CITOSTÁTICOS VS. MEDICAMENTOS BIOLÓGICOS

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1 CITOSTÁTICOS VS. MEDICAMENTOS BIOLÓGICOS Mestrado em Bioquímica 2010/2011 Farmacologia Molecular e Celular Ana Rita Carvalho Araújo Joana Maria Soares Pereira Jorge Daniel Moreira da Silva de Carvalho Ricardo João Silva e Sousa

2 1 Índice 1. Introdução Fármacos Citostáticos Cancro e Ciclo Celular Tipos de Fármacos Citostáticos Efeitos Adversos Mecanismos de Resistência Fármacos Biológicos Manutenção da Homeostasia Plasmática Sistema Imunitário e Defesa Tipos de Fármacos Biológicos Efeitos Adversos Conclusão: Fármacos Citostáticos vs. Fármacos Biológicos Referências... 27

3 2 1. Introdução O cancro, as doenças infecciosas e as doenças auto-imunes são casos de patologias que apresentam etiologias diferentes mas que podem ser tratadas, de um ponto de vista farmacológico, de modo semelhante [1]. O cancro relaciona-se com um descontrolo dos mecanismos de divisão celular [2], as doenças infecciosas devem-se à acção patológica de microorganismos e as doenças auto-imunes a uma desregulação da actuação das células do sistema imune, que passam a reagir contra as células do próprio [3]. Como todas se baseiam no comportamento celular inoportuno, todas podem ser tratadas de modo a eliminar as células que desencadeiam a patologia. Um dos principais, e mais comuns, métodos de tratamento destas patologias centra-se na ruptura do ciclo de divisão celular das células malignas. De facto, tradicionalmente, a terapia do cancro tem sido baseada no princípio de que as células tumorais se encontram frequentemente em divisão, sendo assim mais sensíveis à disrupção do ciclo celular do que as células normais, mas este conceito pode também ser aplicado na eliminação de células de microorganismos patológicos e mesmo de células auto-imunes [1]. Os agentes usados com este fim apresentam uma actividade citostática, que pode alcançar efeitos citotóxicos, e apenas actuam sobre células que se encontram em divisão. Este facto constitui uma grande desvantagem destes agentes pois, apesar de actuarem sobre as células malignas per se, são capazes de interagir com o desenvolvimento de células provenientes de tecidos em proliferação normal, o que leva a variados efeitos secundários [4]. Esta desvantagem pode ser contornada no caso das doenças infecciosas, pelo uso de agentes citostáticos selectivos para componentes celulares únicos dos patogénios e não existentes nos patogénios, mas é de mais difícil prevenção no caso do cancro e das doenças auto-imunes [1]. Com o desenvolvimento de técnicas recombinantes e o maior conhecimento dos processos biológicos, surgiu uma nova área no tratamento deste tipo de doenças: a aplicação de moléculas de origem biológica que indirectamente inibem a actividade maligna de células num hospedeiro [5]. Estes agentes biológicos apresentam uma estrutura mais complexa do que os agentes citostáticos e têm principalmente origem em células do sistema imunitário. Assim, usam como princípio base a acção do sistema imunitário do hospedeiro na eliminação de patogénios e são capazes de o modelar de modo a eliminar qualquer tipo de célula maligna, ou que assim seja indicada ao sistema de defesa do hospedeiro [5-6]. Este tipo de agentes apresenta uma grande vantagem relativamente aos agentes citostáticos, pois são capazes de induzir de modo selectivo a eliminação de células

4 3 malignas, sem acção sobre células normais, principalmente na terapia do cancro. No entanto, a investigação e os fármacos disponíveis que usam este mecanismo de acção ainda se encontram num estádio precoce, sendo que os agentes citostáticos são aqueles, ainda, com maior relevância a nível terapêutico [7]. Ao longo do trabalho são apresentados uma variedade de exemplos de agentes citostáticos e agentes biológicos com aplicação terapêutica, principalmente ao nível da terapia do cancro, já que esta é a área na qual o desenvolvimento destas terapias tem sido mais alargado. Posteriormente, a aplicação deste tipo de agentes a nível terapêutico será ponderado, tendo em conta os factores positivos e negativos de cada metodologia.

5 4 2. Fármacos Citostáticos Os citostáticos são caracterizados pela sua capacidade de inibir o crescimento celular, maturação e proliferação, sem actividade citotóxica directa para as células [8]. Actuam em fases específicas do ciclo celular exercendo a sua acção em todas as células que se encontram no processo de divisão, o que pode resultar em efeitos tóxicos adversos [9]. Os tecidos com baixo nível mitótico praticamente não são afectados [4]. A danificação dos processos mitóticos retarda não só o crescimento tumoral, pois quando os níveis de concentração do citostático diminuem as células podem dar continuidade ao ciclo celular [10], como podem iniciar a apoptose ou morte programada [11]. Os citostáticos são um grupo heterogéneo de substâncias de natureza química distinta, que se utilizam de forma preferencial, mas não exclusivamente, no tratamento antineoplásico [12]. Durante a última década, foram desenvolvidos uma série de medicamentos citostáticos com especificidade para interferirem num ou mais mecanismos celulares que determinam o crescimento celular como, por exemplo, nos tumores. Na teoria esperava-se que estes fármacos tivessem baixa toxicidade e prolongassem a sobrevivência, aumentando a esperança de vida dos doentes. Na prática, provou-se que esta inibição do crescimento celular pelos citostáticos é mais complicada do que a induzida por medicamentos citotóxicos. Ainda não está esclarecido se estes resultados se devem à falta de eficácia do citostático ou da inadequada metodologia clínica aplicada. Um dos factores que dificulta a utilização de citostáticos é que, ao contrário dos citotóxicos, que são administrados em curtos espaços de tempo nas doses máximas e se esperam efeitos imediatos, os citostáticos não respondem da mesma forma requerendo, por vezes, uma terapia a longo prazo e para a qual é difícil determinar a dose mais efectiva [8]. Estes fármacos possuem um potencial cancerígeno o que impossibilita estimar o valor limite de concentração de menor efeito [13] Cancro e Ciclo Celular O cancro é descrito como o resultado de malformações na regulação do ciclo celular: as células lesadas ou mutadas que normalmente seriam destruídas, progridem no ciclo celular, acumulando mutações [2]. As mutações ocorrem principalmente em proto-oncogenes e genes supressores tumorais. Os proto-oncogenes normalmente actuam a diferentes níveis da proliferação celular, no entanto, quando mutados promovem proliferação celular. Do mesmo modo, a mutação de genes supressores tumorais, que impediria a progressão no

