PLATELIA Candida Ab Plus 96 TESTES DETECÇÃO DOS ANTICORPOS CANDIDA ANTIMANANO NO SORO OU NO PLASMA HUMANOS PELO MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO

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1 PLATELIA Candida Ab Plus 96 TESTES DETECÇÃO DOS ANTICORPOS CANDIDA ANTIMANANO NO SORO OU NO PLASMA HUMANOS PELO MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO 1- UTILIZAÇÃO PREVISTA Platelia Candida Ab Plus é um ensaio imunoenzimático do tipo indirecto em microplaca para a detecção dos anticorpos lg totais antimanano no soro ou no plasma humanos. 2- INDICAÇÕES DE UTILIZAÇÃO O diagnóstico da candidíase invasiva deve basear-se na combinação da detecção de anticorpos com a detecção de antigénios circulantes. 13 Platelia Candida Ab Plus (Código 62785) é um ensaio que, quando utilizado em associação com o kit Platelia Candida Ag Plus (Código 62784), contribui para melhorar a precocidade e a sensibilidade deste diagnóstico no âmbito de um processo de diagnóstico completo integrando os dados clínicos, micológicos e os factores de risco intrínsecos e iatrogénicos 10, 13, 14. Esta combinação faz igualmente parte integrante da lógica de um sistema de monitorização do paciente a nível clínico e laboratorial, como coadjuvante na tomada de decisões quanto ao tratamento RESUMO E FUNDAMENTO As infecções por Candida constituem a forma mais frequente de infecções nosocomiais fúngicas, representando as 12, 15, 16 candidémias a quarta causa de septicemia de origem nosocomial. Do ponto de vista clínico, as candidíases invasivas são as formas mais graves, com taxas de mortalidade variando entre os 30 e 70% nos indivíduos imunodeprimidos. O seu diagnóstico continua difícil de estabelecer, devido à baixa especificidade dos sintomas clínicos e da baixa sensibilidade da hemocultura. Muito frequentemente, é um conjunto de argumentos que permite a evocação de uma candidíase invasiva e a instauração de um tratamento adequado 2. Neste contexto, o diagnóstico das candidíases sistémicas deve, imperativamente, associar as técnicas serológicas aos métodos micológicos directos. A monitorização serológica dos anticorpos anti-candida permite orientar ou reforçar o diagnóstico, complementando os resultados micológicos 10, 13, 14. Platelia Candida Ab Plus detecta os anticorpos dirigidos contra o antigénio manano de Candida, principal componente da parede celular das leveduras pertencentes ao género Candida. O manano, bio-marcador das candidíases, é um polissacarídeo altamente imunogénico. O seguimento regular dos pacientes sob risco de candidíase invasiva, combinando a detecção do antigénio manano e de anticorpos antimanano, constitui um instrumento de auxílio ao diagnóstico destas infecções PRINCÍPIO DO PROCEDIMENTO Platelia Candida Ab Plus é um ensaio imunoenzimático indirecto em dois passos, em microplaca, que permite a detecção dos anticorpos antimanano no soro ou no plasma humanos. As amostras de soro ou de plasma diluídas são pipetadas para poços da microplaca sensibilizados com antigénio manano de Candida albicans purificado. Após a incubação a 37 ºC, as tiras são lavadas para remover todo o material não ligado. O conjugado (anticorpo policlonal de cabra anti-igg/iga/igm humanas marcado com peroxidase) é adicionado em cada poço da microplaca e incubado a 37 ºC. Na presença do anticorpo antimanano na amostra humana, forma-se um complexo: manano lg humana antimanano - Ac de cabra anti-igg/iga/igm humanas/peroxidase. As tiras são lavadas para remover todo o material não ligado. A adição de cromogénio contendo o substrato da peroxidase e incubado à temperatura ambiente permite a revelação dos complexos eventualmente formados. A reacção enzimática é parada mediante a adição de ácido sulfúrico 1N. A leitura da densidade óptica efectua-se com um espectrofotómetro regulado a 450/620 nm. 5- REAGENTES Os reagentes são fornecidos em quantidade suficiente para realizar 96 determinações em 9 séries, no máximo. Conserve o kit a +2-8 ºC. É imprescindível deixar que todos os reagentes atinjam a temperatura ambiente ( ºC) antes de serem utilizados. Volte a guardar todos os reagentes a +2-8 ºC imediatamente após a sua utilização. Guarde novamente as tiras não utilizadas na bolsa original e feche-a cuidadosamente. Não retire o excicante. 1

