Síntese de compostos triazólicos com potencial ação antitumoral para linhagens celulares de glioblastoma Aluno: Eduardo Ferrari Ometto Colombo Orientador: Camilla Djenne Buarque 1. Introdução O glioblastoma (gbm) é um tumor caracterizado pelo seu alto grau de proliferação, invasão tecidual e necrose sendo classificado como o mais maligno e incurável. As células tronco tumorais (CTT) são subpopulações de células tumorais que levam ao seu crescimento e recorrência. Os Gbms e CTT são resistentes aos tratamentos anti-câncer adotados atualmente, tais como quimio- e radioterapias (Biochim Biophys Acta, 2012). Apesar de avanços recentes, estudos adicionais dos mecanismos moleculares que levam a esta malignização são necessários para a melhor compreensão dos alvos terapêuticos e melhor planejamento dos fármacos. Dentre todos os casos de tumores que podem se desenvolver no cérebro, o gbm representa 15,4%. Para adultos com glioblastoma mais agressivo, mesmo em tratamento, a sobrevida média é de cerca de 14,6 meses. A sobrevivência de dois anos é de 30% e quase 10% dos pacientes com glioblastoma podem viver cinco anos ou mais. Os triazóis tem uma grande importância na área farmacológica. Estes são substâncias hetero-aromáticas de origem sintética que apresentam seis elétrons π, classificados de acordo com sua forma isomérica, como vicinais 1,2,3-triazóis ou simétricos 1,2,4-triazóis (MELO, et al 2006). A seletividade dessa reação depende da metodologia sintética adotada. Figura 1: Estruturas isoméricas do triazol. Um dos métodos mais versáteis para a obtenção de triazois é a cicloadição de Huisgen entre azida e alcinos terminais. Entretanto, esse método apresenta alguns inconvenientes, tais como a necessidade de altas temperaturas e a falta regiosseletividade (JIANG, et al 2014).
Diante de tais problemas, Sharpless e colaboradores desenvolveram uma metodologia seletiva para a síntese de triazóis utilizando sais de cobre (I) como catalisador. A metodologia desenvolvida facilitou de forma regioespecífica a cicloadição entre alcinos e azidas produzindo apenas 1,2,3-triazol triazóis 1,4- dissubstituídos. Devido aos elevados rendimentos, baixos tempos de reação e o amplo escopo, essas reações passaram a ser conhecidas como reações click (KOLB e SHARPLESS, 2001). O campo emergente da reação click chemistry oferece uma abordagem única para a síntese de moléculas contendo 1,2,3- triazóis. Esta reação deve-se, em parte, à facilidade com a qual as azidas e alcinos podem ser introduzidos numa molécula e a sua relativa estabilidade sob uma variedade de condições (AGALAVE et al, 2011). O grande interesse pelos compostos 1,2,3 triazóis na área farmacológica deve-se a sua capacidade de atuação como grupo farmacofórico, sendo estes estáveis à degradação metabólica e capazes de realizar ligações de hidrogênio e dipolo-dipolo, o que favorece a ligação com alvos biomoleculares, além da melhora sua solubilidade (Manetsch et al., 2004; Agalave et al., 2011). Além disso, a relação bioisostérica do anel 1,2,3 triazólico com as amidas vem sendo bastante investigada na literatura, devido a sua relativa planaridade e forte momento dipolo serem semelhantes as propriedades físico-químicas das amidas, mas diferentemente destas, o anel triazólico não sofre hidrólise química, sendo também resistente a oxidação e degradação enzimática (Holub e Kirshenbaum, 2010; Freitas et al., 2011). Existem inúmeros fármacos ou candidatos à fármacos contendo o grupo 1,2,3-triazóis (Agalave, 2011). Dentre os compostos que atuam no sistema nervoso central para o tratamento de câncer cerebral, destaca-se o triazol PIT-1 que atua em linhagens de glioblastoma humano U87MG (Figura 1; Kommagalla, 2014). Figura 2: Triazol PIT-1.