6 5 ciclo celular, facilita o crescimento anormal [14]. Em condições normais, os mecanismos de regulação do crescimento promovem a manutenção da homeostasia [15-16] e esta é regulada pelo balanço entre proliferação e paragem do crescimento e apoptose [2]. Distúrbios neste balanço podem levar a hiperplasias e neoplasias. As células tumorais são independentes de estímulos de crescimento devido às várias mutações nas vias de sinalização intracelulares [17]. A destruição das células danificadas ajuda a minimizar a progressão maligna, podendo ocorrer de duas formas distintas: a primeira é por necrose, que é caracterizada pelo sweling celular e rápida degeneração, enquanto a segunda é por apoptose, caracterizada pela retracção das células e fragmentação do DNA [18]. Os checkpoints do ciclo celular são os mecanismos que controlam e regulam o crescimento e desenvolvimento celular [19]. Mutações nestes postos de controlo são evidenciadas em todos os tipos de cancro [14]. Desde a elucidação dos mecanismos de divisão celular na década de 1970 e 1980 pelo trabalho de Lee Hartwell, Paul Nurse e Tim Hunt [20], os produtos dos genes que regulam a maquinaria do ciclo celular têm sido investigados como alvos de fármacos utilizados na terapia contra o cancro. Estes incluem as ciclinas-dependentes de cinases (Cdks), que foram recentemente identificadas como potenciais alvos; proteínas cinases, que coordenam a resposta celular a danos no DNA; e proteínas que regulam a fase M do ciclo celular [21] (Fig. 1). A investigação de inibidores sintéticos de proteínas cinases (TK) para fármacos anticancerígenos foi fortalecida pela aprovação de um número de moléculas alvo, como a proteína cinase inibidora da BCR-ABL - imatinib - (Gleevec ; Novartis ) para o tratamento da leucemia mielóide crónica. A crescente informação estrutural sobre as TK do ciclo celular, nomeadamente as Cdks complexadas com as subunidades reguladoras e inibidores sintéticos, tem facilitado o desenvolvimento de potenciais compostos terapêuticos [21]. As Cdks estão muitas vezes sobrexpressas em cancros humanos devido a vários eventos genéticos e ambientais que afectam as suas vias de regulação. O efeito geral é a perda da integridade dos checkpoints, resultando numa proliferação descontrolada [22]. Assim, a inibição selectiva de Cdks pode limitar a progressão tumoral através do ciclo celular e facilitar a indução de vias apoptóticas [23]. A família das Cdks tem sido intensamente estudada, sobretudo a Cdk2, Cdk4 e Cdk5. Outras Cdks sem envolvimento no ciclo celular têm funções específicas em determinados processos ou tipos de células, no entanto, a sua utilidade como potencial alvo terapêutico para o tratamento do cancro continua a ser investigada [24].

7 6 Figura 1: Regulação do ciclo celular pelas proteínas cinases de potencial interesse na terapia para o cancro. ATM, ataxia telangiectasia mutated; ATR, ataxia telangiectasia, RAD3-related protein; BUB1, budding uninhibited by benzimidazoles 1; BUB1B, BUB1 homologue beta; MPS1, monopolar spindle 1; MVA, mosaic variegated aneuploidy; PCSS,premature chromatid separation syndrome; RB, retinoblastoma protein family members. Adaptado de Lapenna et al. [21]. A inactivação das Cdks tem um impacto global sobre a transcrição celular, afectando principalmente a acumulação de transcritos mrna que codificam reguladores do ciclo celular e factores anti-apoptóticos. Consequentemente, agentes químicos que inibem a transcrição de Cdks podem possuir actividade anti-tumoral pelo aumento da resposta apoptótica em células tumorais, nas quais a sobrevivência depende da expressão contínua de proteínas anti-apoptóticas [23, 25]. No entanto, tais compostos podem ter efeitos tóxicos em células não-tumorais devido à desregulação de factores celulares cruciais, limitando assim a aplicação terapêutica dos inibidores de Cdks de largo espectro [21] Tipos de Fármacos Citostáticos A quimioterapia mais comummente usada é baseada no facto de que as células tumorais se encontram em constante divisão, sendo assim mais sensíveis que as células normais a interferências na síntese do DNA e na fase M do ciclo celular. Tendo em conta o seu modo de acção, os agentes quimiotrápicos podem ser subdivididos em três grupos distintos [26]: Fármacos que interferem na síntese de DNA; Fármacos que induzem danos no DNA; Fármacos inibidores dos microtúbulos (agentes anti-mitóticos).

