PLATELIA Aspergillus IgG TESTES DETECÇÃO DOS ANTICORPOS IgG ANTI-ASPERGILLUS NO SORO OU PLASMA HUMANO ATRAVÉS DE MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO

Transcrição

1 PLATELIA Aspergillus IgG TESTES DETECÇÃO DOS ANTICORPOS IgG ANTI-ASPERGILLUS NO SORO OU PLASMA HUMANO ATRAVÉS DE MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO 1- OBJECTIVO DO TESTE O ensaio Platelia Aspergillus IgG é uma técnica imunoenzimática indirecta em microplaca, para a detecção dos anticorpos IgG anti-aspergillus no soro ou plasma humano. 2- INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO O ensaio Platelia Aspergillus IgG é um teste que, interpretado em função do contexto clínico e terapêutico do doente e realizado em associação com outras técnicas de diagnóstico como, por exemplo, exames radiológicos, citológicos, imunológicos e micológicos directos, pode ser utilizado como auxiliar do diagnóstico das patologias por aspergillus. 3- INTERESSE CLÍNICO Nos indivíduos imunocomprometidos podem ser encontradas diversas patologias por aspergillus crónicas, sendo o seu diagnóstico, frequentemente, difícil. Um processo de sensibilização aos bolores está na origem de manifestações alérgicas como, por exemplo, a asma e a aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA), que representa a forma clínica mais exacerbada 4, 8. Os doentes com fibrose quística constituem uma população em risco de contrair ABPA e são regularmente vigiados quanto a este diagnóstico 1, 2. Uma alveolite extrínseca pode ser encontrada nos indivíduos expostos a uma inalação maciça de esporos, sendo as suas formas mais conhecidas o pulmão do criador de aves e o pulmão do agricultor. O aspergiloma representa a patologia crónica não alérgica mais típica, resultando da colonização de uma cavidade pulmonar preexistente (tuberculose, enfisema, sarcoidose, cancro do pulmão) pelo micélio fúngico formando uma autêntica bola fúngica 4, 6, 10. Entre as outras patologias não alérgicas, a aspergilose crónica necrosante representa uma forma muito grave, progressivamente fatal. Devido a estas diferentes manifestações clínicas, alérgicas ou não alérgicas, o diagnóstico da aspergilose é frequentemente difícil de efectuar. Com efeito, os sinais clínicos podem lembrar outras afecções micóticas, bacterianas, virais e até cancerosas. O exame radiológico, característico para o aspergiloma, não o é tão claramente para as outras formas de aspergilose, para as quais a clínica e o exame radiológico são apenas elementos de orientação. Os parâmetros biológicos e, em particular, os testes serológicos são indispensáveis para apoiar este diagnóstico 5. Assim, nos doentes em risco de aspergiloma, infecção grave mas com frequência clinicamente silenciosa, a vigilância serológica torna-se pertinente. O diagnóstico inequívoco de ABPA baseia-se em cinco critérios, entre os quais a detecção sérica dos anticorpos anti-aspergillus 13. O dispositivo Platelia Aspergillus IgG, que é um teste que permite a detecção de imunoglobulinas da classe G dirigidas contra um antigénio recombinante purificado de Aspergillus, representa uma ferramenta complementar do diagnóstico destas formas crónicas de aspergilose, observadas nos indivíduos imunocomprometidos 3. Por outro lado, a presença de anticorpos anti-aspergillus foi recentemente descrita em doentes onco-hematológicos, antes de se dar início ao tratamento imunossupressor para o transplante de medula óssea. Estes trabalhos sugerem a detecção de uma colonização aspergilar aquando do exame de admissão hospitalar ou aquando do exame antecedente do transplante, nos doentes que, após início dos tratamentos imunossupressores, vão constituir uma população em risco de aspergilose invasiva. 4- PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO O ensaio Platelia Aspergillus IgG é uma técnica imunoenzimática indirecta em 2 tempos, em microplaca, que permite a detecção dos anticorpos IgG anti-aspergillus no soro ou plasma humano. As amostras diluídas de soro ou plasma são distribuídas pelos poços da microplaca sensibilizados com o antigénio recombinante purificado de Aspergillus 7. Após uma incubação a 37 C, as tiras são lavadas para retirar todo o material não fixado. O conjugado (anticorpo monoclonal de rato anti-igg humanas marcado com peroxidase) é adicionado a cada poço da microplaca e incuba a 37 C. Na presença de IgG anti-aspergillus na amostra humana, forma-se um complexo: Ag Aspergillus-IgG humana anti-aspergillus-ac de rato anti-igg humanas/peroxidase. As tiras são lavadas para retirar todo o material não fixado. A adição do cromogénio contendo o substrato da peroxidase e a incubação à temperatura ambiente permitem a revelação dos complexos eventualmente formados. A reacção enzimática é parada pela adição de ácido sulfúrico 1N. A leitura da densidade óptica é efectuada com um espectrofotómetro regulado para 450/620 nm. 1