2 Componente Conteúdo Quantidade R1 R2 Microplate Concentrated Washing Solution (20x) R3 Calibrator 0 R4a Calibrator 5 R4b Calibrator 10 R4c Calibrator 20 R4d Calibrator 80 R6 R7a R7b R9 Conjugate Sample Diluent 1 Sample Diluent 2 Chromogen TMB Microplaca: - 96 poços (12 tiras com 8 poços cada) sensibilizados com 1 manano purificado a partir de Candida albicans. Solução de lavagem concentrada (20 x): - Tampão TRIS-NaCl (ph 7,4) 1 x 70 ml - Tween 20 a 2% - Conservante: < 1,5% ProClin 300 Calibrador 0 UA/ml (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl 1 x 2,5 ml - Conservante: metilisotiazolinona 0,02%, bromonitrodexano 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Calibrador 5 UA/ml (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl - Soro humano contendo lg antimanano 1 x 2,5 ml - Conservante: metilisotiazolinona 0,02%, bromonitrodexano 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Calibrador 10 UA/ml (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl - Soro humano contendo lg antimanano 1 x 2,5 ml - Conservante: metilisotiazolinona 0,02%, bromonitrodexano 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Calibrador 20 UA/ml (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl - Soro humano contendo lg antimanano 1 x 2,5 ml - Conservante: metilisotiazolinona 0,02%, bromonitrodexano 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Calibrador 80 UA/ml (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl - Soro humano contendo lg antimanano 1 x 2,5 ml - Conservante: metilisotiazolinona 0,02%, bromonitrodexano 0,02%, < 1,5% ProClin 300 Conjugado (pronto a usar): - Anticorpo policlonal de cabra anti-lg humanas, marcado com peroxidase 1 x 26 ml - Verde malaquita - Conservante: <1,5% ProClin 300 Diluente de amostras 1 (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl, - Tween 20 a 0,1% 1 x 28 ml - Vermelho de fenol, - Conservante: <1,5% ProClin 300 Diluente de amostras 2 (pronto a usar): - Tampão Tris NaCl, - Tween 20 a 0,1% 1 x 26 ml - Azul de bromotimol, - Conservante: <1,5% ProClin 300 Solução TMB cromogénica (pronta a usar): - Solução de 3,3,5,5 -tetrametilbenzidina (<0,1%), H 2 O 2 (<1,0%) 1 x 28 ml R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta a usar): - Solução de ácido sulfúrico 1N 1 x 28 ml Películas adesivas 4 6- ADVERTÊNCIAS PARA OS UTILIZADORES 1. Somente para utilização em diagnóstico in vitro. 2. Reservado unicamente a profissionais. 3. A utilização deste kit com amostras que não sejam de soro ou plasma não é recomendada. 4. Os calibradores R4a, R4b, R4c, e R4d são preparados a partir de soro humano que foi testado e considerado negativo para anticorpos anti-vih-1, anti-vih-2 e anti-vhc, assim como para antigénio HBs em testes com marcação CE. No entanto, todos os reagentes devem ser manipulados como se fossem potencialmente infecciosos. 2

3 Todos os ensaios devem ser executados segundo a norma OSHA relativa a agentes patogénicos transmitidos por via hematogénica, nível 2 de segurança biológica ou de acordo com outras práticas de segurança biológica adequadas. 5. Usar vestuário de protecção, incluindo uma bata de laboratório, protecção ocular e do rosto, assim como luvas descartáveis (recomendam-se as luvas em material sintético sem latex) e manipular os reagentes do kit, assim como as amostras dos pacientes, segundo as Boas Práticas de Laboratório (BPL) exigidas. Lavar minuciosamente as mãos após a realização do ensaio. 6. Não pipetar com a boca. 7. Não fumar, beber ou comer nas áreas de manipulação das amostras ou dos reagentes do kit. 8. Evitar os salpicos de amostras ou de soluções. 9. As superfícies manchadas por um líquido contaminante que não contenha ácido devem ser limpas cuidadosamente com um desinfectante eficaz. Os desinfectantes que podem ser utilizados são (mas não se limitam a) uma solução de lixívia diluída a 10% (solução a 0,5% de hipoclorito de sódio), de etanol a 70% ou de Westcodyne Plus a 0,5%. O material utilizado na limpeza deverá ser eliminado num contentor especial para resíduos contaminados. ATENÇÃO: Nunca colocar soluções contendo lixívia na autoclave. 10. Se o líquido contaminante for um ácido, as superfícies manchadas devem ser limpas ou neutralizadas com bicarbonato de sódio e a zona deve ser enxaguada e seca; no caso em que o líquido contaminante contenha material biologicamente perigoso, lavar a zona com um desinfectante químico. 11. Eliminar todas as amostras e reagentes utilizados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. A eliminação dos resíduos químicos e biológicos perigosos deve realizar-se de acordo com as normas em vigor. 12. ATENÇÃO: apresenta-se seguidamente uma lista dos potenciais riscos químicos apresentados por determinados componentes do kit (consultar o capítulo 5 -REAGENTES) Alguns reagentes contêm ProClin 300 < 1.5%: R43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele S : Não respirar os vapores/aerossóis. Evitar o contacto com a pele. Usar luvas adequadas. Este produto e o seu recipiente devem ser eliminados como resíduos perigosos. Xi - Irritante 13. A ficha de dados de segurança (FDS) está disponível a pedido. 7- PRECAUÇÕES PARA OS UTILIZADORES 1. AMOSTRAS DE SORO OU PLASMA CONGELADAS CONSERVADAS EM CONDIÇÕES DESCONHECIDAS PODEM FORNECER RESULTADOS FALSOS POSITIVOS DEVIDO À CONTAMINAÇÃO POR FUNGOS E/OU BACTÉRIAS. 2. Não utilizar nenhum kit nem reagentes do kit após a expiração da data de validade. 