8 Fármacos que Interferem com a Síntese de DNA Foram alguns dos primeiros fármacos a serem usados como quimiotrápicos (1940) e são compostos que inibem as enzimas envolvidas na síntese e no metabolismo de nucleótidos ou que se incorporam como análogos destes no DNA. Este processo resulta na quebra ou terminação das cadeias do DNA, logo estes fármacos actuam principalmente sobre a replicação do DNA fase S do ciclo celular. a. Inibidores do metabolismo dos folatos O metotrexato é um análogo do folato que inibe a dihidrofolato redutase irreversivelmente. Esta inibição leva a um défice intracelular de tetrahidrofolato o que leva à interrupção da síntese de novo de purinas e de timidilato, resultando na paragem da síntese de DNA, RNA e de proteínas, ficando as células retidas na fase S do ciclo celular. Pensa-se que a selectividade relativa deste agente para as células cancerosas em comparação com as células normais se deve ao facto de as primeiras possuírem altas taxas de proliferação, logo têm uma maior necessidade de compostos que dependem dos intermediários do folato, como purinas e timidilato que são importantes para a síntese de DNA. Além disso, as células malignas podem ser mais susceptíveis aos efeitos do metotrexato na indução da apoptose que as células normais. Este agente quimiotrápico é utilizado no tratamento de numerosos tipos de tumores incluindo carcinomas da mama, pulmão, cabeça e pescoço, leucemia linfoblástica aguda e coriocarcinoma. A toxicidade do metotrexato manifesta-se nas células do hospedeiro que sofrem rápida divisão como a mucosa intestinal e a medula óssea, sendo estes efeitos revertidos após a suspensão da terapia. Também se torna extremamente tóxico para o feto, uma vez que o ácido fólico é essencial para a diferenciação das células fetais e fechamento do tubo neural [1]. b. Inibidores da timidilato sintetase O 5-fluoruracilo (5-FU) é uma anel pirimidínico halogenado que inibe a síntese de DNA, interferindo na biossíntese do timidilato. O 5-FU é inicialmente convertido a 5- fluor-2 -desoxiuridilato (FdUMP) que posteriormente inibe a timidilato sintetase através da formação de um complexo enzima-substrato-co-factor ternário covalente e estável. O 5-Fu pode também ser metabolizado a trifosfato de floxuridina (FUTP) que pode ser incorporado no mrna em vez do uridilato (UMP), interferindo no processamento do

9 8 RNA. Estes dois mecanismos explicam o efeito tóxico que o 5-FU tem sobre as células (Fig. 2). O 5-FU é usado como agente antineoplásico no tratamento de carcinomas da mama e do tracto gastrointestinal mas, uma vez que este agente provoca a diminuição de timidilato também em células normais, este fármaco é altamente tóxico. A capecitabina é um pró-fármaco do 5-FU disponível para administração por via oral e é utilizada no tratamento do cancro colo-rectal e da mama metastático [1]. Figura 2: Mecanismo de acção do 5-fluoruracilo. 5-FU: 5-fluoruracilo; FdUMP: 5-fluor-2 -desoxiuridilato; dump: 2 -desoxiuridilato; dtmp: timidilato; FUTP: trifosfato de floxuridina. Adaptado de c. Inibidores do metabolismo das purinas A 6-mercaptopurina (6-MP) e a azatrioprina (AZA) - que é um pró-fármaco convertido não-enzimaticamente em 6-MP nos tecidos - são análogos da inosina que inibem as interconversões entre nucleótidos de purina. A 6-MP é usada clinicamente no tratamento de leucemia linfoblástica aguda e também está activa contra linfócitos normais, pelo que pode ser utilizada como agente imunossupressor. O alopurinol potencia a eficiência e a toxicidade da 6-MP, uma vez que inibe a xantino-oxidase, impedindo que a 6-MP seja oxidada ao seu metabolito inactivo, o ácido 6- tioúrico. d. Inibidores da ribonucleótido redutase A hidroxiureia inibe a ribonucleótido redutase eliminando um radical tirosil no sítio activo da enzima, sem o qual esta é incapaz de converter os nucleótidos em desoxinucleótidos, inibindo consequentemente a síntese de DNA. É usada no tratamento de cancro da cabeça e do pescoço onde possui um papel radiossensibilizante, ou no tratamento de distúrbios mieloproliferativos onde inibe o crescimento excessivo das células mielóides

10 9 na medula óssea. No entanto, a utilização de hidroxiureia tem sido limitada, uma vez que a sua utilização a longo prazo pode originar leucemias. e. Análogos nucleotídicos (antimetabolitos) Estes fármacos actuam como falsos nucleotídicos que uma vez incorporados no DNA atacam a sua estrutura, resultando na terminação ou quebra da cadeia de DNA e inibição de crescimento celular. O fosfato de fludarabina é um análogo do nucleótido de purina fluorado que ao incorporar-se no DNA leva à terminação da cadeia. É utilizado no tratamento de distúrbios linfoproliferativos, como leucemia linfocitária crónica e linfomas de células B de baixo grau. A cladribina é um análogo de purina clorado que tal como o fosfato de fludarabina ao incorporar-se no DNA leva a quebra da cadeia. Além disso provoca a deplecção das reversas intracelulares de metabolitos purínicos essenciais como o NAD e o ATP. É usada no tratamento da leucemia de células pilosas Fármacos que Induzem Danos no DNA Este tipo de fármacos provoca citotoxicidade através de modificações na estrutura e/ou produção de lesões no DNA. Esta classe de agentes quimiotrápicos é muito grande e incluiu agentes alquilantes, compostos de platina, a bleomicina e inibidores das topoisomerases. Como esta classe de agentes é muito vasta eles actuam em diversos pontos do ciclo celular. a. Agentes Alquilantes Agentes alquilantes são moléculas electrofílicas, capazes de reagir e adicionar grupos alquilo a regiões nucleofílicas da molécula de DNA (Fig. 3). Esta acção pode ocorrer tanto em átomos de oxigénio ou azoto da base azotada, na estrutura fosfatada ou em proteínas associadas ao DNA. Normalmente, estes agentes apresentam dois grupos reactivos, o que permite a formação de ligações cruzadas na molécula de DNA ou a proteínas. Este é o principal mecanismo de toxicidade, mas a alquilação dos resíduos de guanina pode também provocar a clivagem do seu anel imidazol, no emparelhamento anormal de bases ou em despurinação. A ciclofosfamida é um exemplo de agente com esta acção e apresenta a grande vantagem de constituir um pró-fármaco que exige activação ao nível do sistema do Citocromo P450.