2 5- REAGENTES Os reagentes são fornecidos em quantidade suficiente para a realização de 96 determinações, num máximo de 9 séries. Consultar as indicações fornecidas na caixa do kit para obter informações sobre as condições de conservação e o prazo de validade dos reagentes. Antes de utilizar, deixar todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente ( C). Voltar a colocar todos os reagentes a +2-8 C imediatamente após a utilização. Voltar a colocar as tiras não utilizadas na bolsa de origem e fechar cuidadosamente. Não retirar o exsicante. Rotulagem Natureza dos reagentes Apresentação R1 Microplate Microplaca: - 96 poços (12 tiras com 8 poços cada) sensibilizados com o antigénio Aspergillus recombinante purificado. 1 R2 Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 10 R4b Calibrator 20 R4c Calibrator 40 R4d Calibrator 80 R6 R7a Conjugate Sample Diluent 1 Solução de lavagem concentrada (20x): - Tampão TRIS-NaCl (ph 7,4) - Tween 20 a 2% Calibrador 0 UA/ml (pronto a usar): - Tampão Tris-NaCl isento de IgG anti-aspergillus Calibrador 10 UA/ml (pronto a usar): - Soro humano contendo IgG anti-aspergillus Calibrador 20 UA/ml (pronto a usar): - Soro humano contendo anticorpos anti-aspergillus Calibrador 40 UA/ml (pronto a usar): - Soro humano contendo anticorpos anti-aspergillus Calibrador 80 UA/ml (pronto a usar): - Soro humano contendo anticorpos anti-aspergillus Conjugado (pronto a usar): - Anticorpo monoclonal de rato anti-igg humanas, marcado com uma peroxidase - Vermelho de fenol Diluente de amostras 1 (pronto a usar): - Tampão Tris-NaCl - Tween 20 a 0,1% - Vermelho de fenol 1 x 70 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 2,5 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml R7b Sample Diluent 2 Diluente de amostras 2 (pronto a usar): - Tampão Tris-NaCl - Tween 20 a 0,1% - Púrpura de bromocresol 1 x 26 ml R9 Chromogen TMB Solução de cromogénio TMB (pronta a usar): - Solução de 3,3,5,5 -tetrametilbenzidina (<0,1%), H2O2 (<1,0%) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta a usar): - Solução de ácido sulfúrico 1N 1 x 28 ml Películas adesivas 4 6- CONSELHOS DE HIGIENE E SEGURANÇA 1. Apenas para diagnóstico in vitro. 2. Utilização reservada a profissionais. 3. A utilização deste teste com amostras que não sejam soro ou plasma humano não é recomendada. 2

3 4. Os calibradores R4a, R4b, R4c e R4d são preparados a partir de soro humano testado e considerado negativo quanto à presença de anticorpos anti--1, anti--2 e anti- e de antigénio HBs, através de testes com marcação CE. Todavia, todos os reagentes devem ser manipulados como sendo potencialmente infecciosos. Todos os testes devem ser realizados de acordo com a norma OSHA relativa aos agentes patogénicos transmitidos por via hematogénica, nível 2 de biossegurança ou conforme com outras práticas de biossegurança adaptadas. 5. Usar vestuário de protecção, incluindo uma bata de laboratório, um protector para os olhos e o rosto e luvas descartáveis (recomendam-se luvas de material sintético sem látex) e manipular os reagentes do kit e as amostras de acordo com as Boas Práticas Laboratoriais (BPL) necessárias. Lavar cuidadosamente as mãos após a realização do teste. 6. Não pipetar com a boca. 7. Não fumar, beber ou comer nas zonas de manipulação das amostras ou dos reagentes do kit. 8. Evitar os salpicos de amostras ou de soluções. 9. As superfícies sujas com um líquido contaminante que não contenha ácido devem ser cuidadosamente limpas com um desinfectante eficaz. Os desinfectantes que podem ser utilizados incluem (entre outros) uma solução de lixívia diluída a 10% (solução de hipoclorito de sódio a 0,5%), etanol a 70% ou Wescodyne Plus a 0,5%. O material utilizado para a limpeza deve ser eliminado num contentor especial destinado aos resíduos contaminados. ATENÇÃO: Nunca colocar soluções com lixívia na autoclave. 