3. Não misturar nem associar, no decurso da mesma série, reagentes provenientes de bolsas com números de lotes diferentes. NOTA: é possível utilizar outros lotes de Solução de Lavagem (R2, identificada* por 20x a verde), Cromogénica (R9, identificado* por TMB a azul-turquesa) e de Solução de Paragem (R10, identificada* por 1N a vermelho) diferentes dos fornecidos com a bolsa, na condição de se utilizarem reagentes rigorosamente equivalentes de um único lote no decurso da mesma série. NOTA: a Solução de Lavagem (R2 identificada* por 20X a verde) não pode ser misturada com a Solução de Lavagem (R2 identificada* por 10X a azul) fornecida nos kits de reagentes Bio-Rad. * na etiqueta do frasco 4. Antes da utilização, aguardar 30 minutos até que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18 a +30 ºC). 5. Utilizar, de preferência, material descartável. Na sua falta, utilizar vidros perfeitamente lavados e enxaguados com água destilada. 6. Verificar a precisão das pipetas e o bom funcionamento dos aparelhos utilizados. 7. Reconstituir cuidadosamente o reagente R2, evitando toda e qualquer contaminação. 8. A reacção enzimática é muito sensível a todos os metais ou iões metálicos. Por conseguinte, nenhum elemento metálico pode entrar em contacto com as diferentes soluções contendo o conjugado ou a solução de substrato. 9. Durante a pipetagem dos calibradores e das amostras, utilizar um cone de distribuição novo para cada soro, de modo a evitar toda e qualquer contaminação. 10. De modo a garantir a lavagem adequada dos poços, respeitar o número de ciclos de lavagem recomendado e certificar-se de que todos os poços são completamente cheios e, em seguida, completamente esvaziados. A lavagem deve realizar-se com um sistema de lavagem de microplacas. 11. Não permitir que a microplaca seque entre o fim do ciclo de lavagem e a adição dos reagentes. 12. Não utilizar o mesmo recipiente para o conjugado e a solução de revelação. 13. Evitar expor a solução cromogénica ou a solução de revelação a luz intensa durante a conservação ou a incubação. Não permitir que as soluções contendo o cromogénio entrem em contacto com agentes oxidantes. 14. O Cromogénio (R9) deve ser incolor. O aparecimento de uma coloração azul indica que o reagente está inutilizável e deve ser substituído. 15. Evitar que a solução de paragem entre em contacto com todo e qualquer agente oxidante, metal ou iões metálicos. 16. Não deitar de novo no frasco original o excedente de conjugado não distribuído. 3

4 8- PREPARAÇÃO E CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES Microplaca (R1) Os suportes, cada um com 12 tiras, estão embalados em bolsas. Corte a bolsa com uma tesoura, logo abaixo da soldadura. Abra a bolsa e retire o suporte. Coloque novamente o suporte com as tiras não utilizadas na bolsa original. Feche cuidadosamente a bolsa e coloque-a novamente a +2-8 ºC. Após a abertura da bolsa sob vácuo, as tiras conservadas a +2-8 ºC na sua bolsa original, cuidadosamente fechada, são estáveis durante 8 semanas. Controle a presença de excicante. Solução de lavagem (R2) Prepare a solução de lavagem, diluindo 20 vezes a solução de lavagem concentrada em água destilada: 50 ml de R2 em 950 ml de água destilada. (Preveja 650 ml de solução de lavagem diluída para uma placa inteira de 12 tiras, para além do volume morto devido aos aparelhos utilizados). Após a diluição, a solução de lavagem pode ser conservada durante 14 dias a ºC. Depois de aberta, a solução de lavagem concentrada, conservada a ºC e na ausência de contaminação, é estável até à data de expiração indicada no rótulo. Calibrador 0 (R3), Calibrador 5 (R4a), calibrador 10 (R4b), Calibrador 20 (R4c), Calibrador 80 (R4d): Os calibradores estão prontos a usar. Após a abertura, estes reagentes, conservados a +2-8 ºC e na ausência de contaminação, são estáveis durante 8 semanas. Conjugado (R6), Diluente de amostras 1 (R7a), Diluente de amostras 2 (R7b), Solução TMB cromogénica (R9): Estes reagentes estão prontos a usar. Após a abertura, estes reagentes, conservados a +2-8 ºC e na ausência de contaminação, são estáveis durante 8 semanas. Solução de paragem (R10): Este reagente está pronto a usar. Após a abertura, este reagente, conservado a +2-8 ºC e na ausência de contaminação, é estável até à data de validade indicada no rótulo. 9- AMOSTRAS 1. Os ensaios são efectuados em amostras de soro ou de plasma colhidas sobre anticoagulante do tipo EDTA, heparina ou citrato. 2. Respeite as advertências seguintes para a colheita, tratamento e conservação destas amostras de sangue: Colha uma amostra de sangue de acordo com os procedimentos habituais. Nos soros, permita que o coágulo fique completamente formado antes da centrifugação. Mantenha os tubos fechados. Após a centrifugação, extraia o soro ou o plasma e conserve-o num tubo fechado. As amostras podem ser conservadas a +2-8 C, se o teste for efectuado dentro de 4 dias. Se o teste não tiver lugar nos 4 dias seguintes, as amostras devem ser congeladas a -20 C (ou -80 C). Recomenda-se não proceder a mais de três ciclos de congelação / descongelação. As amostras devem ser cuidadosamente homogeneizadas (Vortex) após a descongelação, antes de serem testadas. 