11 10 Figura 3: Monoalquilação e a química do crosslinking dos agentes alquilantes. (A) O cloro é um bom grupo de saída que facilita o ataque nucleófilo do azoto para formar um ião iminio (R 3 N) num sistema de anel. Este rapidamente é sujeito a alquilação no N7 da guanina para formar um aducto monoalquilado. (B) Este processo de alquilação pode ser repetido de forma a originar crosslinkers no DNA. O crosslinking pode ocorrer tanto entre duas cadeias complementares de DNA como dentro da mesma cadeia de DNA. Adaptado de Hurley [27]. As nitrosuréias apresentam uma acção semelhante à da ciclofosfamida e outros agentes alquilantes, contudo, apresentam também a capacidade de adicionar grupos carbamoíl aos seus alvos nucleofílicos. Ainda é desconhecida a importância desta acção de carbamoilação das nitrosuréias, mas a estrutura destes agentes permite que apresentem uma elevada lipossolubilidade e possam atravessar a barreira hematoencefálica de modo a actuar sobre tumores cerebrais. b. Compostos de Platina A introdução de Cisplatina (cis-diaminodicloroplatina [II]) no uso clínico (anos 70) permitiu o tratamento de tumores intratáveis. Este composto consiste num átomo de platina ligado a duas aminas e dois cloros na conformação cis. Actuando de modo semelhante aos agentes alquilantes (com dois grupos reactivos). A conformação cis da cisplatina permite ao fármaco estabelecer ligações cruzadas entre resíduos de guanina adjacentes, resultando na lesão do DNA. As células tumorais podem desenvolver resistência à cispaltina pelo aumento da reparação do DNA, diminuição da captação do fármaco ou potenciação da inactivação do fármaco pela síntese de nucleófilos, como a Glutationa. A cisplatina é eficaz no tratamento de tumores genitais, contudo, em conjunto com a carboplatina, que é um composto relacionado, estão entre os fármacos mais eficazes para tumores pulmonares. No caso da cisplatina, a toxicidade que limita a dose do fármaco designa-se por nefrotoxicidade. Compostos com grupos tiol, como a amifostina, melhoram a nefrotoxicidade da cisplatina sem diminuir os efeitos anti-tumorais. A carboplatina está associada a uma menor nefrotoxicidade.

12 11 c. Bleomicina As belomicinas constituem uma família de glicopéptidos naturais sintetizados por espécies de Streptomyces e apresentam uma elevada actividade citostática e citotóxica. Estas proteínas ligam o DNA e quelatam o ferro (II), constituindo antibióticos. Esta acção resulta na formação de radicais livres, promovendo por fim quebras nas cadeias de DNA. Estes agentes têm menores efeitos mielossupressivos que outros agentes que actuam sobre o DNA, mas a sua elevada reactividade com o oxigénio pode causar fibrose pulmonar de um modo cumulativo e irreversível sendo esta a toxicidade mais problemática deste tipo de fármacos. d. Inibidores da Topoisomerase Uma outra classe de agentes quimiotrápicos são os inibidores das topoisomerases que provocam lesões no DNA ao alterarem as funções de nuclesases e ligases. As camptotecinas, as antraciclinas, as epipodofilotoxinas e a ansacrina antineoplásicas actuam segundo o mecanismo descrito anteriormente. Estes compostos alteram a função da topoisomerase induzindo-as a participar na destruição do DNA. As camptotecinas são moléculas semi-sintéticas derivadas de extractos alcalóides que actuam sobre a topoisomerase-i, estabilizando complexos de topoisomerase-i-fragmentos de DNA, o que impede a reparação de moléculas de DNA com cadeias quebradas. De seguida, outras enzimas são ainda capazes de quebrar a cadeia dupla de DNA na região onde o complexo topoisomerase-dna-camptotecinas se formou, uma lesão irreparável por parte das células neoplásicas. Os principais exemplos de agentes que actuam deste modo com uso clínico são o irinotecan e o topotecan. As antraciclinas são antibióticos anti-tumorais naturais e constituem os agentes mais usados na terapêutica do cancro. Estes agentes têm a capacidade de se intercalarem na molécula de DNA, interferindo na acção da topoisomerase-ii, o que resulta em lesões do DNA. São importantes no tratamento de uma variedade de neoplasias, apresentando uma grande aplicabilidade clínica no caso dos cancros hematológico e da mama. O fármaco mais bem conhecido deste grupo, a doxorrubicina e encontra-se associado a insuficiência cardíaca. Pensa-se que este fármaco facilita a produção excessiva de radicais livres no miocárdio, com consequente lesão das membranas celulares cardíacas o que pode ser revertido com a administração de dexrazoxan.