10. Se o líquido contaminante é um ácido, as superfícies sujas devem ser limpas ou neutralizadas com bicarbonato de sódio e a zona deve ser enxaguada e seca; no caso do líquido contaminante conter matéria biologicamente perigosa, lavar a zona com um desinfectante químico. 11. Eliminar as amostras e os reagentes utilizados no teste como sendo potencialmente infecciosos. A eliminação dos resíduos químicos e biológicos perigosos deve cumprir todos os requisitos aplicáveis em vigor. 12. ATENÇÃO: Apresenta-se a seguir uma lista dos potenciais riscos químicos apresentados por alguns componentes do kit (consultar o capítulo 5 REAGENTES) Alguns reagentes contêm ProClin 300 <1,5%: R43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele S : Não respirar os vapores/aerossóis. Evitar o contacto com a pele. Usar luvas apropriadas. Eliminar o produto e o seu recipiente como resíduos perigosos. Xi-Irritante 13. A ficha de dados de segurança (FDS) encontra-se disponível mediante solicitação. 7- PRECAUÇÕES DE UTILIZAÇÃO 1. AS AMOSTRAS CONGELADAS E CONSERVADAS EM CONDIÇÕES DESCONHECIDAS PODEM DAR RESULTADOS FALSOS POSITIVOS DEVIDO A CONTAMINAÇÃO POR FUNGOS E/OU BACTÉRIAS. 2. Não utilizar o kit ou qualquer dos respectivos reagentes após a expiração do prazo de validade. 3. Não misturar, nem associar numa mesma série reagentes provenientes de caixas com números de lote diferentes. NOTA: É possível utilizar lotes de solução de lavagem (R2, identificada* com 20x verde), de cromogénio (R9, identificado* com TMB turquesa) e de solução de paragem (R10, identificada* com 1N vermelho), diferentes dos fornecidos na caixa do kit, sob a condição de usar reagentes estritamente equivalentes de um único lote, durante uma determinada série. NOTA: A solução de lavagem (R2, identificada* com 20X verde) não pode ser misturada com a solução de lavagem (R2, identificada* com 10X azul) fornecida nos kits de reagentes Bio-Rad. *no rótulo do frasco 4. Antes da utilização, aguardar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente (+18 a +30 C). 5. Utilizar, de preferência, material descartável. Na falta, utilizar material de vidro perfeitamente lavado e enxaguado com água destilada. 6. Verificar a exactidão das pipetas e o bom funcionamento dos aparelhos utilizados. 7. Reconstituir cuidadosamente o reagente R2, evitando qualquer contaminação. 8. A reacção enzimática é muito sensível a todos os metais e iões metálicos. Consequentemente, nenhum elemento metálico deve entrar em contacto com as várias soluções contendo o conjugado ou a solução de substrato. 9. Para a pipetagem dos calibradores e das amostras, utilizar pontas individuais novas para cada soro de modo a evitar qualquer contaminação. 10. Para assegurar a lavagem adequada dos poços, respeitar o número de ciclos de lavagem recomendados e garantir que todos os poços são completamente cheios e, depois, completamente esvaziados. A lavagem deve ser efectuada com um lavador de microplacas. 11. Não deixar a microplaca secar entre o fim do ciclo de lavagem e a adição dos reagentes. 12. Não utilizar o mesmo recipiente para a solução de conjugado e para a solução de revelação. 13. Durante a conservação ou a incubação, evitar a exposição da solução de cromogénio ou da solução de revelação a luz forte. Não permitir o contacto das soluções de cromogénio com agentes oxidantes. 14. O cromogénio (R9) deve ser incolor. O aparecimento de uma coloração azul indica que o reagente está inutilizado e deve ser substituído. 15. Evitar o contacto da solução de paragem com agentes oxidantes, metais ou iões metálicos. 16. Não deitar de novo no frasco de origem o excedente de conjugado não utilizado. 3

4 8- PREPARAÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES Microplaca (R1) Cada suporte da placa contém 12 tiras e é fornecido numa bolsa. Abra a bolsa com uma tesoura logo abaixo da zona soldada. Abra a bolsa e retire o suporte da placa. Volte a colocar o suporte da placa com as tiras não utilizadas na bolsa de origem. Feche cuidadosamente a bolsa e conserve a +2-8 C. Após a abertura da bolsa sob vácuo, as tiras conservadas a +2-8 C na sua bolsa de origem, devidamente fechada, são estáveis durante 8 semanas. Verifique a presença de exsicante. Solução de lavagem (R2) Prepare a solução de lavagem diluindo 20 vezes a solução de lavagem concentrada com água destilada: 50 ml de R2 para 950 ml de água destilada (prever 650 ml de solução de lavagem diluída para uma placa completa com 12 tiras, fora o volume