C a +30 C). Proceda cuidadosamente à reconstituição ou diluição dos reagentes evitando possíveis contaminações. Não realize o teste na presença de vapores reactivos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou poeira que possa alterar a actividade enzimática do conjugado. Utilize material de vidro bem lavado e enxaguado com água desionizada ou, de preferência, material descartável. A lavagem da microplaca é um passo crucial no procedimento: siga o número recomendado de ciclos de lavagem e certifique-se de que os poços enchem completamente sendo, em seguida, completamente esvaziados. As lavagens incorrectas podem levar a resultados imprecisos. Não deixe a microplaca secar entre o fim da operação de lavagem e a distribuição dos reagentes. Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento. A reacção enzimática é muito sensível à presença do metal ou de iões metálicos. Consequentemente, não permita que nenhum elemento metálico entre em contacto com as várias soluções que contenham o conjugado ou o cromogénio. A solução de cromogénio (R9) deve ser incolor. A presença de uma cor azul indica que o reagente não pode ser utilizado, devendo este ser substituído. Utilize uma nova ponta de pipeta para cada amostra. Verifique as pipetas e outros equipamentos para o funcionamento preciso e correcto. 3

4 Instruções relativas à saúde e segurança O material de origem humana utilizado na preparação dos reagentes foi testado e considerado não reactivo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag), anticorpos para o vírus da hepatite C (anti-hcv) e para os vírus da imunodeficiência humana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Porque nenhum método pode garantir em absoluto a ausência de agentes infecciosos, manuseie os reagentes de origem humana e as amostras de pacientes como possíveis transmissores de doenças infecciosas. Qualquer material, incluindo soluções de lavagem, que entre em contacto directo com amostras ou reagentes contendo materiais de origem humana deve ser considerado como possível transmissor de doenças infecciosas. Utilize luvas descartáveis ao manusear as amostras e os reagentes. Não pipete com a boca. Evite derrames de amostras ou de soluções que contenham amostras. Os derrames devem ser lavados com lixívia diluída a 10%. No caso de derrame de um ácido, este deve ser primeiro neutralizado com bicarbonato de sódio e depois lavado com lixívia diluída a 10% e seco com papel absorvente. O material utilizado na limpeza deve ser eliminado num recipiente de resíduos contaminados. As amostras dos pacientes, os reagentes contendo material de origem humana, assim como os materiais e produtos contaminados devem ser eliminados após descontaminação apenas: - por imersão em lixívia a uma concentração final de 5% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos; - ou por autoclavagem a 121 C durante 2 horas no mínimo. ATENÇÃO: Não introduza soluções contendo hipoclorito de sódio na autoclave Evite qualquer contacto dos reagentes, mesmo dos considerados não perigosos, com a pele e as mucosas. Os resíduos químicos e biológicos devem ser manuseados e eliminados de acordo com as boas práticas de laboratório. Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em 6. RECOLHA DO ESPÉCIME, PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO 1. O soro e o plasma (EDTA, heparina ou citrato) são os tipos de amostra recomendados. 2. Observe as seguintes recomendações para o manuseamento, processamento e armazenamento das amostras de sangue: Recolha todas as amostras de sangue com precaução de rotina durante a venipunctura. No soro, permita que as amostras coagulem completamente antes da centrifugação. Mantenha sempre os tubos fechados. Após a centrifugação, separe o soro ou plasma do coágulo ou glóbulos vermelhos num tubo de armazenamento bem fechado. Os espécimes podem ser armazenados entre 2 C e 8 C se o teste for realizado dentro de 7 dias. Se o teste não for concluído ou enviado para transporte dentro de 7 dias, congele as amostras a pelo menos -20 C. Não utilize amostras que tenham sido descongeladas mais do que cinco vezes. Os espécimes previamente congelados devem ser eficazmente homogeneizados (vórtice) após descongelação, antes de serem testados. 3. As amostras contendo 90 g/l de albumina ou 100 mg/l de bilirrubina não conjugada, as amostras lipémicas contendo o equivalente a 36 g/l de trioleína (triglicerídeo) e as amostras hemolisadas contendo até 10 g/l de hemoglobina não afectam os resultados. 4. As amostras não devem ser aquecidas. 4