13 12 O etoposídeo pertence ao grupo das epipodofilotoxinas, que inibem a correcção de rupturas de cadeias de DNA mediada pela topoisomerase. Estes agentes são derivados semi-sintéticos de um composto isolado da planta Podophyllum e ligam a topoisomerase II e o DNA, retendo o complexo no estado de clivagem. Esta acção é útil no tratamento do cancro testicular, do pulmão, leucemias e linfomas, mas contribui com uma elevada toxicidade, principalmente ao nível da medula óssea. Associar fármacos que causam lesões directas no DNA com agentes que inibem a topoisomerase-ii pode levar a efeitos sinérgicos potentes a nível antineoplásico. De facto, este sinergismo pode estar relacionado com o papel destas enzimas na reparação do DNA, sendo que a célula é levada a sofrer um dano no DNA e é incapaz de o corrigir Fármacos Inibidores dos Microtúbulos O tratamento de células cancerosas com fármacos inibidores dos microtúbulos (Fig. 4) resulta na acumulação de células em fase mitótica e este arrastamento de fase está associado à morte celular [28-29]. Logo estes fármacos são preferencialmente tóxicos para células em fase M. Estes agentes suprimem a dinâmica do fuso mitótico o que consequentemente leva à inibição da captura do cinetocoro e do alinhamento dos cromossomas o que pode levar à morte celular. A presença de cromossomas apenas parcialmente alinhados que têm falta de adesão aos microtúbulos ou não estão sobre tensão do cinetocoro activa o checkpoint da mitose que deixa a célula num estado de prometafase. No entanto, o checkpoint pode não ser activado e a célula sai de mitose com os cromossomas desalinhados o que leva à formação de células multinucleadas com 4N de conteúdo de DNA. Quando estas células tetraplóides saem de mitose, há activação da p53 e subsequentemente indução do seu alvo, a p21 que activa o checkpoint dependente da p53 na fase G1, impedindo que ocorra uma segunda poliploidização [30-31]. Figura 4: Agentes de ligação à tubulina e estabilidade dos microtúbulos. Adaptado de Kavallaris [32].

14 13 a. Alcalóides de Vinca Estes agentes ligam-se à -tubulina dos microtúbulos e têm capacidade de inibir a sua polimerização quando em elevadas concentrações. A vinblastina e a vincristina são os membros fundadores desta classe de agentes quimiotrápicos e foram introduzidos na prática clínica na década de 50 [33]. Estes fármacos ligam-se ao domínio Vinca, perto do sítio de ligação do GTP na -tubulina e são usados no tratamento de leucemias [34], linfomas e tumores sólidos b. Taxanos Os fármacos que se ligam ao sítio de ligação do taxano à -tubulina [34], incluem diferentes análogos do paclitaxel e do docetaxel. Ambos estes compostos quando se ligam sítio de ligação do taxano induzem estabilização dos microtúbulos quando presentes em elevadas concentrações. No entanto, a pequenas concentrações eles suprimem eficientemente a instabilidade dinâmica dos microtúbulos o que resulta numa falha no alinhamento dos cromossomas que causa um arrastamento da mitose e leva subsequentemente à apoptose. Estes agentes quimiotrápicos são frequentemente usados no tratamento de cancro da mama, do ovário, da próstata e do cancro de não células pequenas do pulmão [26] Efeitos adversos Os medicamentos citotóxicos têm um potencial considerável para danificar o tecido normal e, embora apresentem mecanismos de acção anti-tumoral, existem efeitos adversos (Fig. 5) comuns a todos eles e os mais comuns são: extravasamento de medicamentos - pode causar necrose local. Quando ocorre deve interromper-se a administração do fármaco; hiperuricemia - pode resultar no comprometimento da função renal pela deposição de cristais de ácido úrico; é uma complicação comum durante o tratamento do linfoma não-hodgkin e da leucemia; náuseas e vómitos - estes sintomas ocorrem, normalmente, após a administração de fármacos citotóxicos e radioterapia causando um desconforto aos doentes. Os doentes apresentam graus de susceptibilidade diferentes a um determinado fármaco;

15 14 depressão da medula óssea - este efeito aparece, normalmente, 7 a 10 dias após a administração do fármaco, embora para determinados fármacos este aparecimento possa ser retardado. comprometimento da resposta imunitária - as alterações na resposta imunitária podem resultar no rápido desenvolvimento de uma infecção, resultante da mielossupressão; alopécia - perca de cabelo resultante da lesão dos folículos capilares, é comum no tratamento com fármacos citotóxicos. função reprodutora - alguns dos fármacos são teratogénicos e não devem ser administrados durante a gravidez. A grande maioria dos citostáticos degradam o metabolismo do DNA. Isto implica o risco de uma potencial alteração genómica nas células saudáveis (efeito mutagénico). Malformações congénitas, defeitos morfológicos ou funcionais, são visíveis após o nascimento ou podem manifestar-se mais tarde. A infertilidade é causada pela supressão da espermatogénese ou maturação folicular [4] Mecanismos de Resistência Um problema importante quando se utiliza este tipo de fármacos é o desenvolvimento de resistências. Os mecanismos de resistência envolvem alterações genéticas por parte das células neoplásicas o que pode resultar na resistência a um determinado fármaco ou a múltiplos fármacos (resistência multifactorial). As principais resistências são: diminuição do uptake celular resultado da redução da síntese de uma proteína transportadora necessária para o transporte membranar (metotrexato); aumento do efluxo de fármacos, diminuição na bio-activação de um pró-fármaco, citrabina, que requer fosforilação intracelular para se tornar activa; reparação dos danos (enzimas reparadoras do DNA podem tornar-se mais eficientes e reparar os defeitos causados pelos fármacos); alterações na estrutura da enzima-alvo e formação de substâncias que inactivam o fármaco [4]. Na maioria dos casos, já se utilizam combinações de fármacos conseguindo-se deste modo aumentar o número de células mortas. A selecção da combinação dos fármacos deve seguir determinados princípios: cada fármaco deve ser activo contra aquele tipo de neoplasia quando utilizado individualmente; os fármacos devem apresentar mecanismos de acção diversos; a resistência cruzada entre os fármacos deve ser mínima; os fármacos devem apresentar diferentes efeitos tóxicos para o doente [4].

16 15 Figura 5: Quimioterapia: principais efeitos adversos. Adaptado de Color Atlas of Pharmacology [4]. O tempo de sobrevida do paciente é considerado o resultado mais confiável e clinicamente relevante, em testes de pacientes com doenças potencialmente fatais. Assim, devido aos vários mecanismos de resistência e de acordo com a expressão if a cancer drug doesn t make you live longer, it can t be much use foram postas em prática novas abordagens e metodologias para o tratamento destas doenças, nomeadamente o uso de medicamentos biológicos. 3. Fármacos Biológicos Medicamentos biológicos consistem em agentes farmacêuticos derivados, ou sintetizados, a partir de organismos vivos [5] que podem ser usados com o objectivo de modificar o curso da doença, limitar as complicações típicas do tratamento convencional e fornecer opções para o tratamento de doenças refractárias ao tratamento [6]. Graças à sua origem, os agentes terapêuticos biológicos apresentam várias características que os distinguem dos agentes químicos tradicionais, constituindo estruturas moleculares heterogéneas de grande tamanho e com estruturas espaciais muito mais complexas, sendo assim mais difíceis de caracterizar por análise dos seus componentes individuais [5]. Um fármaco biológico é tipicamente uma proteína, constituída por vários aminoácidos numa estrutura tridimensional complexa. Normalmente, têm origem sanguínea,

17 16 constituindo proteínas plasmáticas ou produtos proteicos secretados por células sanguíneas [5]. Os principais exemplos são anticorpos e citocinas, que são geralmente utilizados no tratamento do cancro e de doenças auto-imunes pois são capazes de modular o sistema imunitário de um modo específico e selectivo, mas podem também incluir proteínas plasmáticas (como por exemplo, albumina, factores de coagulação, hormonas, etc.) ou mesmo células ou componentes celulares que promovem a homeostasia [5] Manutenção da Homeostasia Plasmática O sangue corresponde a 8% da massa do corpo humano e é composto por plasma e vários tipos de células (eritrócitos, os leucócitos e as plaquetas). O plasma constitui 52-62% do volume do sangue e é composto, aproximadamente, por 91% de água. Deste modo, o sangue corresponde basicamente a uma suspensão de células numa solução aquosa [35]. A grande habilidade solvente da água permite que o plasma transporte vários tipos de substâncias, como nutrientes, minerais, metabolitos para excreção, hormonas, anticorpos e proteínas plasmáticas. As proteínas plasmáticas constituem a maior parte dos solutos do plasma e podem ser classificadas de acordo com as suas propriedades físicas e químicas e em três categorias: albuminas, globulinas e factores de coagulação [36]. De um modo geral, as proteínas plasmáticas são capazes de recolher e libertar iões hidrogénio, ajudando a tamponar o sangue e mantendo-o a ph de 7,40. No caso de patologias oncogénicas, as albuminas e as globulinas ganham uma importância elevada. As albuminas, as proteínas plasmáticas mais abundantes, têm como principal função contribuir para a pressão osmótica do sangue, promovendo o movimento de água dos tecidos para o sangue [35-36], mas são também capazes de transportar variadas moléculas hidrofóbicas [37]. Sabe-se que os níveis de albumina no plasma podem ser reduzidos como resultado da diminuição da sua síntese em vários casos patológicos como doença hepática [38], doença infecciosa [39] e cancro [40], funcionando assim como um indicador para o prognóstico e severidade destas doenças [41-42]. Assim, a albumina humana recolhida do soro de dadores de sangue saudáveis, tal como obtida por recombinação, pode ser usada de modo a melhorar a qualidade do sangue de pacientes com estas doenças [5, 41-42]. Por outro lado, as globulinas podem ser divididas em três tipos de proteínas diferentes presentes no sangue: alpha- (α), beta- (β) e gama-globulinas (γ). As α- e β-globulinas são produzidas no fígado e ligam iões metálicos, vitaminas lipofílicas e lípidos, funcionando como proteínas transportadoras em junção com as albuminas e como componentes das