morto do lavador utilizado). Após a diluição, a solução de lavagem pode ser conservada durante 14 dias a C. Após a sua abertura, a solução de lavagem concentrada, conservada a C, e na ausência de contaminação, é estável até à data de expiração indicada no rótulo. Calibrador 0 (R3), calibrador 10 (R4a), calibrador 20 (R4b), calibrador 40 (R4c), calibrador 80 (R4d): Os calibradores estão prontos a serem utilizados. Após abertura, estes reagentes conservados a +2-8 C, e na ausência de contaminação, são estáveis durante 8 semanas. Conjugado (R6), Diluente de amostras 1 (R7a), Diluente de amostras 2 (R7b), Solução de cromogénio TMB (R9): Estes reagentes estão prontos a serem utilizados. Após abertura, estes reagentes conservados a +2-8 C, e na ausência de contaminação, são estáveis durante 8 semanas. Solução de paragem (R10): Este reagente está pronto a ser utilizado. Após a sua abertura, este reagente conservado a +2-8 C, e na ausência de contaminação, é estável até à data de expiração indicada no rótulo. 9- AMOSTRAS 1. Os testes são efectuados com amostras de soro ou plasma colhidas sobre anticoagulante do tipo EDTA, heparina ou citrato. 2. Respeite as indicações seguintes para a colheita, tratamento e conservação das amostras de sangue: Colha uma amostra de sangue de acordo com os procedimentos em vigor. Para as amostras séricas, deixe coagular completamente antes de centrifugar. Mantenha os tubos fechados. Após a centrifugação, separe o soro ou o plasma e conserve em tubo fechado. As amostras deverão ser conservadas a +2-8 C se o teste for efectuado nos 4 dias seguintes. Se o teste não for efectuado nos 4 dias seguintes, congele as amostras a -20 C (ou -80 C). É recomendável não ultrapassar os cinco ciclos de congelação/descongelação. As amostras devem ser cuidadosamente homogeneizadas (em Vortex) após a descongelação e antes da realização do teste. 3. Os resultados não são afectados por amostras com 90 g/l de albumina ou 100 mg/l de bilirrubina não conjugada, por amostras lipémicas contendo o equivalente a 36 g/l de trioleína (triglicérido) ou por amostras hemolisadas contendo 10 g/l de hemoglobina. 4. As amostras não devem ser aquecidas. 10- PROCEDIMENTO Material fornecido Consulte o capítulo REAGENTES Materiais necessários não fornecidos 1. Água destilada ou desmineralizada esterilizada para a diluição da solução de lavagem concentrada. 2. Papel absorvente. 3. Luvas descartáveis. 4. Óculos de protecção. 5. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. 6. Pipetas ou multipipetas, automáticas ou semiautomáticas, reguláveis ou fixas, com capacidade de medição e distribuição de 10 µl a 1000 µl, 1 ml, 2 ml e 10 ml. 7. Provetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml. 8. Tubos descartáveis. 9. Contentor para resíduos contaminados. 10. Agitador do tipo Vortex. 11. Incubadora de microplacas regulável para 37 C±1 C (*). 4

5 12. Lavador de microplacas semiautomático ou automático (*). 13. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 e 620 nm (*). (*) Consulte-nos para obter informações precisas sobre os aparelhos validados pelos nossos serviços técnicos. Procedimento EIA Cumpra rigorosamente o protocolo proposto. Cumpra as boas práticas laboratoriais: - Deixe todos os reagentes atingirem a temperatura ambiente (18-30 C), durante pelo menos 30 minutos, antes de os utilizar. - Utilize todos os calibradores em todos os ensaios para validar a qualidade do teste. Proceda da seguinte forma: 1. Prepare cuidadosamente o plano de distribuição e identificação dos calibradores e das amostras. 2. Pré-dilua extemporaneamente as amostras que vão ser testadas: diluição 1:20, ou seja, 10 μl de soro ou de plasma μl do diluente de amostras 1 (R7a). A pré-diluição das amostras tem uma coloração vermelha. 3. Retire o suporte e as tiras (R1) da sua embalagem protectora. Volte a colocar as tiras não utilizadas na embalagem e feche-a bem. 4. Distribua 190 µl de diluente de amostras 2 (R7b) nos poços destinados às amostras que vão ser testadas e adicione 10 µl das amostras pré-diluídas 1:20, misturando delicadamente aspirando 2 ou 3 vezes com a pipeta. NB: Nesta fase da manipulação, a distribuição das amostras pode ser controlada, pois após a adição dos 10 µl das amostras pré-diluídas, os poços contendo amostras ficam cinzentos. Um poço sem amostra tem uma coloração azul violeta. 