3. Os resultados não são afectados por amostras que contenham 60 g/l de albumina humana, 120 g/l em proteínas totais, 200 mg/l de bilirrubina não conjugada ou 200 mg/l de bilirrubina conjugada, amostras lipémicas contendo o equivalente a 30 g/l de trioleína (triglicérido) ou 5 g/l de colesterol ou amostras hemolisadas contendo 2 g/l de hemoglobina. 4. Não aquecer as amostras. 10- PROCEDIMENTO Materiais fornecidos Consulte o capítulo 5-REAGENTES Materiais necessários não fornecidos 1. Água destilada ou desionizada esterilizada, para a diluição da solução de lavagem concentrada. 2. Papel absorvente. 3. Luvas descartáveis. 4. Óculos de protecção. 5. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. 6. Pipetas ou multipipetas, automáticas ou semi-automáticas, reguláveis ou fixas, com capacidade de medição e distribuição de 10 μl a 1000 μl, 1 ml, 2 ml e 10 ml. 7. Provetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml. 8. Tubos descartáveis 9. Recipiente para resíduos contaminados. 10. Agitador do tipo Vortex. 11. Incubadora de microplacas a 37 C ± 1 C (*). 12. Sistema de lavagem de microplacas semi-automático ou automático (*). 4

5 13. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 e 620 nm (*). (*) É favor consultar-nos para informações precisas relativamente aos aparelhos aprovados pelos nossos serviços técnicos. Procedimento EIA (imunoenzimático) Cumpra rigorosamente o protocolo proposto. Cumpra as Boas Práticas Laboratoriais: É imprescindível permitir que os reagentes alcancem a temperatura ambiente (18-30 C) durante, pelo menos, 30 minutos antes de os utilizar. Utilize todos os calibradores de cada vez que executar a dosagem, para validar a qualidade do teste. Proceda da seguinte forma: 1. Defina cuidadosamente o plano de distribuição e de identificação dos calibradores e das amostras. 2. Pré-dilua extemporaneamente as amostras a testar: a 1/20, ou seja, 10 μl de soro ou de plasma μl de diluente de amostras 1 (R7a). A pré-diluição da amostra apresenta uma coloração vermelha escura. 3. Retire o suporte e as tiras (R1) da embalagem de protecção. Guarde novamente as tiras não utilizadas na embalagem e feche esta última. 4. Pipete 190 μl de diluente de amostras 2 (R7b) nos poços destinados a receber as amostras a testar e adicione aí 10 μl das amostras pré-diluídas a 1/20, misturando delicadamente mediante reaspiração por 2 ou 3 vezes. NB: a distribuição das amostras pode ser controlada nesta fase da manipulação; com efeito, após a adição de 10 μl de amostras pré-diluídas, as cúpulas contendo amostras adquirem uma coloração castanha. Uma cúpula que não contenha amostra apresenta uma coloração verde. 5. Distribua os calibradores prontos a usar à razão de 200 μl por poço, de acordo com o plano seguinte: - A1: Calibrador 0 UA/ml (R3) - B1: Calibrador 5 UA/ml (R4a) - C1: Calibrador 10 UA/ml (R4b) - D1: Calibrador 20 UA/ml (R4c) - E1: Calibrador 80 UA/ml (R4d) A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Cubra a microplaca com película adesiva, certificando-se de que toda a superfície está coberta e estanque. 7. Incube imediatamente a microplaca numa incubadora de microplacas seca durante 60 ± 5 minutos a 37 C (± 1 C). 8. Prepare a solução de lavagem diluída (consulte o capítulo 8). 9. Retire a película adesiva da placa. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos contaminados (contendo hipoclorito de sódio). 10. Lave a microplaca 4 vezes com um sistema de lavagem de microplacas com 800 μl de solução de lavagem diluída. Após a última lavagem, inverta a microplaca e bata-a suavemente sobre papel absorvente para eliminar o líquido remanescente. 11. Homogenize o conteúdo do frasco R6 por inversão antes da utilização. Em caso de utilização de uma pipeta multicanais, não tome senão o volume necessário à realização da série: preveja 3,5 ml para duas tiras de 8 cúpulas. 12. Distribua 200 μl de conjugado R6 em cada poço. 13. Cubra a microplaca com película adesiva, certificando-se de que toda a superfície está coberta e estanque. 14. Incube a microplaca numa incubadora de microplacas seca durante 60 ± 5 minutos a 37 C (± 1 C). 15. Retire a película adesiva da placa. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos contaminados (contendo hipoclorito de sódio). 16. Lave a microplaca 4 vezes com um sistema de lavagem de microplacas com 800 μl de solução de lavagem diluída. Após a última lavagem, inverta a microplaca e bata-a suavemente sobre papel absorvente para eliminar o líquido remanescente. 17. Distribua, rapidamente e ao abrigo da luz forte, 200 μl da solução cromogénica TMB (R9) em cada poço. 18. Incube a microplaca no escuro à temperatura ambiente ( ºC) durante 30 ± 5 minutos. Não utilize película adesiva durante esta fase da incubação. 19. Adicione 100 μl de solução de paragem (R10) a cada poço, utilizando a mesma sequência e o mesmo ritmo que na adição da solução de revelação. Misture bem. 20. Limpe muito bem o avesso das placas. 21. Leia a densidade óptica de cada poço a 450 nm (filtro de referência de 620 nm) nos 30 minutos seguintes à adição da solução de paragem (devendo-se continuar a manter as tiras ao abrigo da luz antes da leitura). 22. Antes da transcrição dos resultados, certifique-se da concordância entre a leitura e o plano de distribuição das placas. 5