Justificativa Devido à baixa eficiência no tratamento utilizado no combate aos glioblastomas, e o alto índice de mortalidade relacionados a esse agressivo tumor cerebral, faz-se necessário a busca por novos fármacos, capazes de inibir o desenvolvimento desse tipo de tumor. Dessa forma, com base na importância biológica dos compostos contendo grupos 1,2,3-triazóis e diante dos resultados preliminares obtidos para os compostos LSO-02 e LSO-03 (Esquema 1), que apresentaram ação significativa em linhagens celulares de glioblastomas (GMB 02 e GMB 72), o presente trabalho busca realizar modificações no composto LSO-02, composto sintetizado em projetos anteriores, com a finalidade de potencializar sua ação biológica diante das linhagens celulares gbms. Esquema 1: Compostos que apresentaram atividade para linhagens de glioblastomas. 2. Objetivo O presente trabalho visa realizar modificações estruturais no composto LSO-02, utilizando grupos funcionais já conhecidos na literatura por apresentarem atividade anticarcinogênica, tais como sufonilhidrazonas, benzoquinonas entre outros. 3. Metodologia Os esquemas 2 e 3 representam as retrossínteses realizadas neste trabalho.
Esquema 2: Análise retrossintética para a síntese dos triazóis Para obtenção do composto (7) realizou-se a reação de adição à carbonila presente no LSO- 02. Esta reação consiste na fluoração para obtenção do composto (7). A obtenção do composto (9) ocorreu através da redução da carbonila presente no LSO-02. Para obtenção do composto (11) realizou-se a reação de adição à carbonila presente no LSO-02. A síntese do composto (13) foi realizada por meio da reação de Baeyer-Villiger. A sintese do LSO-02 foi feita via click chemistry, na presença de sulfato de cobre (II) como catalisador, de acordo com a metodologia proposta por Sharpless et al (2001) 4. Os precursores do LSO-02 foram feitos pela azidação do 2- nitrobenzaldeido (1) via substituição nucleofílica aromática para a obtenção do 2- azidobenzaldeido (2) e a reação do propargil-fenol (5) foi realizada via substituição nucleofílica. Esquema 3: Análise retrossintética para a síntese do triazol 15 A obtenção do composto (15) ocorreu via click chemistry, entre o 2-azido benzaldeído e o fenil acetileno (14), na presença de sulfato de cobre (II) como catalisador. 4. Parte experimental 4.1 Síntese dos precursores do LSO-02 a. 2-Azidobenzaldeido
Esquema 4: Síntese da 2-azidobenzaldeido a partir do 2-nitrobenzaldeido. Pesou-se 6,62 mmol do 2-nitrobenzaldeído (1) e 26,48 mmol (4 equivalentes) da azida de sódio (2) e estes foram dissolvidos em 20 ml do DMF em um balão de 50 ml. A mistura ficou sob agitação a 55 C durante 3 dias (96 horas). Ao meio reacional foi adicionado 30 ml de éter etílico e então este foi lavado 3 vezes com 20 ml de água. A fase orgânica foi seca com NaSO 4 e o solvente foi evaporado no rota-evaporador. Por fim o produto foi isolado por meio da coluna cromatográfica usando como eluente Acetato/Hexano (3%). b. Propargil-fenol Esquema 5: Síntese da 2-azidobenzaldeido a partir do 2-nitrobenzaldeido. Pesou-se 10,59 mmol de fenol (3) e 21,19 mmol (2 equivalentes) de carbonato de potássio e estes foram dissolvidos em 20 ml de acetonitrila em um balão de 50 ml, em seguida adicionou-se lentamente com auxílio de uma seringa graduada 12,71 mmol (1,2 equivalentes) de brometo de propargila (4). A mistura ficou sob agitação em refluxo, com atmosfera modificada (N 2 ), por 4 horas. Em seguida, foi adicionando à mistura 20 ml de água e em seguida 20 ml de diclometano para realizar a separação liquido-liquido. A fase orgânica foi lavada mais 2 vezes com 15 ml de água e então foi saca com NaSO 4. O solvente foi evaporado no rota-evaporador. 4.2 Síntese do LSO-02 Esquema 6: Síntese do LSO-02.