5. Distribua os calibradores prontos a utilizar, pipetando 200 μl por poço, de acordo com o plano seguinte: - A1: Calibrador 0 - B1: Calibrador 10 UA/ml - C1: Calibrador 20 UA/ml - D1: Calibrador 40 UA/ml - E1: Calibrador 80 UA/ml A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Cubra a microplaca com película adesiva fazendo pressão sobre toda a superfície para garantir a estanquicidade. 7. Incube imediatamente a microplaca numa incubadora de microplacas seca durante 60±5 minutos a 37 C (+/-1 C). 8. Prepare a solução de lavagem diluída (ver capítulo 8). 9. Retire a película adesiva. Aspire o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados (contendo hipoclorito de sódio). 10. Lave a microplaca 4 vezes com um lavador de microplacas (com 800 µl de solução de lavagem diluída). Após a última lavagem, inverta a microplaca e bata-a suavemente sobre papel absorvente para eliminar a totalidade do líquido. 11. Antes de utilizar, homogeneíze o conteúdo do frasco R6 por inversão. No caso de utilização de uma pipeta multicanais, utilize apenas o volume necessário para a realização da série. Prever 3,5 ml para duas tiras com 8 poços cada. 12. Distribua 200 μl de conjugado R6 em cada poço. 13. Cubra a microplaca com película adesiva fazendo pressão sobre toda a superfície para garantir a estanquicidade. 14. Incube a microplaca numa incubadora de microplacas seca durante 60±5 minutos a 37 C (+/-1 C). 15. Retire a película adesiva. Aspire o conteúdo de todos os poços para um contentor de resíduos contaminados (contendo hipoclorito de sódio). 16. Lave a microplaca 4 vezes com um lavador de microplacas (com 800 µl de solução de lavagem diluída). Após a última lavagem, inverta a microplaca e bata-a suavemente sobre papel absorvente para eliminar a totalidade do líquido. 17. Distribua rapidamente e ao abrigo da luz forte 200 μl da solução de cromogénio TMB (R9) em cada poço. 18. Incube a microplaca no escuro à temperatura ambiente ( C) durante 30±5 minutos. Não utilize película adesiva durante esta incubação. 19. Adicione 100 µl de solução de paragem (R10) a cada poço, pela mesma sequência e com o mesmo ritmo de distribuição da solução de revelação. Misture bem. 20. Limpe muito bem o fundo de cada microplaca. 21. Leia a densidade óptica de cada poço a 450 nm (filtro de referência de 620 nm) nos 30 minutos seguintes à adição da solução de paragem (antes da leitura, as tiras devem ser sempre mantidas ao abrigo da luz). 22. Antes de transcrever os resultados, certifique-se da concordância entre a leitura e o plano de distribuição das microplacas. 5

6 11- CONTROLO DE QUALIDADE (CRITÉRIOS DE VALIDADE) Utilize os calibradores em cada microplaca e por cada ensaio. A fim de validar o teste, devem ser respeitados os seguintes critérios: Valor da densidade óptica: DO R4a > 0,200 Razões: DO R4A/DO R3 > 3,00 DO R4b/DO R4a > 1,20 DO R4c/DO R4b > 1,20 DO R4d/DO R4c > 1, INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Traçado da curva de calibração A curva de calibração é traçada com 5 pontos da gama (calibradores) 0, 10, 20, 40 e 80 UA/ml. Trace a curva de calibração [DO = função (UA/ml)] colocando no eixo vertical (Y) as DO dos calibradores R3, R4a, R4b, R4c e R4d e no eixo horizontal (X) as respectivas concentrações em UA/ml. Opte por um traçado ponto a ponto unindo os diferentes pontos da gama (calibradores). Determinação da concentração dos anticorpos IgG anti-aspergillus (UA/ml) das amostras testadas A partir da curva anteriormente traçada, é possível determinar, para cada amostra testada, a concentração de anticorpos IgG anti-aspergillus, expressa em UA/ml. Interpretação dos resultados As amostras com concentrações inferiores a 5 UA/ml (C <5) são consideradas negativas quanto à presença de anticorpos IgG anti-aspergillus. As amostras com concentrações compreendidas entre 5 e 10 UA/ml (5 C <10) são consideradas intermédias quanto à presença de anticorpos IgG anti-aspergillus. As amostras com concentrações iguais ou superiores a 10 UA/ml (C 10) são consideradas positivas quanto à presença de anticorpos IgG anti-aspergillus. Os calibradores utilizados para traçar a curva de calibração não permitem uma determinação precisa das concentrações superiores a 80 UA/ml. Caso se pretenda obter uma determinação mais precisa do título das amostras fortemente positivas, será necessário repetir o teste efectuando uma pré-diluição adicional do soro com diluente R7a: - Para as amostras com um título > 80 UA/ml e DO <3,00: efectuar