6 11- CONTROLO DE QUALIDADE (CRITÉRIOS DE VALIDADE) Utilize os calibradores em cada microplaca e em cada ensaio. Devem ser cumpridos os seguintes critérios para validar o ensaio: Valores da densidade óptica: DO R4a > 0,160 Razões: Razão DO R4a/ DO R3 > 6,00 Razão DO R4b/ DO R4a > 1,20 Razão DO R4c/ DO R4b > 1,20 Razão DO R4d/ DO R4c > 1, INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Construção da curva de calibração A curva de calibração é determinada com os 5 pontos de escala (calibradores) 0, 5, 10, 20 e 80 UA/ml. Trace a curva de calibração [DO = função (UA/ml)], registando no eixo vertical (eixo Y) as DO dos calibradores R3, R4a, R4b, R4c e R4d, e, em seguida, registando no eixo horizontal (eixo X) a sua respectiva concentração em UA/ml. Opte por um traçado ponto a ponto ligando os diferentes pontos de escala. Determinação da concentração em anticorpos antimanano (UA/ml) nas amostras testadas Com base na curva traçada anteriormente, é possível determinar, para cada uma das amostras testadas, a concentração em anticorpos antimanano, expressa em UA/ml. Interpretação dos resultados As amostras cujas concentrações são inferiores a 5 UA/ml (C < 5) são consideradas "negativas" quanto à presença de anticorpos antimanano. As amostras cujas concentrações estão compreendidas entre 5 e 10 UA/ml (5 C < 10) são consideradas "intermédias" quanto à presença de anticorpos antimanano. As amostras cujas concentrações são iguais ou superiores a 10 UA/ml (C 10) são consideradas "positivas" quanto à presença de anticorpos antimanano. Os calibradores utilizados para traçar a curva de calibração não permitem uma titulação das concentrações superiores a 80 UA/ml. É conveniente recomeçar o teste após ter efectuado uma pré-diluição suplementar do soro ou do plasma, diluindo 1 (R7a) a 1/10. Após esta primeira pré-diluição, seguir o procedimento referido no capítulo 10 (pré-diluição a 1/20 em R7a, seguida de diluição a 1/20 em R7b). A concentração da amostra com resultado fortemente positivo será calculada multiplicando a concentração assim obtida pelo factor 10. Um resultado «intermédio» poderá ser confirmado através de uma nova amostra do paciente colhida nas semanas seguintes à data da colheita que tenha fornecido uma concentração intermédia. 13- LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1. Um resultado negativo não permite excluir um diagnóstico de candidíase invasiva. A interpretação da ausência de anticorpos é difícil nos pacientes cujo sistema imunitário está alterado. O diagnóstico de candidíase invasiva não pode ser confirmado senão após a confrontação dos argumentos clínicos, terapêuticos, radiológicos, citológicos, micológicos directos e serológicos, devendo cada elemento tomado isoladamente ser interpretado com ponderação. 2. Um teste negativo quanto à presença de anticorpos antimanano deve, igualmente, ser confrontado com o resultado da detecção do antigénio manano: mesmo em caso de candidíase invasiva, o antigénio é detectado com maior dificuldade nos pacientes positivos em anticorpos antimanano (consulte o parágrafo 15-Características de desempenho específicas). 3. O desempenho da detecção de anticorpos antimanano nos soros ou plasmas está relacionado com a frequência de testes efectuados nos pacientes. A monitorização regular dos pacientes de alto risco e o rastreio do antigénio manano são recomendados, a fim de aumentar a sensibilidade e a positividade precoce do teste. 4. O procedimento e a interpretação dos resultados descritos para o teste Platelia Candida Ab Plus devem ser respeitados durante o ensaio de amostra quanto à presença de anticorpos antimanano. Aconselha-se aos utilizadores do kit a leitura cuidadosa da respectiva bula, antes de efectuarem o teste. O procedimento deve ser rigorosamente seguido, em particular, no que diz respeito à pipetagem das amostras e dos reagentes, à lavagem das microplacas e à duração das etapas de incubação. 5. O não cumprimento das instruções do procedimento quanto à distribuição das amostras ou reagentes pode originar resultados falsos negativos. A repetição do teste com nova amostra do paciente deve ser considerada quando há suspeita clínica de candidíase invasiva ou erro de procedimento. 6. A contaminação de poços com amostras de pacientes negativos por poços contendo os controlos positivos ou as amostras de pacientes é possível, caso o conteúdo de um poço salpique outro poço devido a manipulação violenta da microplaca ou fraca técnica de pipetagem, durante a distribuição dos reagentes. 7. O desempenho de Platelia Candida Ab Plus não foi avaliado com amostras de soro ou de plasma provenientes de recém-nascidos ou pacientes pediátricos. 6