Pesou-se 1 mmol da azida (2) e 1 mmol do alcino (5) e estes foram dissolvidos em 6 ml de uma solução aquosa de álcool terc-butílico (1:1). Em seguida adicionou-se 0,1 mmol de ascorbato de sódio e 0,01 mmol de sulfato de cobre penta-hidratado. A mistura heterogênea foi mantida sob agitação constante à temperatura ambiente. A mistura reacional foi extraída com 20 ml de diclorometano e água (2 x 15mL), a fase orgânica foi seca com NaSO 4 anidro e então o solvente foi evaporado no rota-evaporador. 4.3 Modificações no composto LSO-02 a. Fluoração do LSO-02 via DAST Esquema 7: Fluoração via DAST. Em um balão de 5 ml seco e com atmosfera modificada, com N 2, adicionou-se 0,21 mmol do LSO-02 e 2 ml de diclorometano seco. Em seguida, 0,525 mmol (2,5 equivalentes) de DAST (6) foi adicionado gota-a-gota. A mistura foi mantida sob agitação por 24 horas à temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se 4 ml de uma solução saturada de bicarbonato de sódio gelada e em seguida, 10 ml de diclorometano. Foi feita uma separação liquido-liquido e a fase orgânica foi lavada 2 vezes com 10 ml de brine. Para retirar os resíduos da reação, foi feita uma coluna baixa cuja fase móvel foi de 20% acetato/hexano. b. Redução da carbonila presente no LSO-02 Esquema 8: Redução da carbonila para obtenção do álcool benzílico 9. Dissolveu-se 0,21 mmol de LSO-02 em 3 ml de metanol em um balão de 10 ml. Em seguida, a mistura foi colocada em um banho de gelo e mantida sob agitação e então adicionou-se 0,546 mmol (2,6 equivalentes) de boro-hidreto de sódio (8). Após 30 minutos, observou-se que a mistura fica transparente, indicando o fim da reação. Esta foi extraída com 15 ml de diclorometano, que foi lavado 2 vezes com 10 ml de água. A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro e então o solvente foi evaporado no rota-evaporador.
b. Adição de sufonilhidrazina à carbonila Para obtenção do composto (11) realizou-se a reação de adição à carbonila presente no LSO- 02. Foi utilizada a sufonilhidrazina (10) como nucleófilo, descrita no esquema 7. Esquema 9: Obtenção da sulfonilhidrazona 11. Adicionou-se 0,40 mmol de LSO-02 e 0,48 mmol (1,2 equivalentes) de sufonilhidrazina (10), dissolvidos em 3 ml de metanol, em um balão de 10 ml. A mistura foi mantida em refluxo sob agitação por 2 horas a 50 C. Em seguida, foi evaporado aproximadamente metade do solvente presente no balão no rota-evaporador e, em seguida, o balão foi mantido na geladeira por duas horas para que o produto precipite. O precipitado (de coloração branca) foi filtrado, e lavado com etanol gelado. c. Reação de Baeyer-Villiger A síntese do composto (13) foi realizada por meio da reação de Baeyer-Villiger, utilizando AMCPB (12), descrita no esquema 8. Esquema 10: Reação de Baeyer Villiger. Para a primeira etapa desta síntese, em um balão de 5 ml seco e com atmosfera modificada, com N 2, adicionou-se 0,287 mmol do LSO-02 e 0,430 mmol (1,5 equivalentes) de AMCPB (12) e em seguida, estes foram dissolvido em 2 ml de diclorometano seco. A mistura foi mantida sob agitação por 6 horas à temperatura ambiente sem contato com luz. Em seguida
foi feita uma separação liquido-liquido com 7 ml de acetato de etila, lavado 3 vezes com 3 ml de uma solução saturada de carbonato de sódio e mais 3 vezes com brine. O solvente foi seco no rota-evaporador. Para a segunda etapa, foi adicionado 2 ml de metanol e 310 µl de uma solução de hidróxido de sódio 6 molar. Esta mistura foi mantida sob agitação por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida foi feita uma separação liquido-liquido com 10 ml de acetato de etila lavado 3 vezes com 5 ml de brine. A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro e então o solvente foi evaporado no rota-evaporador. 4.4 Modificação do composto LSO-02 a partir do fenilacetileno A obtenção do composto (15) ocorreu via click chemistry, entre o 2-azido benzaldeído e o fenil acetileno (14), na presença de sulfato de cobre (II) como catalisador, descrita no esquema 9. Esquema 11: Modificação do composto LSO-02 via click chemistry com o fenilacetileno Pesou-se 1,25 mmol da azida (2) e 1,5 mmol do alcino (14) e estes foram dissolvidos em 5 ml de uma solução aquosa de álcool terc-butílico (1:1). Em seguida adicionou-se 0,125 mmol de ascorbato de sódio e 0,0125 mmol de sulfato de cobre penta-hidratado. A mistura heterogênea foi mantida sob agitação constante à temperatura ambiente por 8 horas. Ao fazer uma TLC, observou-se que ainda havia azida (2) porém não havia mais alcino (14) no meio reacional, então foi adicionado mais 1,5 mmol do mesmo e a reação foi mantida sob agitação por mais 8 horas. A mistura reacional foi extraída com 20 ml de diclorometano e água (2 x 15mL), a fase orgânica foi seca com NaSO 4 anidro e então o solvente foi evaporado no rotaevaporador. 