18 17 lipoproteínas. As γ-globulinas são produzidas por linfócitos B e são normalmente designadas de imunoglobulinas ou anticorpos. Estas proteínas apresentam funções diferentes das α- e β-globulinas, sendo membros do sistema imunitário e ajudando a combater uma infecção [35], o que pode ser explorado em terapia biológica. Para além do plasma e dos seus componentes moleculares, os componentes celulares do sangue são também de grande importância. No entanto, no caso da terapia biológica, os leucócitos, principalmente os linfócitos, são as principais células usadas como fonte de agentes terapêuticos. Estes componentes celulares do sangue são guerreiros naturais e protegem o organismo do ataque de patogénios e agentes estranhos, podendo ser usados no combate contra patologias como o cancro ou doenças auto-imunes [5-6, 43] Sistema Imunitário e Defesa A defesa do organismo é desempenhada maioritariamente pelo sistema imunitário. Este engloba todas as células e efectores moleculares capazes de combater um patogénio e proteger o hospedeiro, sendo dividido em componentes inatos e componentes adaptativos. No entanto, esta divisão não é fixa, e existe uma grande interacção entres estes dois grupos (Fig. 6) [43]. A resposta inata inclui factores solúveis, como as proteínas do sistema complemento, e várias células efectoras, como mastócitos, granulócitos, macrófagos, células dendríticas e células naturalmente assassinas. A imunidade inata é a primeira linha de defesa contra uma infecção, todos os componentes desta resposta apresentam receptores e moléculas de superfície capazes de reconhecer padrões em patogénios, iniciando assim uma resposta inflamatória que será repetida aquando de novo contacto com o mesmo ou outro patogénio [44]. Por outro lado, a imunidade adaptativa é mediada pelos anticorpos e pelos linfócitos T e apresenta um desenvolvimento mais lento. Isto deve-se ao facto de ser necessária uma expansão dos linfócitos que apresentam à sua superfície receptores para antigénios específicos. De facto, os linfócitos B apresentam à sua superfície moléculas de imunoglobulinas que são capazes de reconhecer antigénios solúveis específicos em agentes estranhos ao hospedeiro enquanto os linfócitos T apresentam receptores que reconhecem proteínas ou péptidos antigénicos processados e apresentados pelo Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC); este reconhecimento antigénico induz assim a sua activação, diferenciação e expansão [45]. Para além destes dois tipos de imunidade, células Tγδ e células T naturalmente assassinas são componentes do sistema imunitário que apresentam uma função intermédia à imunidade inata e à imunidade adaptativa [43].

19 18 Figura 6. Resposta imune inata e adaptativa. Adaptado de Dranoff [43]. A activação dos linfócitos B é promovida pelo reconhecimento de um antigénio por parte de imunoglobulinas específicas embebidas na membrana celular, os receptores das células B (BCR). Após activação, estas células proliferam e diferenciam-se em plasmócitos, células que produzem e secretam imunoglobulinas (ou anticorpos). Cada clone produz um anticorpo com uma especificidade única, um anticorpo monoclonal, e esta característica pode ser explorada na geração de uma terapia biológica [6, 46]. Uma molécula de imunoglobulina apresenta uma estrutura bastante característica (Fig. 7), sendo constituída por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves idênticas, compostas por regiões variáveis e constantes [47]. Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas constituem a região de ligação ao anticorpo, o que se designa de F v. Na região constante da molécula (F c ), os domínios constantes determinam a função do anticorpo, que pode incluir a activação do complemento, a clearance de complexos imunes e a citotoxicidade celular dependente de anticorpos, entre outros (Fig. 7). Assim, uma molécula de anticorpo é capaz de reconhecer especificamente um antigénio, solúvel ou não, e induzir a sua eliminação [48]. Todos os mecanismos induzidos por anticorpos podem se explorados no desenvolvimento de uma terapia biológica, sendo a citotoxicidade celular dependente de anticorpos é um dos mecanismos mais potentes [6]. Ao contrário dos linfócitos B, os linfócitos T não produzem anticorpos, sendo capazes de reconhecer antigénios de patogénios intracelulares e de os eliminar através da destruição da célula afectada. Os receptores que promovem a activação dos linfócitos T são proteínas membranares distintas mas estruturalmente relacionadas com os anticorpos [6]. Estes receptores são incapazes de reconhecer antigénios solúveis, apresentando uma

20 19 especificidade restrita para antigénios peptídicos ligados a proteínas do hospedeiro codificadas por genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) e que são expressas na superfície de células apresentadoras de antigénios (como por exemplo, células dendríticas, macrófagos). Os linfócitos expressam à sua superfície uma variedade de glicoproteínas, que estão envolvidas na sua adesão aos tecidos, activação e recepção de sinais co-estimuladores. Dependendo do tipo de glicoproteínas presentes à sua superfície, podemos distinguir vários tipos de linfócitos T, sendo os mais relevantes os linfócitos T helper, caracterizados pela presença de CD4, e os linfócitos T citotóxicos, caracterizados pela presença de CD8. Estes dois tipos de linfócitos usam CD4 ou CD8 como um componente do seu receptor de antigénios (TCR), sendo depois o sinal propagado para o interior da célula promovendo a sua activação [46]. Figura 7. Estrutura e funções biológicas (b) das imunoglobulinas. Adaptado de Casadevall et al. [48]. Linfócitos T citotóxicos e helper distinguem-se pelas suas funções (Fig. 8). De facto, as moléculas de CD4 e CD8 são essenciais para a distinção da função destes dois tipos de células. As moléculas CD4 reconhecem apenas membros da classe II das moléculas de MHC, que apresentam péptidos antigénicos de antigénios fagocitados, enquanto as moléculas CD8 reconhecem apenas membros da classe I das moléculas de MHC, que apresentam péptidos de origem citosólica. Esta diferença induz diferentes respostas e funções destes grupos de células: células T helper vão secretar proteínas citocinas cujas funções são estimular a proliferação e diferenciação de células T e activar outras células,

21 20 como linfócitos B, macrófagos e outros leucócitos; células T citotóxicas promovem a lise de células que produzem antigénios estranhos (como por exemplo, células infectadas por vírus e outros micróbios intracelulares, células cancerosas) pela secreção de perforina e granzimas, que promovem a lise celular [46]. As citocinas são proteínas secretadas por células pertencentes ao sistema imunitário, tanto da imunidade inata como adaptativa, e medeiam muitas das funções destas células. São produzidas em resposta a patogénios e outros antigénios e, dependendo da citocina, estimulam diversas respostas das células envolvidas na imunidade e na inflamação [43, 46]. Em geral, as citocinas são produzidas por diferentes populações de células e actuam em diferentes células alvo. Estas proteínas funcionam como sinalizadores que se associam a vias de sinalização diferentes, normalmente todas relacionadas com processos de diferenciação e sobrevivência (por exemplo, via Jak-STAT, activação de AP-1, NF-κB, etc.). Estes receptores estão presentes na membrana de várias células pertencentes ao sistema imunitário mas, principalmente no caso das citocinas da imunidade inata, existem também receptores em vários órgãos diferentes induzindo reacções biológicas características da inflamação, como no hipotálamo (indução de febre), fígado (indução da produção de proteínas) e nos tecidos muscular e adiposo (indução de catabolismo) [46]. As citocinas podem ser mediadoras e reguladoras da imunidade inata, sendo produzidas principalmente por fagócitos mononucleares em resposta a agentes infecciosos. Padrões presentes nos patogénios ligam receptores de reconhecimento de padrões (como Toll-like receptors) na superfície das células ou nos endossomas dos macrófagos e estimulam a síntese de algumas citocinas que estimulam a eliminação do patogénio. Por outro lado, as citocinas podem funcionar como mediadores e reguladores da imunidade adaptativa, sendo produzidas principalmente por linfócitos T em resposta ao reconhecimento específico de antigénios estranhos. Algumas citocinas dos linfócitos T funcionam principalmente para regular o crescimento de várias populações de linfócitos e, assim, têm um papel importante na fase de activação das respostas imunes dependentes de linfócitos T. Outras citocinas derivadas das células T recrutam, activam e regulam células efectoras especializadas, como fagócitos mononucleares, neutrófilos e eosinófilos, para que estes eliminem antigénios na fase efectora das repostas imunes adaptativas. Por fim, as citocinas são também factores importantes na estimulação da hematopoiese, sendo que algumas citocinas são produzidas pelas células do estroma da medula óssea, leucócitos e outras células e estimulam o crescimento e diferenciação de leucócitos imaturos [46].

22 21 Figura 8. As duas principais classes de linfócitos T e suas funções. Adaptado de Cellular and Molecular Immunology [46] Tipos de Fármacos Biológicos O grande desenvolvimento das tecnologias de DNA recombinante, de fermentações à escala industrial e tecnologias de purificação permitiram produzir moléculas biológicas com a mesma pureza, reprodutibilidade a nível dos fármacos químicos sintéticos [49]. A diversidade de moléculas biológicas é elevada. Reportando apenas a anticorpos, um humano pode apresentar mais de um bilião de moléculas diferentes, podendo este número aumentar exponencialmente com a introdução de mutações pontuais. Embora bastante diversos, os principais alvos da biotecnologia envolvem as terapias dirigidas para o cancro [49] (Fig. 9). Em 1995 surgiu um dos primeiros exemplos de fármaco biológico, o interferão α, sendo este utilizado contra o melanoma maligno. Entretanto surgiram outras moléculas biológicas no mercado associadas a terapia do cancro sendo grande parte anticorpos monoclonais culminando na primeira vacina terapêutica para o cancro da próstata, a Sipuleucel-t [49]. Analisando o top 10 de fármacos mais vendidos, verifica-se que este apresenta já quatro moléculas de cariz biológico, nomeadamente, anticorpos monoclonais como o rituximab que tem como alvo a molécula CD20, o cetuximab cujo alvo é o receptor do factor de crescimento epidérmico, o trastuzumab específico do receptor HER-2 e por fim o bevacizumab que tem com alvo o factor de crescimento vascular endotelial [49].

23 22 Figura 9. Evolução do uso de anticorpos com fim terapêutico ao longo dos últimos cem anos. Azul: anticorpo quimérico; vermelho: anticorpo humanizado; amarelo: anticorpo humano; verde: anticorpo de ratinho. Adaptado de Weiner et al. [50] Terapia dirigida para receptores e alteração de sinalização molecular Uma das principais classes de moléculas biológicas são os anticorpos monoclonais, e a ideia subjacente a estes fármacos é o direccionamento destes para os tumores em si e o seu microambiente [50]. Muitos dos alvos de anticorpos terapêuticos são factores de crescimento que apresentam uma expressão aumentada em tumores. Ao bloquear a ligação dos ligandos a este receptores, os anticorpos monoclonais tentam normalizar a proliferação celular, induzir apoptose ou ajudar a sensibilizar tumores para agentes quimioterapêuticos [50]. O exemplo dos membros da família do EGFR (EGFR, HER2, HER3 e HER4) que são normalmente sobreexpressos em tumores sólidos sendo por isso actualmente usados como alvos de terapias com anticorpos. O cetuximab é um anticorpo monoclonal quimérico com uma porção específica de EGFR e outra de IgG1 e funciona impedindo a ligação do ligando activador e, consequentemente, inibindo a dimerização do receptor, uma etapa essencial para a transdução do sinal [51]. Por outro lado, o panitumumab é um isotipo de um anticorpo IgG2 completamente humanizado e que actua segundo um mecanismo muito similar ao cetuximab, no entanto, contrariamente a este, não produz citotoxidade mediada por anticorpos [52]. Decorrem de momento, ensaios clínicos de fase 1 usando um anticorpo monoclonal que tem com alvo o receptor EGFR aquando da sua dimerização, após a ligação do ligando, e tem mostrado boa penetração no tecido tumoral sem evidências de toxicidade nos pacientes [50]. Mesmo quando não se conhece especificamente ligandos de determinado receptor é possível utilizar terapias com anticorpos monoclonais se os alvos forem outras etapas da transdução de sinal como a dimerizaçao e a internalização. Um caso exemplificativo é o do receptor HER2 que se encontra sobre expresso e com amplificações génicas em cerca de