uma primeira pré-diluição 1:5 do soro em R7a. - Para as amostras com um título > 80 UA/ml e DO 3,00: efectuar uma primeira pré-diluição 1:60 do soro em R7a. Após esta primeira pré-diluição, siga o procedimento mencionado no capítulo 10 (pré-diluição 1:20 em R7a seguida de diluição 1:20 em R7b). O título da amostra fortemente positiva será calculado multiplicando o título assim obtido pelo factor da primeira prédiluição (ou seja: 5 ou 60 conforme a pré-diluição efectuada). Um resultado intermédio poderá ser confirmado com uma nova colheita efectuada nas semanas seguintes à colheita que originou um título intermédio. Para o acompanhamento serológico do doente, recomenda-se testar o conjunto das amostras do doente numa mesma série de modo a permitir a detecção de variações significativas dos títulos dos anticorpos IgG anti-aspergillus. 13- LIMITES DA UTILIZAÇÃO 1. Um resultado negativo não permite excluir um diagnóstico de aspergilose. Apenas deve ser proposto um diagnóstico de aspergilose após a conjugação dos dados clínicos, terapêuticos, radiológicos, citológicos, micológicos directos e serológicos, devendo cada elemento isolado ser interpretado com cautela. 2. Para um doente imunocomprometido com suspeita de aspergilose, um soro colhido precocemente no decurso de uma infecção aspergilar pode apresentar um resultado negativo para a detecção de IgG anti-aspergillus. Recomenda-se a realização de um novo teste com uma nova colheita efectuada com duas a três semanas de intervalo. 3. O procedimento e a interpretação dos resultados descritos para o teste Platelia Aspergillus IgG devem ser cumpridos quando as amostras são testadas quanto à presença de anticorpos IgG anti-aspergillus. Recomenda-se que os utilizadores do kit leiam as instruções de utilização cuidadosamente antes de efectuar o teste. O protocolo deve ser especialmente respeitado quanto à pipetagem das amostras e dos reagentes, lavagem da microplaca e duração das etapas de incubação. 4. O não cumprimento das instruções do procedimento quanto à distribuição das amostras e reagentes pode originar resultados falsos negativos. Em caso de erro do procedimento, deverá ser testada uma nova amostra do mesmo doente. 5. A contaminação de poços contendo amostras de doentes negativas por poços com controlos positivos ou amostras de pacientes é possível caso o conteúdo de um poço salpique outro poço devido a manipulação inábil da microplaca ou técnica incorrecta de pipetagem, durante a distribuição dos reagentes. 6

7 6. Os desempenhos do teste Platelia Aspergillus IgG não foram avaliados com amostras séricas ou plasmáticas de recém-nascidos ou de doentes pediátricos. 7. Os desempenhos do teste Platelia Aspergillus IgG não foram estabelecidos para uma leitura manual e/ou uma determinação visual dos resultados. 14 VALORES ESPERADOS A prevalência de IgG anti-aspergillus medida com a ajuda do teste Platelia Aspergillus IgG foi avaliada usando um painel de 129 amostras provenientes de 64 doentes franceses com mucoviscidose e risco de infecção por Aspergillus. Das 129 amostras, 53 eram positivas e 12 intermédias, para uma prevalência de 53/129 = 41,1% [IC a 95%: 32,5-50,1%] considerando os resultados intermédios como sendo negativos e 65/129 = 50,4% [IC a 95%: 41,4-59,3%] considerando os resultados intermédios como sendo positivos. Em relação aos doentes, dos 64 testados, 29 apresentaram pelo menos uma amostra positiva e 5 apresentaram pelo menos uma amostra intermédia e nenhuma amostra positiva, para uma prevalência de 29/64 = 45,3% [IC a 95%: 32,8-58,3%] considerando os resultados intermédios como sendo negativos e 34/64 = 53,1% [IC a 95%: 40,2-65,7%] considerando os resultados intermédios como sendo positivos. 15 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO A. Estudos de reprodutibilidade Precisão intra-ensaio (repetibilidade): Para avaliar a repetibilidade intra-ensaio, testaram-se uma amostra negativa e cinco amostras positivas 32 vezes para uma determinada série. Foi determinado o título, em UA/ml, para cada amostra. A média dos títulos, o desvio-padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV%) para cada amostra são apresentados na tabela seguinte: Precisão intra-ensaio (repetibilidade) N = 32 negativa n.º 1 n.º 2 n.