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Síntese do LSO-02 e seus precursores Os precursores utilizados para a síntese do LSO-02, o 2-azido benzaldeído (2) e propargil fenol (5), foram obtidos com rendimentos de 60% e 70% respectivamente. Para a síntese do 2- azido benzaldeído realizou-se a azidação do 2- nitrobenzaldeido (1) via substituição
nucleofílica aromática. Para obtenção do propargil-fenol (5) foi realizada uma reação de substituição nucleofílica do brometo de propargila (4) pelo fenol (3). Ambos os processos estão descritos no Esquema 12. Esquema 12: Síntese dos precursores do LSO-02. Após a obtenção dos precursores, sintetizou-se a LSO-02 via click chemistry, na presença de sulfato de cobre (II) como catalisador. Obtendo-se um rendimento de 60% como descrito no esquema 13. Esquema 13: Síntese do LSO-02. Todos os compostos sintetizados, foram caracterizados por espectros de RMN de hidrogênio e carbono, entretanto nesse trabalho só serão discutidos os espectros de hidrogênio. 5.2 Fluoração do LSO-02 via DAST A obtenção do composto (7) se deu por meio da reação de fluoração nucleofílica, utilizandose o DAST (6) como reagente de fluoração, como representado no esquema 14. Esquema 14: Fluoração do aldeído LDO-02 via DAST.
O composto sintetizado no esquema 14 foi obtido com rendimento de 72%, abaixo encontrase o espectro de RMN de hidrogênio, onde os sinais obtidos estão de acordo com a estrutura proposta. a g Figura 3: Espectro de RMN de hidrogênio do composto (7). Pode-se observar no espectro acima, o sinal característico do hidrogênio presente no anel triazóico, na forma de um singleto em torno de 7,96 ppm, este encontra-se identificados na figura 3 como a. Observa-se também os sinais de hidrogênio do novo grupo fluorometileno (CHF 2 ) agora presente na molécula, em 6,75 ppm na forma de um tripleto relativo ao acoplamento do H com os dois átomos de flúor, este está identificado na figura 3 como g. Todos os outros sinais observados no espectro estão de acordo com o composto obtido. 5.3 Redução da carbonila presente no LSO-02 Para sintetizar o composto (9) foi feita uma redução da carbonila presente no LSO-02 com borohidreto de sódio (8), descrita no esquema 15.
Esquema 15: Redução da carbonila presente no LSO-02. Foi possível sintetizar, com um rendimento de 65%, o composto (9). Abaixo, na figura 4, encontra-se o espectro de RMN de hidrogênio. Este foi utilizado para a certificação de que o composto desejado foi sintetizado com êxito. a h l Figura 4: Espectro de RMN de hidrogênio do composto (9). O sinal característico do hidrogênio no triazol se encontra, na forma de um singleto, em 8,03 ppm, este está identificados na figura 4 como a. Também pode-se observar o sinal de hidrogênio no novo grupo, agora presente na molécula, em 4,51 ppm, na forma de um dupleto cuja integração é 2, e o hidrogênio da hidroxila em 3,41. Ambos os sinais se encontram destacados na figura 4 e identificados como h e l, respectivamente. Todos os outros sinais observados no espectro estão de acordo com o composto obtido. 5.4 Adição de sufonilhidrazina à carbonila
O composto (11) foi sintetizado fazendo uma adição à carbonila presente no LSO-02. Foi utilizada a sufonilhidrazina (10) como nucleófilo, descrita no esquema 16. Esquema 16: Adição de sufonilhidrazina à carbonila. Com rendimento de 70%, o composto (11) foi sintetizado. Na figura 5 abaixo encontra-se o espectro de RMN de hidrogênio, usado para caracterizar o mesmo. a b Figura 5: Espectro de RMN de hidrogênio do composto (11). Como esperado, existe no espectro um sinal na forma de um singleto em 8,59 ppm. Este é o sinal do hidrogênio presente no anel triazóico, e está identificado na figura 5 como a. Observa-se também o sinal do hidrogênio da sufonilhidrazona em 8,11 ppm que está identificado na figura 5 como b. Todos os outros sinais observados no espectro estão de acordo com o composto obtido.