7 8. O desempenho de Platelia Candida Ab Plus não foi preparado para uma leitura manual e/ou uma determinação visual dos resultados. 9. Foram observados resultados falsos positivos em amostras contendo uma taxa de gamaglobulinas humanas 60 g/l, assim como em determinadas amostras com resultados de teste positivos em factor reumatóide ou positivos em anticorpos anti-dsdna devido à presença da lgg anti-aspergillus. 14- VALORES ESPERADOS A prevalência dos anticorpos dirigidos contra o antigénio manano específico de Candida determinada através do teste Platelia Candida Ab Plus foi avaliada num painel de 613 amostras provenientes de 51 pacientes holandeses (Local 1 Países Baixos) hospitalizados para tratamento de cancro (hemopatia maligna para 49 pacientes e cancro não hematológico em 2 pacientes) mediante quimioterapia intensiva. Das 613 amostras, 114 revelaram-se positivas e 136 intermédias, ou seja, uma prevalência de 114/613 = 18,6 % [IC 95%: 15,6-21,9%], tendo em consideração os resultados intermédios como negativos, e 250/613 = 40,8 % [IC 95%: 36,9-44,8%], considerando os resultados intermédios como positivos. Relativamente aos pacientes, dos 51 testados, 14 apresentaram, pelo menos, uma amostra positiva e 20 apresentaram, pelo menos, uma amostra intermédia sem qualquer positivo, ou seja, uma prevalência de 14/51 = 27,5 % [IC 95%: 15,9-41,7%], tendo em consideração os resultados intermédios como negativos, e 34/51 = 66,7 % [IC 95%: 52,1-79,2%], considerando os resultados intermédios como positivos. Destes 51 pacientes, 30 (388 amostras) não apresentam candidíase invasiva documentada. Entre estes, 20 estão colonizados por leveduras (12 por Candida albicans, 7 por Candida albicans associada a uma outra espécie de Candida e 1 colonizado por, pelo menos, uma espécie de Candida não albicans). Quatro destes pacientes apresentam sintomas clínicos e uma infecção superficial por Candida confirmada microbiologicamente. Estão presentes lesões severas das barreiras mucosas em 24 destes pacientes. Das 388 amostras correspondentes, 53 revelaram-se positivas e 95 intermédias, ou seja, uma prevalência de 53/388 = 13,7 % [IC 95%: 10,4-17,5%], tendo em consideração os resultados intermédios como negativos, e 148/388 = 38,1 % [IC 95%: 33,3-43,2%], considerando os resultados intermédios como positivos. Relativamente aos pacientes, dos 30 testados, 7 apresentaram, pelo menos, uma amostra positiva e 12 apresentaram, pelo menos, uma amostra intermédia sem qualquer positivo, ou seja, uma prevalência de 7/30 = 23,3 % [IC 95%: 9,9-42,3%], tendo em consideração os resultados intermédios como negativos, e 19/30 = 63,3 % [IC 95%: 43,9-80,1%], considerando os resultados intermédios como positivos. 15- CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICAS A. Estudos de reprodutibilidade Precisão intra-ensaio (repetibilidade): De modo a avaliar a repetibilidade intra-ensaio, foram testadas cinco amostras positivas e uma amostra negativa por 32 vezes na mesma série. Determinou-se a concentração em UA/ml para cada uma das amostras. No quadro seguinte, apresentam-se a média das concentrações, o desvio standard (DS) e o coeficiente de variação (CV%) para cada amostra: Precisão intra-ensaio (repetibilidade) N=32 Média das concentrações (UA/ml) Amostra Negativa positiva Nº 1 positiva Nº 2 positiva Nº 3 Amostra positiva média Amostra forte positiva 3,14 7,91 10,17 10,06 38,42 67,62 DS 0,123 0,547 0,424 0,464 3,836 4,070 CV% 3,9% 6,9% 4,2% 4,6% 10,0% 6,0% Precisão inter-ensaio (reprodutibilidade): A fim de avaliar a reprodutibilidade inter-ensaio, cada uma das seis amostras (uma negativa e cinco positivas) foi testada em duplicado, em duas séries por dia, por um período total de 20 dias. Determinou-se a concentração em UA/ml para cada uma das amostras. No quadro seguinte, apresentam-se a média das concentrações, o desvio standard (DS) e o coeficiente de variação (CV%) para cada amostra: Precisão inter-ensaio (reprodutibilidade): N=80 Média das concentrações (UA/ml) Amostra Negativa positiva Nº 1 positiva Nº 2 positiva Nº 3 Amostra positiva média Amostra forte positiva 3,54 8,16 11,51 11,42 31,54 62,58 SD 0,332 0,814 1,481 1,452 6,55 7,162 CV% 9,4% 10,0% 12,9% 12,7% 20,8% 11,4% 7

8 B. Reacções cruzadas Patologia Número de amostras testadas Número de positivos Número de intermédios Número de positivos confirmados em teste comercial Número de intermédios confirmados em teste comercial Anticorpos anti-aspergillus /12 12/30 Anticorpos anti-dsdna /2 0/2 ANA positivos NA 0/1 IgG/IgM Mieloma NA NA Anti-Toxoplasma lgg /1 1/1 Anticorpos humanos anti-ratos /1 0/1 Factor Reumatóide /5 1/4 As amostras cujos resultados obtidos foram positivos ou intermédios com o teste Platelia Candida Ab Plus foram, em seguida, testadas com um ensaio comercial concorrente para detecção de anticorpos anti-candida (composto por um teste de detecção das lgg anti-candida e por um teste de detecção das lgm anti-candida). C. Linearidade O âmbito de linearidade do teste Platelia Candida Ab Plus foi estabelecido entre 2 e 78 UA/ml, com base em estudos de diluições realizados em 5 amostras positivas. D. Estudos clínicos O desempenho do kit Platelia Candida Ab Plus foi avaliado em 3 locais, num total de 836 amostras provenientes de 489 pacientes. SENSIBILIDADE Determinou-se a sensibilidade do kit Platelia Candida Ab Plus com base num painel de 436 amostras provenientes de 89 pacientes hospitalizados em 2 locais situados nos Países Baixos e em França. As amostras repartem-se da seguinte forma: Local 1 (Países Baixos): 225 amostras provenientes de 21 pacientes holandeses admitidos num serviço de oncohematologia para tratamento de hemopatia maligna (19 casos) ou de cancro não hematológico (2 casos) por quimioterapia intensiva, acompanhada, conforme o caso, por um transplante de células estaminais hematopoiéticas. Todos estes pacientes apresentaram candidíase invasiva confirmada microbiologicamente com base em, pelo menos, uma cultura positiva a Candida (hemocultura ou cultura de colheita de tecidos normalmente estéril). 