º 3 positiva média positiva forte Média 2,44 9,31 10,31 13,64 31,69 43,10 (UA/ml) DP 0,067 0,320 0,218 0,387 0,939 1,546 CV% 2,7% 3,4% 2,1% 2,8% 3,0% 3,6% Precisão inter-ensaio (reprodutibilidade): Para avaliar a reprodutibilidade inter-ensaio, cada uma das seis amostras (uma negativa e cinco positivas) foi testada em duplicado, em duas séries por dia, ao longo de um período total de 20 dias. Foi determinado o título, em UA/ml, para cada amostra positiva. A amostra negativa é expressada sob a forma de uma razão. A média das concentrações ou razões, o desvio-padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV%) para cada amostra são apresentados na tabela seguinte: Precisão inter-ensaio (reprodutibilidade) N = 80 negativa n.º 1 Média n.º 2 n.º 3 positiva média positiva forte 1,88 3,60 6,99 12,34 32,49 51,65 (UA/ml) DP 0,26 0,46 0,92 1,49 5,25 7,65 CV% 13,8% 12,8% 13,1% 12,1% 16,2% 14,8% B. Reacções cruzadas Patologia Número de amostras testadas Número de amostras positivas Anticorpos anti-candida 54 2* Anticorpos anti-ds-dna 10 0 ANA-positivos 10 0 IgG de mieloma 10 0 IgG de toxoplasma 10 0 Anticorpos antimurinos humanos 12 0 VIH 10 0 Factor reumatóide 10 0 * Os dois soros que apresentaram resultados positivos no teste foram confirmados com um kit comercial para a detecção de anticorpos IgG anti-aspergillus. 7

8 C. Linearidade O intervalo dinâmico linear da dosagem de Platelia Aspergillus IgG foi estabelecido entre 2 e 80 UA/ml utilizando estudos de diluição realizados em 5 amostras positivas. D. Estudos clínicos As características do desempenho do kit Platelia Aspergillus IgG foram avaliadas em 2 locais num total de 499 amostras de 329 doentes. SENSIBILIDADE A sensibilidade foi determinada utilizando um painel de 277 amostras de 2 locais situados em França, divididos da seguinte forma: No local 1, testaram-se 129 soros de 64 doentes com mucoviscidose e risco elevado de aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA). No local 2, testaram-se 148 soros de 43 doentes com aspergilose grave, crónica. Resultados para o local 1 A tabela a seguir resume os resultados obtidos no local 1 para uma população de doentes com mucoviscidose e para os quais o diagnóstico de ABPA foi feito com base nos dados clínicos, sendo os resultados obtidos para IgE total, electrosinerese de Aspergillus, detecção de antigénios de Aspergillus e detecção de anticorpos IgG anti-aspergillus com um teste EIA disponível no mercado que não o Platelia Aspergillus IgG. Os doentes foram classificados em 4 categorias: ausência de ABPA, ABPA anterior, suspeita de ABPA e ABPA confirmada 9, 11. A ausência de ABPA, no entanto, não exclui outras patologias provocadas por Aspergillus 12. O estado do doente, determinado com electrosinerese de Aspergillus ou Platelia Aspergillus IgG, foi considerado como sendo positivo quando pelo menos uma das amostras do doente tivesse um resultado positivo no teste com o método correspondente. De outra forma, o estado foi considerado como sendo intermédio se pelo menos uma das amostras do doente tivesse um resultado intermédio e foi considerado como negativo se todas as amostras do doente tivessem resultado negativo no teste. Categorias de doentes 49 doentes sem ABPA 5 doentes com ABPA anterior 4 doentes com suspeita de ABPA 6 doentes com ABPA confirmada Resultados de Resultados de Platelia TM Aspergillus IgG electrosinerese Estado do doente Número de (doentes (doentes intermédios Estado intermédios doentes Positivo Intermédio Negativo positivos) negativos) 7/40 (17,5%) 95% 11/40 (27,5%) 95% Negativo 40 7 (1) 4 (2) 29 IC [7,3-32,8%] IC [14,6-43,9%] Positivo /9 (88,9%)* 9/9 (100,0%)* Negativo 5 5 (3) 0 0 5/5 (100,0%)* 5/5 (100,0%)* Positivo Negativo 2 2 (4) 0 0 2/2 (100,0%)* 2/2 (100,0%)* Positivo /2 (100,0%)* 2/2 (100,0%)* Negativo 3 2 (5) 0 1 2/3 (66,7%) 2/3 (66,7%) Positivo /3 (100,0%)* 3/3 (100,0%)* (1): 57% (4/7) dos resultados positivos com Platelia Aspergillus IgG tiveram um resultado positivo no teste com outro kit EIA disponível no mercado para a detecção de IgG anti-aspergillus. (2): 100% (4/4) dos resultados intermédios com Platelia Aspergillus IgG tiveram um resultado negativo no teste com outro kit EIA disponível no mercado para a detecção de IgG anti-aspergillus. (3): 100% (5/5) dos resultados positivos com Platelia Aspergillus IgG tiveram um resultado positivo no teste com outro kit EIA disponível no mercado para a detecção de IgG anti-aspergillus. (4): 100% (2/2) dos resultados positivos com Platelia Aspergillus IgG tiveram um resultado positivo no teste com outro kit EIA disponível no mercado para a detecção de IgG anti-aspergillus. (5): 100% (2/2) dos resultados positivos com Platelia Aspergillus IgG tiveram um resultado positivo no teste com outro kit EIA disponível no mercado para a detecção de IgG anti-aspergillus. *: O intervalo de confiança a 95% não pôde ser calculado devido ao tamanho insuficiente da amostra. Resultados para o local 2 A tabela a seguir resume os resultados obtidos com uma população de amostra de doentes que sofrem de aspergilose crónica grave recrutados com base em imagiologia pulmonar compatível, culturas de expectoração positivas para Aspergillus e testes serológicos positivos para Aspergillus utilizando imunoelectroforese (IEP). 8

9 Resultados por amostra Categorias de doentes Resultados de IEP Estado Resultados de Platelia TM Aspergillus IgG Estado do doente Número de amostras Positivo Intermédio Negativo (doentes intermédios negativos) (doentes intermédios positivos) Aspergilose crónica grave Positivo Intermédio Negativo ,3% 95% IC [90,8-99,0] 68,2% 95% IC [45,1-86,1] 35,3% 95% IC [14,2-61,7] 99,1% 95% IC [95,0-100] 86,4% 95% IC [65,1-97,1] 64,7% 95% IC [38,3-85,8] Resultados por doente O estado do doente, determinado com imunoelectroforese de Aspergillus ou Platelia Aspergillus IgG, foi considerado como sendo positivo quando pelo menos uma das amostras tivesse um resultado positivo no teste com o método correspondente. Caso contrário, o estado foi considerado como sendo intermédio se pelo menos uma das amostras do doente tivesse um resultado intermédio e foi considerado negativo se todas as amostras do doente tivessem resultado negativo no teste. Categorias de doentes Resultados de IEP Estado Estado do doente Número de doentes Positivo Intermédio Negativo Resultados de Platelia TM Aspergillus IgG (doentes intermédios negativos) (doentes intermédios positivos) Aspergilose crónica Positivo ,0% 95% IC [83,1-99,4] 97,5% 95% IC [86,8-99,9] grave Negativo ,3% 66,7% *: O intervalo de confiança a 95% não pôde ser calculado devido ao tamanho insuficiente da amostra. ESPECIFICIDADE A especificidade foi determinada utilizando um painel de 222 amostras de 222 doentes hospitalizados no local 1 (200 amostras e no local 2 (22 amostras) e que não apresentavam sintomas de infecção por Aspergillus População testada / local Número de amostras Negativo Intermédio Positivo (doentes intermédios considerados como positivos) (doentes intermédios considerados como negativos) Local Local Total ,5% 95% IC [97,2-100% 95% IC [84,6-99,6% 95% IC [97,5-100% 95% IC [98,2-100% 95% IC [84,6-100% 95% IC [98,3-9

10 16- REFERENCIAS 1. Agarwal, R Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3): p Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A Aspergillus hypersensitivity and allergic bronchopulmonary aspergillosis in patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in North India. Mycoses Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis, M., Casimiro, C., Exposto, F Follow-up of anti-aspergillus IgG and IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical laboratory analysis 16: p Denning, D. W Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical microbiology and infection 7 (Suppl 2): p Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta, C Comparison of serum markers for allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone, P., Farina, C., Castelnuovo, P Paranasal sinus fungus ball: diagnosis and management. Mycoses 50: p Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M., Latgé, J.P Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic microbiology and infectious disease 55: p Schubert, M. S Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis and management. Medical Mycology p Shah, A Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders. Indian journal of Chest disease and allied sciences 50: p Shah, R., Vaidesswar, P., Pandit, S. P Pathlogy of pulmonary aspergillomas. Indian journal of pathology and microbiology 51 (3): p Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M Diagnosing allergic bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic fibrosis, Paediatric Respiratory Reviews 10: p Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy 60: p Virnig, C., Bush, R. K Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US perspective. Current opinion in Pulmonary Medicine 13: p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) Fax: +33 (0) /