5.5 Reação de Baeyer-Villiger Não foi possível a obtenção do Composto (13) por meio da reação de Baeyer-Villiger, utilizando AMCPB (12), descrita no esquema 17. Era observado que o reagente (LSO-02) não era consumido ao decorrer da reação, mesmo aumentando a equivalência de MCPBA (12). Dessa forma, outras metodologias serão investigadas para a obtenção do composto (13). Esquema 17: Reação de Baeyer-Villiger 5.6 Modificação do composto LSO-02 a partir do fenilacetileno A obtenção do composto (15) ocorreu via click chemistry, entre o 2-azido benzaldeído e o fenil acetileno (14), descrita no esquema 18. Esquema 18: Modificação do composto a partir do fenilacetileno. Ao analisar o espectro (figura 6), pode-se afirmar que de fato foi sintetizado o composto (15). Porém, este foi obtido com um rendimento de 30%, como descrito no esquema (13). Então, uma nova metodologia será estudada para se chegar no composto (15) com maiores rendimentos.
a b Figura 6: Espectro de RMN de hidrogênio do composto (15). Pode-se observar no espectro o sinal do hidrogênio presente no anel triazóico, que se encontra na forma de um singleto em 8,18 ppm, e o singleto referente a carbonila presente no composto em 10,00 ppm, ambos os sinais estão identificados na figura 6 como b e a, respectivamente. Todos os outros sinais observados no espectro estão de acordo com o composto obtido. 6. Conclusão Todos os produtos obtidos foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética (RMN) de Hidrogênio e Carbono. Dentre as 5 modificações realizadas no composto LSO-02, 3 apresentaram bons rendimentos, entre 65 e 72% (compostos 7, 9 e 11). Porém, em relação as outras 2 modificações, uma apresentou baixo rendimento em torno de 30% (composto 15) e a modificação propostas via reação de baeyer-villiger não ocorreu, então outras abordagens sintéticas serão estudas para a obtenção dos compostos desejados. Os produtos obtidos foram enviados para a avaliação biológica em linhagens celulares Gbms em um laboratório da UFRJ.
7. Referências 1- AGALAVE, S.G.; MAUJAN, S. R.; PORE, V. S. Click Chemistry: 1,2,3-Triazoles as Pharmacophores. Chem. Asian J. 6, 2696 2718, 2011. 2- KOLB, H. C.; FINN, M. G.; SHARPLESS, K. B. Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angewandte Chemie-International Edition, v. 40, n. 11, p. 2004-+, 2001. 3- KOLB, H.C.; SHARPLESS, K. B. Drug Discovery Today, 8, 1128 1137, 2003 4- Melo,J. O. F.; Donnici, C. L.; Augusti R.; Ferreira V.F.; de Souza M. C. B. V.; Ferreira M. L. G.; Cunha, A. C. Heterociclos 1,2,3-triazólicos: histórico, métodos de preparação, aplicações e atividades farmacológicas. Química Nova, v.29, São Paulo, 2006. 5- STOKES, J. B.; LIU, S.; DRIVER, T.G. Rh2(II)-Catalyzed Nitro Migration Reactions: Selective Synthesis of 3-Nitroindoles from β-nitro Styryl Azides. J. Am. Chem. Soc., p. 4702 4705, 2011. 6- KOMMAGALLA, Y.; CORNEA, S.; RIEHLE, R.; TORCHILIN, V.; DEGTEREV, A.; RAMANA, C.V. Med. Chem. Comm. v. 5, p. 1359-1363, 2014 7- http://www.abta.org/brain-tumor-information/types-of-tumors/glioblastoma.html? referrer=https://www.google.com.br/. Acessado em: 29 julho 2017. 8- Alejandro F. Barrero,* Enrique J. Alvarez-Manzaneda and Rachid Chahboun, Synthesis of Wiedendiol-A and Wiedendiol-B from Labdane Diterpenes, Received 5 February 1998; revised 10 March 1998; accepted 12 March 1998