17 Local 2 (França): 211 amostras provenientes de 68 pacientes franceses hospitalizados em diferentes serviços de reanimação ou onco-hematologia e tendo uma candidíase invasiva confirmada microbiologicamente com base em, pelo menos, uma hemocultura positiva a Candida spp. NB: os painéis de amostras utilizados durante estes dois estudos são originários de pacientes cujas amostras de sangue foram colhidas entre 1999 e A estabilidade relativa do antigénio manano e do anticorpo antimanano nestas amostras durante o período de congelação, assim como após cada ciclo de congelação e descongelação, faz depender os resultados apresentados do estado de conservação do painel testado. Os valores de sensibilidade do teste determinados no âmbito de estudos clínicos retrospectivos podem, assim, ser inferiores aos obtidos através de estudos clínicos prospectivos, realizados com amostras colhidas muito recentemente. Resultados do Local 1 Os 21 pacientes holandeses incluídos neste estudo deram entrada no hospital para tratamento de uma hemopatia maligna (leucemia aguda mieloblástica, leucemia aguda linfoblástica, leucemia linfóide crónica, mieloma, síndrome mielodisplásica, anemia aplásica ou linfoma não hodgkiniano) ou de um cancro não hematológico por quimioterapia intensiva, seguida, eventualmente, de um transplante de células estaminais hematopoiéticas 17. Estes 21 pacientes desenvolveram uma candidíase invasiva confirmada microbiologicamente com base em, pelo menos, uma cultura positiva a Candida spp (hemocultura ou cultura de colheita de tecidos normalmente estéril). O estatuto destes pacientes, relativamente à presença de anticorpos dirigidos contra o antigénio manano específico de Candida, detectado com o teste Platelia Candida Ab Plus, é considerado positivo se pelo menos uma das amostras do paciente for positiva. Na ausência de uma amostra com resultado positivo, considera-se o estatuto como intermédio, se pelo menos uma das amostras do paciente for intermédia, e como negativo, quando todas as amostras do paciente são negativas. 17 Categorias de pacientes 21 pacientes (225 amostras) apresentando, pelo menos, uma cultura positiva a Candida spp. Resultados com Platelia Candida Ab Plus Número de pacientes (número de amostras) Intermédio negativos) considerados considerados Negativo positivos) Positivo 7 (61) 8 (41) 6 (123) 33,3 % 95% IC [14,6-57,0%] 71,4 % 95% IC [47,8-88,7%] 8

9 Paralelamente ao teste Platelia Candida Ab Plus, estas mesmas amostras foram testadas relativamente à presença do antigénio manano específico de Candida com o kit Platelia Candida Ag Plus 9. O estatuto do paciente relativamente à presença do antigénio manano ou de anticorpos antimanano específicos de Candida considera-se como positivo se pelo menos um dos dois testes é positivo. Na ausência de um teste positivo, considera-se o estatuto como intermédio, se pelo menos um dos dois testes for intermédio, e como negativo, quando os dois testes são negativos. Categorias de pacientes 21 pacientes (225 amostras) apresentando, pelo menos, uma cultura positiva a Candida spp. Combinação dos resultados em Platelia Candida Ab Plus e Platelia TM Candida Ag Plus Número de pacientes (número de amostras) Positivo Intermédio negativos) considerados considerados Negativo positivos) 15 (98) 4 (34) 2 (93) 71,4 % 95% IC [47,8-90,5%] 90,5 % 95% IC [69,9-98,8%] Resultados do Local 2 Os 68 pacientes franceses incluídos neste estudo deram entrada em diferentes serviços de reanimação (cirurgia, transplante, queimados, traumatologia, pneumologia, etc...) ou de onco-hematologia (hemopatia maligna). Todos desenvolveram candidíase invasiva confirmada microbiologicamente com base em, pelo menos, uma hemocultura positiva a Candida ( albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei ou tropicalis) 6, 7, 14 nos dias anteriores ou seguintes à colheita de sangue estudada. As amostras de sangue foram colhidas, em média, 6 dias após a primeira hemocultura positiva a Candida (no mínimo, 61 dias antes, no máximo, 67 dias depois). O estatuto destes pacientes relativamente à presença de anticorpos dirigidos contra o antigénio manano específico de Candida, detectado com o teste Platelia Candida Ab Plus, é considerado positivo se pelo menos uma das amostras do paciente for