5 7. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 7.1 Materiais necessários não fornecidos Agitador de vórtice. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620 nm (*). Incubadora de microplaca termostaticamente definida para 37±1 C (*). Lavador de microplacas automático, semi-automático ou manual (*). Água destilada ou desionizada esterilizada. Luvas descartáveis. Viseira ou óculos de protecção. Papel absorvente. Pipetas ou multipipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou predefinidas para medir e distribuir 10 µl a 1000 µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Provetas graduadas com capacidade de 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. Recipiente para resíduos de risco biológico. Tubos descartáveis. (*) Consulte o nosso departamento técnico para obter informações detalhadas relativamente ao equipamento recomendado. 7.2 Reconstituição dos reagentes R1: Mantenha os reagentes durante 30 minutos a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C) antes de abrir o saco. Retire o tabuleiro de transporte, devolva imediatamente as tiras não utilizadas no saco e verifique a presença de dissecante. Torne a selar cuidadosamente o saco e armazene-o a uma temperatura entre +2 C e 8 C. R2: Dilua 1/20 de solução de lavagem R2 em água destilada: por exemplo 50 ml de R2 e 950 ml de água destilada para obter a solução de lavagem pronta para utilização. Se lavar manualmente, prepare 350 ml de solução de lavagem diluída para uma placa de 12 tiras. R3, R4a, R4b, R4c: Dilua 1/21 em diluente (R7) (exemplo: 15 µl de R µl de R7). R6+R7: O conjugado (R6) encontra-se concentrado a 51x e deve ser homogeneizado antes de ser utilizado. Dilua 1/51 em diluente (R7). Para uma placa, dilua 0,5 ml de conjugado (R6) em 25 ml de diluente (R7). Divida estes volumes por 10 para obter o volume necessário para uma tira. 7.3 Armazenamento e validade dos reagentes abertos e/ou reconstituídos O kit deve ser armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C. Quando o kit é armazenado entre +2 C e +8 C antes de ser aberto, cada componente pode ser utilizado até à data de validade indicada na etiqueta externa do kit. R1: Uma vez aberto o kit, as tiras permanecem estáveis durante 8 semanas se forem armazenadas entre +2 C e +8 C no mesmo saco cuidadosamente fechado (verifique a presença de dissecante). R2: Uma vez diluída, a solução de lavagem pode ser guardada durante 2 semanas a uma temperatura entre +2 C e +30 C. A solução de lavagem concentrada armazenada a uma temperatura entre +2 C e +30 C, na ausência de contaminação, é estável até à data de validade indicada na etiqueta. R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Uma vez abertos e sem qualquer contaminação, os reagentes armazenados a uma temperatura entre +2 C e +8 C são estáveis durante 8 semanas. R6+R7: Uma vez diluída, a solução de acção conjugada é estável durante 8 horas a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C) ou durante 2 semanas a uma temperatura entre +2 C e +8 C. R9: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C é estável durante 8 semanas. R10: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C é estável até à data de validade indicada na etiqueta. 5

6 7.4 Procedimento Siga rigorosamente o procedimento de ensaio e as boas práticas de laboratório. Antes da utilização, dê tempo suficiente para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C). O uso de poços quebráveis requer uma atenção especial durante o respectivo manuseamento. Utilize os controlos negativo, de corte e positivo em cada ocorrência para validar os resultados do ensaio. 1. Estabeleça cuidadosamente o plano de distribuição e identificação para os calibradores e amostras dos pacientes. 2. Prepare a solução de lavagem diluída (R2) [consulte a secção 7.2]. 3. Retire o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) dos respectivos invólucros [consulte a secção 7.2]. 4. Dilua os calibradores R3, R4a, R4b, R4c e as amostras dos pacientes (S1, S2 ) em diluente (R7) para obter uma diluição 1/21: 15 µl de amostra e 300 µl de diluente (R7)[consulte a secção 7.2]. Agite as amostras diluídas no vórtice. 5. Seguindo rigorosamente a sequência indicada abaixo, distribua 200µl de calibradores e amostras de pacientes diluídas em cada poço: A R3 S5 S13 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incuba imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora 5 minutos a 37 C 1 C. 7. No fim da primeira incubação, prepare a solução de acção conjugada (R6+R7) [consulte a secção 7.2]. 8. No final da primeira incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante. 9. Distribua imediatamente 200 µl de solução de acção conjugada (R6+R7) em todos os poços. A solução deve ser agitada suavemente antes de ser utilizada. 10. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incuba imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora 5 minutes a 37 C 1 C. 11. No final da segunda incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante. 12. Num local escuro, distribua rapidamente em cada poço 200 µl de solução de cromogénio (R9). Deixe a reacção ocorrer no escuro, durante 30 minutos ± 5 minutos a uma temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C). Não utilize selante de placa adesivo durante esta incubação. 13. Pare a reacção enzimática adicionando 100 µl de solução de paragem (R10) em cada poço. Utilize a mesma sequência e proporção de distribuição da solução de desenvolvimento. 14. Seque cuidadosamente o fundo da placa. Leia a densidade óptica a 450/620 nm, utilizando um leitor de placa, nos 30 minutos após ter parado a reacção. As tiras devem sempre ser guardadas longe da luz antes da leitura. 15. Antes de relatar os resultados, verifique a consonância entre a leitura e o plano de distribuição da placa e amostras. 6

7 8 CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 8.1 Construção da curva padrão A presença e concentração de anticorpos IgG para o T. gondii numa amostra serão determinadas por comparação de densidade óptica (DO) dessa amostra relativamente à concentração em unidades internacionales por milílitro (UI/ml) dos calibradores da curva padrão. Os soros de calibração R4a, R4b, R4c são calibrados em relação ao padrão WHO International Standard TOX-M. Embora os soros de calibração utilizados neste dispositivo sejam aferidos em função do soro WHO, podem observar-se certas discrepâncias de titulo para um mesmo soro, quando testado por diferentes técnicas serológicas. Esta discrepância é devida ao facto de os antigénios toxoplasmáticos utilizados nestas diferentes técnicas terem proporções variáveis de antigénios membranares e solúveis. Desenhe a curva padrão [DO = função (UI/ml)] colocando as leituras de DO dos calibradores R3, R4a, R4b e R4c no eixo vertical (Y) e, em seguida, as respectivas concentrações em UI/ml no eixo horizontal (X). Para cada amostra testada, calcule a titulação de anticorpos IgG anti-t. gondii determinando, a partir da curva padrão desenhada, a concentração correspondente à DO medida. Nota: se a DO da amostra for superior à DO de R4c, a amostra pode ser diluída a 1/210 em R7 e novamente testada. Nesse caso, multiplicar por 10 o valor em UI/ml obtido no eixo dos X. 8.2 Controlo de qualidade Inclua todos os calibradores para cada microplaca e para cada ocorrência e analise os resultados obtidos. Para a validação do ensaio, devem ser reunidos os seguintes critérios: Valores da densidade óptica: OD R4a 0,200 OD R4b 0,400 Razões da densidade óptica: OD R4a / OD R3 5,00 OD R4b / OD R4a 2,20 OD R4c / OD R4b 1,15 Se estes critérios de controlo de qualidade não forem reunidos, deve repetir-se a ocorrência de teste. 8.3 Interpretação dos resultados Titulação de anticorpos anti-t. Gondii (UI/ml) Resultado Interpretação Titulação < 6 IU/ml Negativo 6 IU/ml Titulação < 9 IU/ml Ambíguo Um resultado negativo ou ambíguo indica a ausência de imunidade adquirida, mas não pode excluir uma infecção recente. Se houver suspeitas de contaminação de um paciente, deverá ser analisada uma segunda amostra cerca de duas semanas depois. Titulação 9 IU/ml Positivo Um resultado positivo é, geralmente, indicador de uma infecção passada. No entanto, não poderá ser excluída a hipótese de infecção recente, em especial se estiverem presentes anticorpos IgM anti-t. gondii. Acima de concentrações de 200 UI/ml, pode observar-se uma maior variação de titulações. 7

8 8.4 Guia de detecção e resolução de problemas As reacções não validadas ou impossíveis de repetir são frequentemente causadas por: Lavagens inadequadas da microplaca. Contaminação de amostras negativas com soro ou plasma com uma grande dose de anticorpos. Contaminação da solução de desenvolvimento com agentes oxidantes químicos (lixívia, iões metálicos...). Contaminação da solução de paragem. 9 DESEMPENHOS Foram avaliados os desempenhos do Platelia Toxo IgG em 2 locais num total de 1310 amostras de mulheres grávidas e dadores de sangue. Foi feito um estudo comparativo com Platelia Toxo IgG TMB (72741) num teste manual; um segundo estudo foi feito noutro centro, comparando os desempenhos do Platelia Rubella IgG com Platelia Toxo IgG TMB (72741) ) numa analizador automático da microplaca. Adicionalmente, as características do kit Platelia Toxo IgG foram avaliadas em 47 amostras de sangue de cordão. 9.1 Prevalência A prevalência de anticorpos IgG anti-toxoplasma gondii utilizando o Platelia Toxo IgG foi calculada num painel de 538 amostras na sua maioria de mulheres grávidas monotorizados durante a gravidez da área Paria (França). 128 amostras revelaram um resultado positivo para os anticorpos IgG antitoxoplasma. A prevalência, medida através do ensaio Platelia Toxo IgG, foi estabelecida a 23,8% (128/538). 9.2 Estudo Comparativo (Centro 1) Foram avaliados os desempenhos do Platelia Toxo IgG num painel de 745 amostras divididas da seguinte forma: 606 soros de dadores de sangue 139 soros de mulheres grávidas Os resultados foram comparados com os obtidos utilizando Platelia Toxo IgG TMB (72741) e considerado como referência. Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negativo Ambíguo* Positivo Total Negativo Platelia Toxo IgG (72840) Ambíguo* Positivo Total Concordância global: 743/ ,0% [IC 95% = 99,5% - 100,0%] Especificidade relativa: 365/ ,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%] Sensibilidade relativa: 378/ ,0% [IC 95% = 99,0% - 100,0%] * Para cálculo da sensibilidade, da especificidade e de concordância, os resultados ambíguos foram excluidos. [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%. 8

9 9.3 Desempenhos (Centro 2) Um estudo foi feito com 538 amostras na sua maioria de mulheres grávidas monotorizados durante a gravidez. Estas amostras foram testadas em paralelo com Platelia Toxo IgG and Platelia Toxo IgG TMB (72741). Todas as amostras de doentes desconhecidos do laboratório e tendo um titulo acima 100 UI/ml foram testadas com um segundo método: Aglutinação sensível (Antigenio laboratorio: T. gondii, RH estirpe) para amostras com titulo > 10 UI/ml. IF indirecta (Antigenio laboratorio: T. gondii, RH estirpe) para amostras com titulo entre 3 e 10 UI/ml. Os resultados foram comparados com os obtidos utilizando Platelia Toxo IgG TMB (72741) e considerado como referência. Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negativo Ambíguo* Positivo Total Negativo Platelia Toxo IgG (72840) Ambíguo* Positivo Total Concordância global: 517/524 98,7% [IC 95% = 97,3% - 99,5%] Especificidade relativa: 406/413 98,3% [IC 95% = 96,5% - 99,3%] Sensibilidade relativa: 111/ ,0% [IC 95% = 96,8% - 100,0%] * Para cálculo da sensibilidade, da especificidade e de concordância, os resultados ambíguos foram excluidos. [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%. As 7 amostras discrepantes com Platelia Toxo IgG foram todos confirmados com metodos complementares diagnostico pelo laboratorio (Agglutinação Sensível, IF Indirecta). 9 paineis de seroconversões incluiam 3 amostras foram estudadas Platelia Toxo IgG (72840) e Platelia Toxo IgG TMB (72741). Para cada painel, a primeira amostra foi negativa para ambas anti- Toxoplasma gondii IgG e IgM anticorpos. Em 8 dos 9 paineis seroconversões, ambos os testes obtiveram resultados similares. Para um painel, a 2º soro de seroconversão foi positivo com Platelia Toxo IgG, mas duvidoso com Platelia Toxo IgG TMB. 9.4 Características sobre amostras de sangue de cordão 47 amostras de sangue de cordão foram testadas com a ajuda do protocolo descrito no parágrafo 7.4 (diluição da amostra a 1/21) : 22 amostras provenientes de toxoplasmoses congenitais confirmadas 18 amostras provenientes de antigas infecções maternais confirmadas 7 amostras sem infecções. Todas as amostras com infecções congenitais ou antigas foram positivas com o dispositivo Platelia Toxo IgG (72840), e entre elas, todas as amostras com infecções antigas tiveram resultados negativos com o dispositivo Platelia Toxo IgM (72841). As 7 amostras sem infecção foram confirmadas negativas. 9

10 Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841) Positivo Ambíguo Negativo Positivo Ambíguo Negativo Toxoplasmose congenital (n=22) Infecção maternal antiga (n=18) Ausência de infecção (n=7) Reactividade cruzada Para detecção de anticorpos IgG anti-toxoplasma, foi testado com os ensaios Platelia Toxo IgG (72840) e Platelia Toxo IgG TMB (72741) um painel de 197 amostras, incluindo 159 amostras positivas à rubéola, CMV, EBV, HSV, VZV, papeira, sarampo e VIH, e 38 amostras positivas ao factor reumatóide, auto-anticorpos e anticorpos heterófilos. 141amostras foram negativas, 55 foram positivas e 1 duvidoso com Platelia Toxo IgG. Todas as amostras positivas foram positivas com Platelia Toxo IgG TMB. 9.6 Precisão Precisão dentro da ocorrência (repetibilidade): De forma a avaliar a repetibilidade intra-ensaio, foram testadas uma amostra negativa e três amostras positivas 32 vezes durante a mesma ocorrência. Foi determinada a concentração (UI/ml) para cada amostra. A média de concentrações (UI/ml), o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (%CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentados no quadro seguinte: Precisão dentro da ocorrência (repetibilidade) Amostra positiva Amostra positiva Amostra negativa Amostra positiva N=32 baixa alta Concentração (UI/ml) Média 0,15 16,0 39,8 167,5 DP 0,01 2,3 2,7 23,1 %CV 7,2 14,4 6,9 13,8 Precisão entre ocorrências (reproducibilidade): De forma a avaliar a reprodutibilidade inter-ensaio, cada um dos quatro espécimes (uma amostra negativa e três positivas) foram testados em duplicado em duas ocorrências por dia durante um período de 20 dias. Foi determinada a concentração (UI/ml) para cada amostra. A média de concentrações (UI/ml), o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (%CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentados no quadro seguinte: Precisão entre ocorrências (reproducibilidade) N=80 Amostra positiva Amostra positiva Amostra negativa Amostra positiva baixa alta Concentração (UI/ml) Média 0,15 15,2 41,7 166,5 DP 0,05 2,4 4,2 21,0 %CV 32,6 15,5 10,1 12,6 9.7 Exactidão e Linearidade Para avaliar a exactidão da calibração, foram feitas diluições WHO International Standard TOX-M. Os resultados obtidos demonstraram Platelia TOXO IgG esta calibrado com o WHO International Standard TOX-M para valores maiores a 30 IU/ml. A cima 30 IU/ml, resultados obtidos estão subestimadoso 25 a 50%. Usaram diluições sucessivas com 5 amostras positivas, Platelia Toxo IgG foi establecido entre 7 e 200 UI/ml. 10

11 10 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O diagnóstico da infecção por T. gondii só pode ser estabelecido com base numa combinação de dados clínicos e biológicos. O resultado de um único teste de detecção de anticorpos IgG anti-t. gondii não constitui uma prova suficiente para o diagnóstico da infecção por T. gondii. O diagnóstico de infecção recente só poderá ser feito com uma informação completa sobre o paciente, incluindo dados clínicos e biológicos (aumento significativo de anticorpos IgG anti-t. gondii no soro de 2 pacientes colhido num intervalo de 3 semanas e testado na mesma análise, presença de IgM anti-t. gondii a nível significativo, demonstração de baixa avidez de IgG anti-t. gondii). A presença de anticorpos IgM anti-t. gondii não constitui prova suficiente para confirmar uma infecção recente, visto que o IgM pode persistir vários meses, ou mesmo anos, após a infecção. Quando são detectados IgM, deverá ser realizada uma determinação quantitativa de anticorpos IgG anti-t. gondii bem como um acompanhamento da evolução de anticorpos anti-t. gondii em, pelo menos, uma segunda amostra de soro três semanas mais tarde. Se uma amostra for testada demasiado cedo durante uma primo-infecção, os anticorpos IgM anti- T. gondii poderão não estar ainda presentes. Se existirem suspeitas, deverá ser colhida uma segunda amostra cerca de 3 semanas mais tarde, a qual deverá ser sujeita a novo teste IgM. 11 CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nosso sistema de qualidade, desde a recepção da matéria-prima até à comercialização do produto final. Cada lote é submetido a testes de controlo de qualidade e só é introduzido no mercado quando estiver em conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos de produção e de controlo de cada lote são mantidos no seio da Bio-Rad. 12 REFERÊNCIAS 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome forinfected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3,

12 9. WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. Antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

13 13

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