positiva. Na ausência de uma amostra com resultado positivo, considera-se o estatuto como intermédio, se pelo menos uma das amostras do paciente for intermédia, e como negativo, se todas as amostras do paciente forem negativas. Categorias de pacientes 68 pacientes (211 amostras) apresentando, pelo menos, uma hemocultura positiva a Candida spp. Resultados com Platelia Candida Ab Plus Número de pacientes (número de amostras) Intermédio considerados Positivo Negativo negativos) 30 (71) 13 (51) 25 (89) - dos quais, 34 a C. albicans (113 amostras) 17 (45) 6 (31) 11 (37) - dos quais, 15 a C. parapsilosis (37 amostras) 4 (5) 6 (15) 5 (17) - dos quais, 12 a C. glabrata (32 amostras) 7 (15) 1 (4) 4 (13) 44,1% 95% IC [32,1-56,7%] 50,0% 95% IC [32,4-67,6%] 26,7% 95% IC [7,8-55,1%] 58,3% 95% IC [27,7-84,8%] considerados positivos) 63,2% 95% IC [50,7-74,6%] 67,6% 95% IC [49,5-82,6%] 66,7% 95% IC [38,4-88,2%] 66,7% 95% IC [34,9-90,1%] - dos quais, 4 a C. tropicalis (19 amostras) 2 (6) 0 (1) 2 (12) 50,0% * 50,0% * - dos quais, 2 a C. krusei (8 amostras) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% * - dos quais, 1 a C. norvegensis (2 amostras) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% * *: Não foi possível calcular o intervalo de confiança de 95%, devido ao tamanho de amostra insuficiente. Paralelamente ao teste Platelia Candida Ab Plus, estas mesmas amostras foram testadas relativamente à presença do antigénio manano específico de Candida com o kit Platelia Candida Ag Plus. O estatuto do paciente relativamente à presença do antigénio manano ou de anticorpos antimanano específicos de Candida considera-se como positivo se pelo menos um dos dois testes é positivo. Na ausência de um teste positivo, considera-se o estatuto como intermédio, se pelo menos um dos dois testes for intermédio, e como negativo, quando os dois testes são negativos. 17 9

10 Categorias de pacientes 68 pacientes (211 amostras) apresentando, pelo menos, uma hemocultura positiva a Candida spp. Combinação dos resultados em Platelia Candida Ab Plus e Platelia TM Candida Ag Plus Número de pacientes (número de amostras) positivo Intermédio negativos) considerados considerados negativo positivos) 48 (122) 8 (40) 12 (49) - dos quais, 34 a C. albicans (113 amostras) 28 (74) 2 (22) 4 (17) - dos quais, 15 a C. parapsilosis (37 amostras) 5 (7) 6 (15) 4 (15) - dos quais, 12 a C. glabrata (32 amostras) 11 (24) 0 (3) 1 (5) 70,6% 95% IC [58,3-81,0%] 82,4% 95% IC [65,5-93,2%] 33,3% 95% IC [11,8-61,6%] 91,7% 95% IC [61,5-99,8%] 82,4% 95% IC [71,2-90,5%] 88,2% 95% IC [72,6-96,7%] 73,3% 95% IC [44,9-92,2%] 91,7% 95% IC [61,5-99,8%] - dos quais, 4 a C. tropicalis (19 amostras) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0% * 100,0% * - dos quais, 2 a C. krusei (8 amostras) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% * - dos quais, 1 a C. norvegensis (2 amostras) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% * *: Não foi possível calcular o intervalo de confiança de 95%, devido ao tamanho de amostra insuficiente. ESPECIFICIDADE Determinou-se a especificidade num painel de 400 amostras, provenientes de 2 locais situados em França, e que se repartem da seguinte forma: Local 1: 200 amostras provenientes de 200 pacientes francesas seguidas em serologia da toxoplasmose durante a gravidez e não apresentando qualquer sintoma clínico de infecção por Candida. Local 2: 200 amostras provenientes de 200 pacientes franceses dadores de sangue. Categorias de pacientes 200 mulheres grávidas (200 amostras) seguidas em serologia da toxoplasmose Resultados com Platelia Candida Ab Plus Número de pacientes (número Especificidade de amostras) Intermédio considerados Positivo Negativo positivos) dadores de sangue (200 amostras) ,0% 95% IC [71,6-83,5%] 82,0% 95% IC [76,0-87,1%] Especificidade considerados negativos) 95,5% 95% IC [91,6-97,9%] 96,0% 95% IC [92,3-98,3%] 16- CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os produtos fabricados e comercializados pela empresa Bio-Rad estão sujeitos a um sistema de garantia de qualidade desde a recepção das matérias primas à comercialização dos produtos acabados. Cada lote de produto acabado é submetido a testes de controlo de qualidade e só é introduzido no mercado quando estiver em conformidade com os critérios de aceitação. Os registos de produção e de controlo de cada lote são mantidos no seio da Bio-Rad. 17- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U Comparative evaluation of (1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candidaspecies-specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103):p Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag,D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candidainfections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p

11 5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M.,Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p Nucci, M.,, Colombo, A.L Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F.,Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /